氨基酸菌種擴大培養(yǎng)及菌種保藏技術(shù)

氨基酸菌種擴大培養(yǎng)及菌種保藏技術(shù)1工業(yè)微生物菌種的來源自然界中有目的微生物分離的原則菌種選育、分子育種工業(yè)微生物的要求常用工業(yè)微生物菌種保藏菌種來源誘變育種：誘變是工業(yè)發(fā)酵穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要保證；從自然界分離：目前土壤中已分離的微生物不到總數(shù)的1%，微生物的多樣性仍然是以后若干年的研究重點；

基因重組：基因定向改造技術(shù)大大加快了生物產(chǎn)品開發(fā)的進程。從自然界中分離菌種的一般過程采樣→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定

(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系

(2)對這一特定菌種的遺傳生化的認識程度

(3)經(jīng)濟費用如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)：如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。選擇育種方法時綜合考慮的因素一些常用工業(yè)微生物抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細菌植物或動物來源氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物食品工業(yè)微生物包括：釀造業(yè)，酶制劑等食品用的微生物需經(jīng)過嚴格的毒理試驗，目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌

能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強

遺傳性能要相對穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求工業(yè)微生物的要求工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)

(1)低溫冷凍保藏；(2)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?3)礦物油保藏；(4)土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。保藏原理：創(chuàng)造休眠環(huán)境保藏要求：保持菌種優(yōu)良特性，經(jīng)濟方便 保藏后需再次檢測和確定保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標(biāo))。冷凍保藏：-20℃以下冷凍，使微生物代謝活動停止分類：普通冷凍保藏(-20℃)

超低溫冷凍保藏(-60一-80℃)

液氮冷凍保藏凍干保藏特點：簡單有效培養(yǎng)物運輸較困難凍干保藏：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。特點：凍干狀態(tài)下一般可保藏10年不喪失活力凍干后的菌株可常溫保存，便于運輸必須使用冷凍保護劑，常用脫脂乳、蔗糖等在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。 超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2℃／min。一些細菌和真菌菌種可保藏5年而活力不受影響。傳代保藏：斜面培養(yǎng)基，平行傳代，普通冰箱，三個月以下保存，供試驗用礦物油保藏：將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏，簡便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別用于難以冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌載體保藏：麥殼，砂土滅菌后可用作載體防止菌種衰退衰退的表現(xiàn)：生長，代謝（產(chǎn)品）衰退的原因：保藏不妥，不利環(huán)境，回復(fù)突變等防止衰退的方法：合理培養(yǎng)條件，減少傳代次數(shù)復(fù)壯：分離單細胞，抗性篩選，苛刻條件種子：將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。2種子擴大培養(yǎng)種子擴培的目的接種量的需要菌種的馴化縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求生理狀況穩(wěn)定，個體與群體活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長無雜菌污染實驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此將其稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。培養(yǎng)基：保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，有利于菌體的生長減少傳代次數(shù)孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工廠歸發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。

培養(yǎng)基：控制成本，馴化；營養(yǎng)比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。種子擴培的兩個階段2.1工業(yè)微生物培養(yǎng)方法靜置培養(yǎng)法：嫌氣發(fā)酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等通氣培養(yǎng)法深層淺層固體液體液體固體工業(yè)微生物常見培養(yǎng)方法及其特點解釋特點適用范圍固體培養(yǎng)即曲法培養(yǎng)，源于傳統(tǒng)制曲技術(shù)酶活力高可調(diào)溫濕度釀造業(yè)液體深層培養(yǎng)液體培養(yǎng)，深層通風(fēng)可調(diào)節(jié)各種環(huán)境因素：營養(yǎng)物濃度，溫濕度等；無菌操作要求高幾乎所有好氣發(fā)酵：如有機酸、氨基酸等載體培養(yǎng)可重復(fù)使用的多孔材料，嚴格控制營養(yǎng)條件，結(jié)束后擠壓培養(yǎng)液抽提產(chǎn)物兼具固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法的優(yōu)點可培養(yǎng)霉菌、酵母、放線菌等兩步法液體深層培養(yǎng)將營養(yǎng)生長期與生產(chǎn)期分開，分別控制不同條件工藝可達到最優(yōu)過程繁瑣氨基酸生產(chǎn)2.2影響種子質(zhì)量的因素培養(yǎng)基秧齡與接種量溫度pH值通氣與攪拌泡沫染菌的控制種子罐級數(shù)種子的質(zhì)量要求：一定的濃度形態(tài)（生長處于某個階段、均勻等等）理化指標(biāo)：C、N、P的含量，pH，酶活等無污染2.3種子擴大培養(yǎng)舉例例一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備斜面菌種→一級種子培養(yǎng)→二級種子培養(yǎng)→發(fā)酵1、斜面(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5

瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細培養(yǎng)條件：32℃，生長18-24小時生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過

3次2.一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32℃培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米漿2.5%，

K2HPO40.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基3.二級種子(種子罐)培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%），

32℃培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml大小均勻，呈單個或八字排列PH7.0-7.2時結(jié)束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛二、青霉素生產(chǎn)的種子制備安培管→斜面孢子→大米孢子→一級種子→二級種子→發(fā)酵一、斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細培養(yǎng)條件：25℃、7天,注意濕度50%左右二、大米孢子培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當(dāng)（要求大米的白點?。┯欣阪咦拥纳L。培養(yǎng)條件：25℃、7天，控制濕度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106個孢子3、一級種子培養(yǎng)基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米漿目的：長菌體培養(yǎng)條件：27℃，40小時接種量：200億孢子/噸4、二級種子培養(yǎng)基：同上培養(yǎng)條件：27℃、10-14小時接種量：10%種子的質(zhì)量要求菌絲長稠呈絲狀、菌絲團很少，有中小空孢，處于Ⅲ—Ⅳ期青霉素發(fā)酵菌絲體的生長共分為6個期，1-4為年青期，4-6期合成青霉素的能力最強種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。接種量的確定

移入種子的體積接種量＝—————————

接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。發(fā)酵級數(shù)的確定一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有