高通量藥物篩選

高通量藥物篩選第1頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

高通量篩選最初是伴隨組合化學(xué)而產(chǎn)生的一種藥物篩選方式。

1990年末，組合化學(xué)的出現(xiàn)改變了人類獲取新化合物的方式，人們可以通過較少的步驟、在短時間內(nèi)同時合成大量化合物，在這樣的背景下高通量篩選的技術(shù)應(yīng)運而生。

高通量篩選技術(shù)可以在短時間內(nèi)對大量候選化合物完成篩選，經(jīng)過近十年的發(fā)展，已經(jīng)成為比較成熟的技術(shù)，不僅僅應(yīng)用于對組合化學(xué)庫的化合物篩選，還更多地應(yīng)用于對現(xiàn)有化合物庫的篩選。

目前世界各大藥物生產(chǎn)商都建立有自己的化合物庫和高通量篩選機構(gòu)，對有潛力形成藥物的化合物進行篦梳式的篩選。第2頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

我國藥物高通量篩選起步較晚，且不規(guī)范，僅有十多年的研究歷史。

1996年中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進國內(nèi)第一臺Bionek2000型實驗自動化工作站；

1998年又引進全國第一臺Topcount微量閃爍計數(shù)器，使放射配基實驗、放射免疫實驗等技術(shù)微量化、自動化。上海藥物研究所、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分別成立了藥物篩選專門機構(gòu)，開始從事大規(guī)模篩選工作。西安交通大學(xué)藥學(xué)院賀浪沖教授首創(chuàng)的細胞膜色譜（CMC）為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性、高特異性、高效率的篩選手段。CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結(jié)合反應(yīng)的研究，目前正在進行心血管化學(xué)合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分的尋找。今年將建立CMC自動化篩選體系，促進我國藥物高通量篩選技術(shù)的全面發(fā)展。第3頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

一、概念高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，以計算機對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，同一時間對數(shù)以千萬樣品檢測，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫支持整體運轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。第4頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四HTS是藥物快速、微量、靈敏、大規(guī)模篩選的新方法。采用分子、細胞水平的藥物篩選模型，可從大量的樣品中鑒別出對確定的分子靶點有相互作用的微量活性化合物。每年能處理成千萬個樣品，加速了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)進程。突破了傳統(tǒng)藥物篩選的模式，提高了新藥研發(fā)的效率。第5頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四高通量平行合成儀第6頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四液相芯片檢測儀第7頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四微孔過濾板第8頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四12通道藥物篩選儀第9頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四高通量平行合成儀第10頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四國家新藥篩選中心第11頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四二．高通量篩選的技術(shù)過程1、樣品庫2、初篩和復(fù)篩3、活性化合物4、深入篩選5、獲得少量先導(dǎo)化合物6、確證篩選藥物藥理學(xué)研究7、侯選藥物8、臨床前研究第12頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四1、HTS篩選的基本步驟第一步是選擇分子靶。選擇的依據(jù)是來源于國際醫(yī)學(xué)生物學(xué)的新成果。目前國際常用的分子靶有以下幾類：A、細胞膜受體；B、離子通道蛋白；C、酶蛋白；D、細胞核受體；E、轉(zhuǎn)運蛋白。第二步是建立穩(wěn)定表達分子靶的生物體系。靶是蛋白---克隆相對應(yīng)的蛋白，在大腸桿菌中表達和提純；靶是細胞受體---克隆出的基因轉(zhuǎn)化到載體細胞中，建立穩(wěn)定的細胞株。第13頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四第三步建立簡便快速的大規(guī)模的生物檢測方法。根據(jù)靶的不同分為兩類：

1、以蛋白等分子為基礎(chǔ)；

2、以細胞為基礎(chǔ)酶蛋白---測定酶活性的變化；細胞膜受體---測定配體-受體的結(jié)合；細胞核受體---測定蛋白的表達。在建立大規(guī)模生物檢測方法的同時，要用組合化合物的方法合成大量不同結(jié)構(gòu)的化合物庫相配套。第14頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四2、HTS藥物篩選靶點與檢測方法（1）、分子靶點篩選模型---細胞信號通路篩選系統(tǒng)外界信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞內(nèi)，或者直接穿過細胞膜進入到細胞質(zhì)和細胞核，最終影響某些基因的轉(zhuǎn)錄。在這個傳遞過程中，某些特殊的細胞或一些病理狀況下，可能是其中的一條或幾條通路起作用，藥物可以根據(jù)需要對這些通路進行阻斷。使用信號通路篩選系統(tǒng)，可直接對藥物作用的分子機制有所了解。第15頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四（2）、細胞膜表面受體篩選模型

a.G蛋白耦聯(lián)受體：受體與GTP結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的耦聯(lián)，在細胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP，從而將外界信號跨膜傳遞到細胞內(nèi)。如趨化因子受體、β-受體阻斷劑等。

b.催化受體：為單跨膜受體，分為胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。當(dāng)細胞因子與胞外區(qū)結(jié)合后，引起多個受體單體的聚合，每個聚合體的受體單體可以是同一類型，也可以不同。如EPO、G-CSF、GH受體2個同樣的單體；IL-1，GM-CSF，IL-6受體是2個不同的單體；TNF-α是3個同樣的單體；IL-2是3個不同的受體。

c.離子通道耦聯(lián)受體：細胞表面一些神經(jīng)遞質(zhì)的受體，自身是一些離子通道，或者與離子通道相耦聯(lián)。當(dāng)與配體結(jié)合時，受體構(gòu)象改變，通道開放，離子進出細胞，引起電興奮。第16頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四三.高通量篩選技術(shù)體系的組成1.化合物樣品庫化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個來源。其中,人工合成又有常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。第17頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

2.自動化的操作系統(tǒng)自動化操作系統(tǒng)利用計算機通過操作軟件控制整個實驗過程。操作軟件采用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了的圖示代表機器的動作。自動化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進行相應(yīng)的工作。第18頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

3.高靈敏度的檢測系統(tǒng)

檢測系統(tǒng)一般采用液閃計數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測計數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。第19頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

4.數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)

數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)承擔(dān)4個方面的功能:

樣品庫的管理功能;

生物活性信息的管理功能;

對高通量藥物篩選的服務(wù)功能;

藥物設(shè)計與藥物發(fā)現(xiàn)功能。

5、高特異體外篩選模型第20頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四四.高通量篩選模型常用的篩選模型都在分子水平和細胞水平，觀察的是藥物與分子靶點的相互作用，

能夠直接認識藥物的基本作用機制。第21頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

1.分子水平的藥物篩選模型:

(1).受體篩選模型:指受體與放射性配體結(jié)合模型。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測功能反應(yīng)、第二信使生成和標記配體與受體相互作用等不同類型。

(2)酶篩選模型:觀察藥物對酶活性的影響。根據(jù)酶的特點,底物,產(chǎn)物都可以作為檢測指標,并由此確定反應(yīng)速度。典型的酶篩選包括（1)適當(dāng)緩沖液中孵化;(2)控制反應(yīng)速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3)測量產(chǎn)物的增加和底物的減少。

(3)離子通道篩選模型:(1)貝類動物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結(jié)合位點，用放射性配體進行競爭性結(jié)合試驗考察受試樣品。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。第22頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四2.細胞水平藥物篩選模型觀察被篩樣品對細胞的作用。但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標,僅反映藥物對細胞生長等過程的綜合作用。包括:內(nèi)皮細胞激活;細胞凋亡;抗腫瘤活性;轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;細菌蛋白分泌;細菌生長。第23頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四高通量篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比有以下幾個優(yōu)點:反應(yīng)體積?。蛔詣踊?；靈敏快速檢測；高度特異性。但是，高通量篩選作為藥物篩選的方法,并不是一種萬能的手段，特別是在中藥研究方面，其局限性也是十分明顯的。第24頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四五、高通量藥物篩選原理

1．基本原理高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù)，以計算機對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。第25頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四（1）化合物樣品庫高通量篩選是一種利用已有的化合物進行的體外隨機篩選。因此通過高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物(leadingcompounds)的有效性取決于化合物樣品庫中化合物的數(shù)量及其質(zhì)量?；衔飿悠返臄?shù)量是指不同樣品的數(shù)量?；衔飿悠返馁|(zhì)量由化合物結(jié)構(gòu)的多樣性決定的。許多活性反應(yīng)基團(reactivegroups)使初篩的假陽性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫的質(zhì)量。第26頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個來源。人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國外制藥企業(yè)建立化合物樣品庫的主要來源。它們通過長年積累的化合物建立化合物樣品庫，通過購買和化合物交流使化合物樣品庫的數(shù)量和質(zhì)量大幅度提高。第27頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四組合化學(xué)(combinatorialchemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供另外一種來源。組合化學(xué)的基本原理是采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在特定的分子母核上加入不同的基團，在同樣條件下，產(chǎn)生大量的新化合物。這種方法在化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化方面已經(jīng)表現(xiàn)出強大的優(yōu)勢。但是，由于該方法是基于母核結(jié)構(gòu)的改造，因此產(chǎn)生的大量化合物在結(jié)構(gòu)多樣性方面尚有不足。解決組合化學(xué)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的問題，已經(jīng)成為化學(xué)研究人員的研究課題。第28頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

從天然產(chǎn)物中分離出來的化合物，母核結(jié)構(gòu)和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現(xiàn)出來的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢。因此，增加具結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫質(zhì)量的一個重要途徑?？鐕扑幤髽I(yè)為了增加高通量篩選的陽性率，已經(jīng)或正在尋求購買我國的天然產(chǎn)物單體。第29頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

(2)自動操作系統(tǒng)高通量藥物篩選每天要對數(shù)千化合物樣品進行檢測，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯。自動化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過條形碼加以標記。自動化操作系統(tǒng)通過光電閱讀器對特定的微孔板上的特定位置進行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計算機內(nèi)，使篩選結(jié)果準確，實驗過程快速。第30頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

除了實驗步驟的需要以外，自動化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用于對照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。96孔、384孔在酶活性檢測以及需同時開始、同時終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。

自動化操作系統(tǒng)的一個重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應(yīng)板以及對它們進行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。第31頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四由此可見，高通量藥物篩選的自動化操作系統(tǒng)由計算機及其操作軟件、自動化加樣設(shè)備、溫孵離心等設(shè)備、堆棧4個部分組成。不同的單位可根據(jù)篩選模型類型、篩選規(guī)模選購不同的部分整合成為一個完整的操作系統(tǒng)。第32頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

(3)檢測系統(tǒng)快速、高靈敏度的檢測技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。在高通量藥物篩選中，檢測系統(tǒng)一般采用液閃計數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測計數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。檢測儀器靈敏度的不斷提高，即使對微量樣品的檢測，也可以得到很好的檢測效果。第33頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

A.放射性檢測技術(shù)。美國學(xué)者GanieSM在高通量藥物篩選研究中，應(yīng)用放射性測定法，特別是親和閃爍（SPA）檢測方法，使在96孔板上進行的樣本量實驗得到發(fā)展。該方法靈敏度高，特異性強，促進了高通量藥物篩選的實現(xiàn)，但存在環(huán)境污染問題。第34頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

液閃計數(shù)放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測定、細胞毒性、細胞增殖實驗、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時間分辨偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技術(shù)，有效地降低了背景信號的干擾，使測定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測中，背景信號可控制在10cpm左右。第35頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四親和閃爍分析(scintil1ationproximityassay，SPA)是一種新的液閃分析法。在高通量篩選測定細胞表面受體親合結(jié)合作用時，放射配體標記濾過分析技術(shù)由于需要進行分離，現(xiàn)已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術(shù)通過親合結(jié)合，將放射性配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上，從而產(chǎn)生光子，減少了放射配體標記游離配基與結(jié)合配基的分離過程，使得放射配基分析可完全以自動化的方式進行，適于進行高通量篩選。產(chǎn)生低能量放射粒子的同位素可被用來進行放射性標記，而這種低能量放射粒子在短距離內(nèi)可被重吸收，以確保只有結(jié)合到受體表面的配基才被檢測到。

SPA技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到激酶、核酸處理、酶分析以及受體配體的相互作用分析中。第36頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

B.

光學(xué)測定技術(shù)。近年來，美、英兩國研究人員在高通量篩選檢測中，建立了大量的非同位素標記測定法，如用分光光度檢測法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活等，均獲得成功。第37頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

分光光度法為了適應(yīng)高通量藥物篩選，許多公司都生產(chǎn)了具備計算機接口并能對多孔板進行同時檢測的分光光度計。以MolecularDevice公司的spectra190為例，它采用8條光導(dǎo)纖維同時對8孔進行測定。測定波長以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進行選擇。對未知物質(zhì)，可在該范圍內(nèi)進行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出，可用隨機軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進行處理。方便、快速、準確、自動化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動化操作系統(tǒng)的連接，使得基于紫外、可見光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類。第38頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四C.化學(xué)發(fā)光檢測

化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下，化學(xué)能以光子的形式釋放出來?；瘜W(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。輝光型化學(xué)發(fā)光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)。其發(fā)光時間較長且穩(wěn)定。閃光型發(fā)光以發(fā)光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)，其發(fā)光時間較短。由于時間分辨及偶合回路技術(shù)的使用，對于背景的去除更為有效，使得化學(xué)發(fā)光的檢測靈敏度達到0.1pg數(shù)量級。在單孔多點噴射技術(shù)中，光導(dǎo)纖維末端帶有一噴頭，用來加入底物。反應(yīng)性底物從100個小孔噴出，使反應(yīng)性底物加入孔中后即可均勻混合。發(fā)光反應(yīng)同時啟動后，可立即進行測定，對于閃光性化學(xué)發(fā)光的測定更為有利。第39頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四D.

熒光檢測技術(shù)。美國學(xué)者GiulianokA，采用FLIPR熒光檢測法，可在短時間內(nèi)同時測定熒光的強度和變化，可測定細胞內(nèi)鈣離子流及測定細胞內(nèi)pH和細胞內(nèi)鈉離子流等。第40頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

激發(fā)熒光檢測是新型激發(fā)熒光檢測儀。用連續(xù)的激發(fā)光譜取代固定光譜。因為多數(shù)熒光基團都有短暫的半衰期，即使用較弱的激發(fā)光源也能獲得大量的光子流。這種特性以及多種可采用的熒光模式，使得熒光檢測技術(shù)成為高通量篩選必不可少的應(yīng)用手段。熒光技術(shù)在均相篩選分析中廣為應(yīng)用。其中，包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光偏振(FP)，時間分辨熒光(TRET)

熒光相關(guān)譜(FCS)等技術(shù)。第41頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四E、多功能微板檢測系統(tǒng)。由西安交通大學(xué)藥學(xué)院研制的1536孔板高通量多功能微板檢測系統(tǒng)，是目前國際上先進的高通量檢測系統(tǒng)，它可使篩選量進一步提高，現(xiàn)已在該院投入使用。第42頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

(4)數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)高通量藥物篩選的特點是對數(shù)以萬計的化合物樣品進行多模型的篩選。與高通量藥物篩選相適應(yīng)的數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)主要承擔(dān)4個方面的功能。第43頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四樣品庫的管理功能：化合物樣品庫對進行高通量藥物篩選的化合物樣品的各種理化性質(zhì)進行存儲管理。對每一個新入庫的化合物進行新穎性分析，排除結(jié)構(gòu)雷同的化合物，避免不必要的篩選。由于反應(yīng)性基團增加了假陽性出現(xiàn)的機率，樣品庫對新入庫的化合物進行反應(yīng)基團檢測以去除這類化合物。第44頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四生物活性信息的管理功能：生物活性庫存貯每一化合物都要經(jīng)過不同模型檢測，并根據(jù)多個模型的檢測結(jié)果對化合物的生物活性進行綜合評價。第45頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四對高通量藥物篩選的服務(wù)功能：高通量藥物篩選的工作量大，自動化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)對與藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來通訊、檔案管理以及各種樣品標簽的打印進行管理，使高通量藥物篩選的各個環(huán)節(jié)程序化、標準化。第46頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四藥物設(shè)計與藥物發(fā)現(xiàn)功能：高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的化合物結(jié)構(gòu)信息，隨著篩選的進行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)通過對同一模型不同的呈現(xiàn)陽性反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進行分析，找出其構(gòu)效關(guān)系，從而為藥物設(shè)計提供參考。第47頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

(5)篩選模型指用于檢測藥物作用的實驗方法。由于高通量篩選要求反應(yīng)總體積小，而且，反應(yīng)具有較高特異性和敏感性，因此對于篩選模型也要求較高，常用的篩選模型都在分子水平和細胞水平，觀察的是藥物與分子靶點的相互作用，能夠直接認識藥物的基本作用機制。目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細胞反應(yīng)方面。近年也出現(xiàn)了基因水平的藥物篩選模型，使藥物篩選模型的范圍更廣泛。第48頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四（一）分子水平的藥物高通量篩選模型

a.以酶為靶的高通量篩選

以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數(shù)是直接檢測酶活性。具體方法根據(jù)酶的不同而不同，主要有放射性的方法和比色、熒光的方法。第49頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

基于放射性的方法多是將底物標記，測定放射性產(chǎn)物的生成。

Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法。將含有酶的菌絲提取物、α-淀粉酶和UDP葡萄糖加入96孔板的孔中，溫孵、反應(yīng)。終止反應(yīng)后，濾去未被合成進入的底物。閃爍計數(shù)檢測濾器上保留的(1,3)β-葡聚糖，指示酶活性大小。

第50頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四也有將酶標記，測定被特異結(jié)合的酶的方法。

Vollmer等建立了一種以青霉素結(jié)合蛋白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉(zhuǎn)移酶又是肽轉(zhuǎn)移酶，該法是篩選其糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的活性位點上的可結(jié)合物。將莫諾霉素(moenomycin)結(jié)合于一種小球上，制成混懸液，加入96孔板，然后加入3Ｈ標記的PBP(細菌膜粗提物)和受試化合物，孵育、過濾去掉非結(jié)合的放射性，閃爍計數(shù)測得的放射性指示PBP與莫諾霉素結(jié)合的情況及受試化合物對其影響。第51頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

基于放射性而無需過濾分離的SPA也有應(yīng)用。

Brown等建立了內(nèi)源性肽酶的水解活性檢測方法，用以研究其抑制劑。用3Ｈ標記的肽底物，通過生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3Ｈ隨肽的斷裂而離開閃爍球。測定3Ｈ放射性作用于閃爍球產(chǎn)生的閃爍信號的丟失量，即指示酶活性大小。第52頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

基于比色、熒光等的方法有一些報道。

Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下，脂的過氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenolorange)，產(chǎn)物在可見光區(qū)620nm有強烈吸收。在96孔板上測定。

Zhang等建立了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(抗病毒藥物)的高通量篩選方法。該方法基于逆轉(zhuǎn)錄酶能很容易地將核苷酸類似物(如生物素--dUTP)引入新生DNA鏈。在96或384孔板上，將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素在板孔中混合孵育，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動反應(yīng)。反應(yīng)60min后，加入親和素-別藻藍蛋白孵育，用HTRF分析儀讀取數(shù)據(jù)。該法也可用于多種其他的核酸聚合酶。第53頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

b.以受體為靶的高通量篩選

以受體為作用靶的高通量篩選法，包括檢測功能反應(yīng)、第二信使生成和標記配體與受體相互作用等不同類型。優(yōu)點是易于區(qū)分激動劑和拮抗劑。

經(jīng)典的功能檢測方法通量低，而引入基于重組技術(shù)的報告基因檢測方法極大地提高了篩選通量，既高效且節(jié)省成本。檢測第二信使或下游機制如磷酸化，傳統(tǒng)方法也比較麻煩，不適于高通量檢測，但將這些機制與報告基因相偶聯(lián)則能克服。第54頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

c.以離子通道為靶的高通量篩選

Negri等建立了貝類動物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結(jié)合位點，用放射性配體(3H-STX)進行競爭性結(jié)合試驗考察受試樣品。

Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。第55頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四d.以核酸為靶的高通量篩選

Hamasaki等建立了以16SrRNA編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和HIV-RRERNA結(jié)構(gòu)為靶的抑制劑的高通量篩選方法。尋找類似氨基糖甙類抗生素而親和力更高或作用于相同核酸的其他位點的新化合物，以及不易被代謝失活的新化合物。方法基于當(dāng)含芘的氨基甙類似物結(jié)合于RNA時，芘的熒光被淬滅的原理。在96孔板上，將芘碳酰巴龍霉素(PCP)，RNA配成溶液后加入有受試化合物的板孔中，用熒光讀板器考察熒光恢復(fù)的程度。第56頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四（二）細胞水平的藥物高通量篩選模型

1、選擇蛋白(selectins)

選擇蛋白是膜整合糖蛋白的一個家族，它能夠識別從另外一個細胞表面伸展出來的特異的糖基團，并與之特異性結(jié)合，因此它也是細胞表面受體。選擇蛋白有一個小的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，一個單次跨膜的結(jié)構(gòu)域，一個大的細胞外片段，在這個片段上可分為幾個結(jié)構(gòu)域，包括最外端的具有凝集素作用的結(jié)構(gòu)域。第57頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

第58頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

已知有三種類型的選擇蛋白∶

E-選擇蛋白，它在內(nèi)皮細胞表達；

P-選擇蛋白，在血小板和內(nèi)皮細胞表達；

L-選擇蛋白，在各種類型的白細胞中表達。這三種選擇蛋白都是識別小的出現(xiàn)在某些糖蛋白或糖脂的四糖基團，選擇蛋白同糖配體的結(jié)合是Ca2+依賴性的。選擇蛋白主要介導(dǎo)循環(huán)中的白細胞在有炎癥和血塊的血管壁部位暫時性相互作用。與選擇蛋白起作用的靶細胞上的蛋白通常稱為粘蛋白(mucin)。第59頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四2.

ELISA2.1.

ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。第60頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四2.2

ELISA的類型

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：第61頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四（1）間接法測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。原理為利用酶標記的抗抗體，檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。常用于臨床血清中自身抗體的檢測，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。第62頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四(2)雙抗體夾心法測抗原

是檢測抗原最常用的方法。

只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。

用途：測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

雙抗體夾心法測抗原的方法：

捕獲抗體包被→封閉（3％BSA）→待測抗原→洗滌（含0.1％Tween的PBS)→酶標單抗或多抗→洗滌→顯色→檢測

第63頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四(3)競爭法測抗原

1）抗體固相測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。

原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。

方法：抗體包被→封閉→同時加入待測抗原和酶標抗原→洗滌→酶底物→顯色→檢測

2）抗原固相測抗原

原理是標本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競爭結(jié)合。標本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。

方法:

a:抗原包被96孔板；

b:封閉;c:待測抗原與抗體反應(yīng)一定時間；

d:加入96孔板e:洗滌

f：加入酶標二抗

g：洗滌

h：顯色和檢測

第64頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四第65頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四第66頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四第67頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四（二）細胞水平的藥物高通量篩選模型

a.內(nèi)皮細胞激活內(nèi)皮細胞激活是急慢性炎癥過程中重要環(huán)節(jié)。Rice等以Ｅ選擇蛋白在細胞表面的表達作為標志，建立了內(nèi)皮細胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。IL-1刺激下，Ｅ選擇蛋白在內(nèi)皮細胞表面的表達用ELISA方法定量。方法包括細胞固定、加液、加受試化合物等操作，能保持細胞完整，不昂貴，可重復(fù)，篩選速度可達每星期1000種化合物。能夠較早地發(fā)現(xiàn)細胞對化合物的攝取及化合物的細胞毒性。第68頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

b.細胞凋亡

Erusalimsky等建立。細胞預(yù)先用3Ｈ胸苷標記，與凋亡誘導(dǎo)物孵育后，連續(xù)經(jīng)過兩種玻璃濾器。一個是中性的，捕獲完整的染色質(zhì)和高分子量ＤＮＡ。另一個裝有DEAE活性基團，捕獲低分子量DNA碎片。通過對濾器上放射性的測量，可以對DNA的破碎情況定量。

第69頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四c.抗腫瘤活性

Lu等建立“生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法，考察受試分子(類維生素Ａ及類維生素Ａ相關(guān)分子)對許多不同細胞系的效應(yīng)特點。檢測指標包括：

(1)肺癌細胞生長抑制檢測。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來源。細胞暴露于受試化合物5ｄ后，用標準比色法測定存活細胞百分率。20%生長抑制率指示有活性。

(2)集落形成抑制檢測，用以區(qū)分細胞生長抑制作用和細胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292肺癌細胞，暴露于受試物一定時間。然后對細胞進行清洗，植于無受試物的培養(yǎng)介質(zhì)共7d。用結(jié)晶紫對細胞染色，考察集落形成情況。

(3)凋亡檢測，用ELISA方法測量細胞DNA破碎。

(4)轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測，用以考察受試化合物是否有類維生素Ａ受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用。方法是將HeLaTK-細胞用73Col-CAT報告基因連同受體的表達載體轉(zhuǎn)染，與受試物一起培養(yǎng)，用ELISA方法檢測CAT活性。第70頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

d.G2檢查點(G2checkpoint)Roberge等建立了G2期檢查點抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7mp53細胞培養(yǎng)，種在96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上。照射使細胞進入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進入Ｍ期的細胞數(shù)量，即抑制G2檢查點程度。細胞周期分為四個階段：即G1期(DNA合成前期)、s期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)。G0期細胞也稱休眠細胞。

第71頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四e.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構(gòu)建融合報告基因，轉(zhuǎn)染細胞，選擇蟲熒光素酶表達能被TGFβ高誘導(dǎo)的克隆。將細胞植于96孔板，與受試化合物孵育后，稀釋并加入Steady-Glo底物測蟲熒光素酶活力，與對照比較，計算相對酶活性增加值。第72頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

f.細菌蛋白分泌

Alksne等建立了以抑制細菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報告基因。SecA是一種自我調(diào)控翻譯的蛋白，當(dāng)細菌蛋白分泌被干擾時，該報告基因被誘導(dǎo)。

第73頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四g.細菌生長

Chung等建立了抑制分枝桿菌生長化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結(jié)核分枝桿菌，因其具有生長迅速以及非感染性的特點。通過測定細胞攝入放射性標記的尿嘧啶，考察受試化合物對分枝桿菌活力的作用。第74頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

2．生藥活性成分的高通量篩選

樣品庫來源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。從天然產(chǎn)物分離出來的化合物，其母核結(jié)構(gòu)和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現(xiàn)出來的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢。

第75頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

我國擁有非常豐富的藥材資源。僅僅依靠傳統(tǒng)的藥理實驗方法篩選，既耗時，勞動強度又大，還需要使用大量實驗動物，顯然不能適應(yīng)大量樣品的同時篩選。使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費。將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于生藥的活性成分研究，既是對高通量篩選技術(shù)的不斷完善，又是將這一技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究的有益嘗試。如何對生藥的活性成分進行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區(qū)別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來并進行適當(dāng)?shù)姆蛛x和化學(xué)多樣性的評價。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評價的問題。第76頁，共85頁，2023年，2月20日，星期四

(1)提取

由于高通量篩選需要大量的樣品來源，常規(guī)的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個快速、高效、連續(xù)、自動化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一個新的提取技術(shù)，在準備好樣品和對提取方法（或程序）進行設(shè)定后，自動進樣和自動收集裝置就可以連續(xù)