成年大鼠心肌細(xì)胞高效激光共聚焦顯微鏡鈣成像方法

成年大鼠心肌細(xì)胞高效激光共聚焦顯微鏡鈣成像方法趙永星;隗和明;盧君;張廣欽【摘要】目的建立高效易行的測(cè)定心肌細(xì)胞鈣成像方法.方法Langendorff灌流獲取成年大鼠心室肌細(xì)胞.大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)Fluo-4染色后分別加入玻璃底的6孔培養(yǎng)板中，連接IonC-PaceEP刺激器，于激光共聚焦顯微鏡下測(cè)定胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化.結(jié)果約80%的細(xì)胞跟隨所設(shè)頻率規(guī)律的收縮.激光共聚焦顯微鏡記錄到與刺激器頻率相同的有規(guī)則的細(xì)胞鈣瞬變.加入咖啡因后鈣釋放增加，提示此為鈣庫的鈣釋放結(jié)論利用新型的刺激裝置，結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)，我們成功地獲得了高效易行的成年大鼠心肌細(xì)胞Ca2+成像方法.此法也可用于其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌細(xì)胞易于記錄細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化.【期刊名稱】《中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用》【年(卷)，期】2013(007)008【總頁數(shù)】3頁(P5-7)【關(guān)鍵詞】大鼠;心肌細(xì)胞;C-PaceEP刺激器;Ca2+成像;激光共聚焦顯微鏡【作者】趙永星;隗和明;盧君;張廣欽【作者單位】210009,中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥理教研室【正文語種】中文心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)控(Calciumhandling)對(duì)于維持心臟和心肌細(xì)胞的正常生理功能有著重要作用。鈣調(diào)控失常見諸于幾乎所有的先天和后天的人類心臟病變，如心臟衰竭，心肌肥厚等［1］。鈣成像(Calciumimaging)是目前最為有效的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控的技術(shù)，鈣離子熒光指示劑(Fluorescencecalciumindicators)如Fluo-4AM可以隨Ca2+離子的結(jié)合而改變其熒光特性。激光共聚焦顯微技術(shù)(Laserconfocalmicroscopy)以其高分辨的優(yōu)勢(shì)，可以提供更好的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像，包括鈣瞬變和鈣火花［2］。在成年動(dòng)物的心室細(xì)胞中，為了觀察細(xì)胞鈣釋放特征，我們常用刺激誘發(fā)心肌細(xì)胞的鈣釋放。然而，使用傳統(tǒng)的刺激器［3］(如YSD-4GA型生理實(shí)驗(yàn)多用儀)誘發(fā)心肌細(xì)胞搏動(dòng)時(shí)，需在培養(yǎng)皿兩端中放置正負(fù)兩電極于心肌細(xì)胞兩端(圖1),但在操作時(shí)電極之間的距離不穩(wěn)定，影響細(xì)胞收縮的刺激閾電壓。我們實(shí)驗(yàn)室采用多孔板內(nèi)置入板狀電極構(gòu)成場(chǎng)刺激的原理，利用C-Pace刺激器成功地誘發(fā)多個(gè)成年大鼠的心室肌細(xì)胞同步搏動(dòng)，從而建立穩(wěn)定的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)態(tài)變化的方法。圖1YSD-4GA型生理實(shí)驗(yàn)多用儀1材料與方法1.1儀器和溶液的配制儀器IonC-PaceEP刺激器(IonOptixcorporation,USA)。玻璃底6孔板(MatTeKCorporation,USA)，激光共聚焦顯微鏡(CarlZeissLSM-710,Germany)試劑:膠原酶H(CollegaseH)購(gòu)自WorthingtonBiochemical公司(USA);HEPES,Glucose,EGTA，?；撬岷蚅-谷氨酸等試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。無鈣臺(tái)式液(mmol/L):NaCl137,KCl5.4,MgCl2.6H2O1,NaH2PO40.33葡萄糖10,HEPES10，用NaOH調(diào)pH至7.40。KB液(mmol/L):KCl40,KH2PO420,MgCl2.6H2O3,L-谷氨酸50，?；撬?0,HEPES10,KOH80，葡萄糖10,EGTA0.5，用KOH調(diào)pH至7.40。正常臺(tái)式液(mmol/L):無鈣臺(tái)式液中加1mmol/LCaCl2，溶液均用純氧飽和。1.2急性心肌單細(xì)胞的分離成年SD大鼠，雌雄不拘，體重200~300g。由SingHealthExperimentalMedicalCentre(SEMC，新加坡)提供。利用改進(jìn)的Langendoff灌流法［4］分離單個(gè)成年大鼠心室肌細(xì)胞。大鼠腹腔麻醉，迅速開胸取心臟，主動(dòng)脈插管逆向灌流，先以無鈣臺(tái)式液清洗殘留的血液，再灌流含有0.3mg/ml膠原酶H,1mg/ml牛血清白蛋白和1mg/ml?；撬岬臒o鈣臺(tái)式液繼續(xù)灌流約30min后，將心臟組織放入KB液中剪碎吹打，細(xì)胞懸液用200目濾網(wǎng)過濾，分離的心肌細(xì)胞KB液中保存2h后，經(jīng)臺(tái)氏液梯度復(fù)鈣至1mmol/L。1.3刺激器的連接及使用C-PaceEP刺激器由三部分組成:8通道刺激器（圖2A）,導(dǎo)線和與多孔板匹配的固定板型電極板（圖2B）。該系統(tǒng)是具備諸多優(yōu)點(diǎn):①它有8個(gè)通道，經(jīng)板上固定電極與玻璃六孔板（四孔板，八孔板皆可）連接（圖2C）,可以允許同時(shí)刺激8個(gè)多孔板。②輸出電壓的范圍達(dá)到正負(fù)40V，頻率范圍在0.01到99Hz之間，脈沖時(shí)間范圍在4ms到24ms，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置所需參數(shù)。③支持?jǐn)?shù)字輸入和輸出。④刺激輸出端有短路保護(hù)，能承受長(zhǎng)時(shí)間的短路。⑤刺激器通過導(dǎo)線與電極板和玻璃板相連（圖2D）,可以允許培養(yǎng)室門關(guān)閉，有利于細(xì)胞培養(yǎng)，保持細(xì)胞處于良好狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)所用刺激器的參數(shù)設(shè)置為：10mV,1Hz,2Hz。圖2C-PaceEP刺激裝置A:C-PaceEP刺激器;B:板型電極;C:玻璃底六孔板;D:刺激器工作連接圖1.4激光共聚焦掃描顯微鏡鈣成像細(xì)胞在室溫下以6四/ml的Fluo-4［5］熒光探針染色約15min，然后將細(xì)胞置于每孔含3ml正常臺(tái)式液的6孔板中，為使細(xì)胞更好的貼壁，玻璃底部提前用Laminin（1pg/cm2）處理半個(gè)小時(shí)。選擇適合的心肌細(xì)胞（細(xì)胞橫紋清晰呈現(xiàn)桿狀，表面干凈）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將板型電極放入六孔板中并與刺激器連接。然后把六孔板置于CarlZeissLSM-710型激光共聚焦顯微鏡上，物鏡為40倍油鏡，數(shù)值孔徑為1.3nA，激發(fā)光為功率25mW的488nm的氬激光，大于505nm波長(zhǎng)收集發(fā)射光，共掃描1000條線，每條線包含512個(gè)像素，掃描速度為每條線3ms。圖像以線掃描方式（X-T）進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20°C~25°C。2結(jié)果2.1大鼠心肌細(xì)胞的分離通過對(duì)裝置的改良，以及適當(dāng)?shù)卣莆盏南瘯r(shí)間和消化溫度，成功的分離出適合做激光共聚焦顯微鏡的單個(gè)大鼠心室心肌細(xì)胞。復(fù)鈣后細(xì)胞成活率70%左右，鏡下觀察，靜息狀態(tài)細(xì)胞呈桿狀、橫紋清晰、遮光性強(qiáng)、細(xì)胞無明顯自發(fā)性收縮（圖3）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，該方法分離出的心肌細(xì)胞能夠滿足多種實(shí)驗(yàn)的需求。圖3分離的單個(gè)心肌細(xì)胞2.2心肌細(xì)胞鈣瞬變的激光共聚焦線掃描在靜息狀態(tài)下心肌細(xì)胞很少收縮，但少數(shù)細(xì)胞有時(shí)會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性收縮，產(chǎn)生不規(guī)則的鈣波（圖4A）。當(dāng)使用刺激時(shí)，隨著電壓的增加，細(xì)胞開始出現(xiàn)收縮，隨頻率出現(xiàn)明顯的鈣瞬變。參數(shù)為1Hz時(shí)，圖4B和4C分別是當(dāng)頻率為1Hz和2Hz時(shí)心肌細(xì)胞隨頻率變化的鈣瞬變圖像。當(dāng)加入咖啡因（10mM），鈣瞬變強(qiáng)度快速明顯增加，顯示鈣庫中的鈣釋放（圖4D）。我們可通過分析鈣瞬變的熒光強(qiáng)度測(cè)量鈣釋放的量。圖4鈣掃描原始圖氏心肌細(xì)胞自發(fā)性鈣波;B:刺激頻率為1Hz時(shí)的鈣瞬變;C:刺激頻率為2Hz時(shí)的鈣瞬變；D:應(yīng)用10mM咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變，箭頭方向3討論心肌興奮-收縮耦聯(lián)是從心肌細(xì)胞電興奮到收縮的一個(gè)過程。在這個(gè)過程中Ca2+不僅參與心肌電興奮活動(dòng)，而且直接與肌絲蛋白結(jié)合引起心肌收縮［6］。在疾病狀態(tài)下，如心肌肥厚，心肌衰竭等，心肌的鈣釋放異常，心肌興奮-收縮耦聯(lián)發(fā)生障礙，導(dǎo)致心功能下降［7］。因此，我們通過對(duì)心肌細(xì)胞鈣釋放特征的研究，從而探討疾病的發(fā)生機(jī)制。在以往的心肌細(xì)胞鈣信號(hào)研究中，刺激電極往往都是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要通過自己加工制作，所用材料，電極直徑，電極之間的距離不同，使每次實(shí)驗(yàn)時(shí)誘發(fā)鈣釋放的電壓，心肌收縮幅度有較大的差異，其結(jié)果的重復(fù)性帶來較大的誤差。C-PaceEP刺激器正在被廣泛地應(yīng)用[8],相比傳統(tǒng)刺激器，該刺激器輸出通道多，輸出電壓和脈沖時(shí)間的范圍大，輸出端有極好的短路保護(hù)，刺激電極是固化在面板上。其次，C-PaceEP刺激器操作方便，穩(wěn)定性高，不依賴正負(fù)電極導(dǎo)線，可固定裝置在CarlZeissLCM710等高端顯微鏡平臺(tái)，使每次分離的心肌細(xì)胞測(cè)定誤差較小。最后，基于C-PaceEP刺激器的Ca2+成像法可以在短時(shí)間內(nèi)完成多細(xì)胞，多實(shí)驗(yàn)組以及不同藥物的鈣瞬變記錄。本次實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用C-PaceEP刺激器能夠記錄到較好的鈣瞬變圖像，并觀察在一個(gè)6孔板中測(cè)定的鈣瞬變的刺激參數(shù)等，其結(jié)果顯示較小的誤差。雖然此方法克服了每次實(shí)驗(yàn)參數(shù)和結(jié)果出現(xiàn)的誤差，但是應(yīng)用C-PaceEP刺激器進(jìn)行鈣掃描也有不足之處，我們發(fā)現(xiàn)C-PaceEP刺激器的設(shè)計(jì)缺陷對(duì)鈣成像造成不便，因電極板在多孔板上面，加大了給藥的距離，給藥時(shí)容易引起細(xì)胞外液的波動(dòng)，使細(xì)胞貼壁狀態(tài)不夠好，偶爾會(huì)造成焦距的飄移，從而干擾實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)以激光共聚焦顯微鏡作為測(cè)量手段，配以新型的IonC-PaceEP刺激器作為輔助工具，易于操作且穩(wěn)定，重復(fù)性高，能滿足獲得穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的需要。本實(shí)驗(yàn)方法的建立為各種動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)態(tài)變化的測(cè)量提供了技術(shù)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]KhoC,LeeA,HajjarRJ.Alteredsarcoplasmicreticulumcalciumcycling-targetsforheartfailuretherapy.NatRevCardiol,2012,9(12):717-733.[2]ZhangGQ,WeiH,LuJ,etal.Identificationandcharacterizationofcalciumsparksincardiomyocytesderivedfromhumaninducedpluripotentstemcells.PLoSOne,2013,8(2):e55266.[3]王黎敏，祁金順，李文朝.YSD-4型藥理生理實(shí)驗(yàn)多用儀波寬、延時(shí)的改進(jìn).長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997,11(1):78-79.[4]HoshinoS,Omatsu-KanbeM,NakagawaM,etal.PostnataldevelopmentaldeclineinIK1inmouseventricularmyocytesisolatedbytheLangendorffperfusionmethod:comparisonwiththechunkmethod.PflugersArch,2012,463(5):649-668.[5]ChengH,LedererWJ,CannellMB.Calciumsparks:elementaryeventsunderlyingexcitation-contractioncouplinginheartmuscle.Science,1993,262(5134):740-744.[6]BersDM.Cardiacexcitation-contractioncoupling.Nature,2002,415(6868):198-205.[7]BingOH,BrooksWW,ConradCH,etal.Intracellularcalciumtransientsinmyocardiumfromspontaneouslyhypertens