月第4周基因工程

基因工程基因工程的概念基因工程的別名基因拼接技術或DNA重組技術操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程結果

基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。DNA重組技術或基因拼接技術生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導入→表達符合人類需要的基因產(chǎn)物基因工程培育抗蟲棉簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關鍵步驟是什么？導入重組DNA關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接關鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細胞

分子手術刀：核酸限制性內(nèi)切酶（限制酶）

分子縫合針：DNA連接酶

分子運輸車：載體識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。1、主要來源：

2、種類和命名：

3、作用：

4、結果：一、“分子手術刀”

—限制性核酸內(nèi)切酶形成兩種末端粘性末端平末端原核生物特點：專一性一種限制酶只能識別一種特定核苷酸序列，并在特定的位點切割

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback識別序列的特點：中軸線兩側的堿基反向?qū)ΨQ重復排列切割的位點：G、A之間斷裂的化學鍵是：磷酸二酯鍵SmaⅠ平末端平末端1、種類：2、作用部位：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯鍵DNA連接酶連接黏性（平）末端，可形成重組的DNA分子二、“分子縫合針”

—DNA連接酶

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶要想使兩個不同的DNA分子重組，必須用同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶3、兩種連接酶的區(qū)別：DNA連接酶與DNA聚合酶比較DNA聚合酶DNA連接酶相同不同作用對象模板形成磷酸二酯鍵單個脫氧核苷酸DNA片斷需要不需要三、基因的載體——“分子運輸車”載體必須具備的條件：

1、能夠在宿主細胞中復制并穩(wěn)定地保存；

2、具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接；

3、具有某些標記基因，便于進行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應的基因等）

4、對受體細胞無害載體的作用：

1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞中去。

2、利用運載體在受體細胞內(nèi)，對外源基因進行大量復制。常用的載體有：

質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動植物病毒等常用的載體：質(zhì)粒能復制并帶著插入的目的基因一起復制有切割位點有標記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別都是在天然質(zhì)粒的基礎上進行過人工改造的

為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。

目的基因主要是指_____________________，

也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。編碼蛋白質(zhì)的結構基因供體生物細胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細菌)、人胰島素基因等。步驟一:目的基因的獲取原核細胞的基因結構原核細胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導有關蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不能指導有關蛋白質(zhì)的合成，但有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，如啟動子、終止子等真核細胞的基因結構真核細胞基因編碼區(qū)（間隔、不連續(xù)）外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟動子、終止子1）從基因文庫中獲取目的基因2）利用PCR技術擴增目的基因3）人工合成（DNA合成儀）

種類：基因組文庫：部分基因文庫（如cDNA文庫）：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因根據(jù)基因的有關信息，如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA等可以從基因文庫中得到所需的目的基因。獲得目的基因的方法適合基因比較小，且核苷酸序列已知原理、過程、條件、擴增形式1）從基因文庫中獲取目的基因1）從基因文庫中獲取目的基因基因組DNA文庫基因組DNA文庫cDNA文庫鳥槍法人工合成以原核生物為主真核生物cDNA文庫和基因組文庫對比目的性強比較盲目工作量相對小大PCR技術—多聚酶鏈式反應

原理：前提：原料：PCR擴增儀DNA雙鏈復制已知目的基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的兩條鏈為模板變性（90--95℃）復性延伸1.變性：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2.復性：引物與單鏈互補結合；3.延伸：合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。55

55（55--60℃）（70--75℃）指數(shù)形式擴增1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！?/p>

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同步驟二:基因表達載體的構建●目的基因●啟動子在基因的首端，它是RNA聚合酶的識別和結合的部位●終止子在基因的尾端●標記基因便于篩選檢驗基因表達載體的組成：目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。使目的基因進入受體細胞，并在其中維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。步驟三:將目的基因?qū)胧荏w細胞導入方法植物細胞動物細胞微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(最常用)基因槍法花粉管通道法—顯微注射法—感受態(tài)細胞吸收DNA分子農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。

Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移并整合到受體細胞的染色體DNA上1.微生物作受體細胞原因：將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.轉(zhuǎn)化方法：大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少

處理細胞→

細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→_________細胞吸收DNA分子。Ca2+感