蛋白質(zhì)定量分析

蛋白質(zhì)定量分析第1頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四定性分析定量分析有沒有是不是有多少第2頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四內(nèi)容BCA法測定蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)定量分析的方法操作注意事項思考討論第3頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

BCA法測定蛋白質(zhì)含量

2.掌握分光光度計的使用。實驗?zāi)康?.掌握BCA法測定血清蛋白質(zhì)濃度的原理。第4頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四BCA分子式BCA試劑盒實驗原理

BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）第5頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四實驗原理紫藍(lán)色562nm第6頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四實驗步驟（一）實驗材料

1、器材721型分光光度計、恒溫水浴箱、移液管、試管

2、試劑（1）試劑A:含1%BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、0.95%碳酸氫鈉，將上述液體混合后調(diào)pH至11.25。（2）試劑B：4%硫酸銅。（3）BCA工作液：試劑A100mL+試劑B2mL，混合。（4）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于

100mL蒸餾水中，即為1.5mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。（5）待測樣品。第7頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

表1BCA法測定蛋白質(zhì)含量

管號試劑（mL）

空白管

1

2

3

4

5

測定管

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（0.3mg/ml）

—

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

—

蒸餾水

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

—

—

待測樣品

—

—

—

—

—

—

0.5

BCA工作液

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

蛋白質(zhì)含量g

30

60

90

120

150

數(shù)據(jù)有改動ug第8頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四1、將上述各管混勻后于37°C保溫30分鐘，用562nm波長比色測定吸光度值。2、以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、用測定管光吸收值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量M，再計算出待測血清中蛋白質(zhì)濃度（g/L)。 （二）實驗操作C=MV——×250第9頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四蛋白質(zhì)定量分析的方法紫外線吸收法改良微量凱式定氮法雙縮脲法

Folin-酚試劑法考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法

BCA法280nm16%第10頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四方法靈敏度時間原理干擾物紫外線吸收法較低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凱氏定氮低費(fèi)時將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮雙縮脲法低中速肽鍵和堿性Cu2＋形成紫色絡(luò)合物硫酸銨；Tris緩沖液某些氨基酸Lowry法高費(fèi)時雙縮脲反應(yīng)；酚試劑被還原甘氨酸硫醇考馬斯亮藍(lán)法高快速G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合物在595nm的光吸值強(qiáng)堿性緩沖液TritonX-100;SDSBCA法最高較快肽鍵和堿性Cu2＋形成紫色絡(luò)合物不受去污劑、尿素等的影響第11頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

BCA法的特點

1、操作簡便，快速2、準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好

3、抗試劑干擾能力較強(qiáng)4、經(jīng)濟(jì)實用第12頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四注意事項1、實驗分組2、準(zhǔn)確量取試劑，吸管殘余液體要吹出。3、平行加樣，物歸原位。4、正確使用分光光度計，比色杯不潤洗。5、正確繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)注名稱、姓名、儀器型號、作圖時間。6、實驗結(jié)果書寫規(guī)范，三線表。第13頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四可見光分光光度計的操作步驟：1）預(yù)熱儀器。2）選定波長。3）固定靈敏度檔。一般固定在“1”檔。4）調(diào)節(jié)“0”點。5）調(diào)節(jié)T=100％。6）測定。7）關(guān)機(jī)。（重復(fù)2-3次）第14頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四表1BCA法測定蛋白質(zhì)含量管號空白管12345測定管M（ug）306090120150？吸光值儀器型號：721/722型波長=562nm第15頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四思考討論1、蛋白質(zhì)定量分析的多種方法中，哪種方法更適合測定血清蛋白的濃度，說出你的理由？2、實驗設(shè)計及實驗操作過程中，有沒有可改進(jìn)的方法，如果有請說出你的想法？第16頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

下次實驗：血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

預(yù)習(xí)要點：1、復(fù)習(xí)蛋白質(zhì)兩性解離。2、預(yù)習(xí)電泳的基本原理。3、請簡要寫出操作流程圖。4、請寫出計算公式。第17頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四第18頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

一、蛋白質(zhì)的相關(guān)理論知識16%蛋白質(zhì)的平均含氮量樣品中蛋白質(zhì)的含量=樣品中氮含量÷16%（或×6.25）凱氏定氮法1、元素組成第19頁，共21頁，2023年，2月20日，星期四

2、蛋白質(zhì)的紫外吸收280nm蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外線吸收法共軛雙鍵第20頁，共21頁，2023年，