重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)第八章只做最高性價比

原核表達(dá)概總

2018

原核表達(dá)——載原核表達(dá)— 蛋原核表達(dá)——原核表達(dá)——實(shí)例演酵母表達(dá)系統(tǒng)概昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概第八

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概哺乳動物細(xì)胞表達(dá)——細(xì)胞哺乳動物細(xì)胞表達(dá)——表達(dá)載哺乳動物細(xì)胞表達(dá)— 轉(zhuǎn)入方高效表達(dá)外源蛋白的

2018哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)簡

2018 與其他系統(tǒng)相比,哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊,提供復(fù)雜的型糖基化和準(zhǔn)確的型糖基化等多種翻譯后加工功能,因而,表達(dá)產(chǎn)物在分在過的幾十 , 利哺乳物細(xì)表達(dá)統(tǒng)高表達(dá)組蛋的研取得了令人目的。前, 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅己經(jīng)成為多種 工程藥生產(chǎn)而且在新 能的現(xiàn)、白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能究中起了為重要的作用。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)研究現(xiàn)

2018哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺

2018++-++++++++-+++-+++--++

2018

2018BHK-21

CHO-K1

2018C123

MDCK

2018Namalwa

2018 COS 獲得3個細(xì)胞系:COS-1，-3和-7。它們被廣泛用于瞬時表達(dá)系統(tǒng)。原因是：1，COS

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2018有多種細(xì)胞可供選擇 有一 資助的專門提供細(xì)胞的機(jī)構(gòu)ATCC（AmericanTissueCellCollection）（一）常用于穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)來源于小鼠的L-細(xì)胞、Ltk-細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞，都是極為常用的用于研究功能的細(xì)胞系。小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2／0和NSO等來自于分泌型細(xì)胞，并且可在無培養(yǎng)基中生長，因而非常適合

2018二）常用于瞬時表達(dá)的細(xì)被導(dǎo)人外 ，并進(jìn)行瞬時表達(dá) 洲綠猴細(xì)胞株CV－l。在這些細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染含SV40起始子的質(zhì)粒后，SV40起始子與SV40T一抗原的結(jié)合可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在外大量。HEK293（humanembryonickidney293）是一種來自于轉(zhuǎn)化有5型人類腺DNA的人胚胎腎臟細(xì)胞的細(xì)胞株，后者含有腺E1A，可激活帶CMV啟動子

2018（三）哺乳動物細(xì)胞的選 由是研 表達(dá)在此研究中，細(xì)胞的選擇是非常關(guān)鍵的。如，β－globin基在Hela細(xì)胞中可以低水平表達(dá)但不可被誘導(dǎo)，但在MEL細(xì)胞分化過程中可以被誘導(dǎo) ，MEL細(xì)胞應(yīng)該被選擇用來研究其誘導(dǎo)機(jī)制。因此，應(yīng)將 導(dǎo)人適合研究的細(xì)胞而不單是易于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。如，CHO細(xì)胞常用于生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)；而對于瞬時轉(zhuǎn)染，COS細(xì)胞則比較合適；HEK293既是理想的建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇，也適合用于瞬時轉(zhuǎn)染。

2018哺乳動物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些或其他一些物種及人的表達(dá)調(diào)控序列。目前有多種質(zhì)粒載體可供選擇。典型的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件:(1)啟動子和增強(qiáng)子；(2)多聚腺拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)如：細(xì)菌抗生素選擇標(biāo)記(Ampr)和用于質(zhì)粒擴(kuò)增的子（具有原核作

2018同細(xì)胞中，各種啟動子的強(qiáng)弱不是一成不變的。人巨細(xì)胞（CMV）啟動子是目前應(yīng)用最廣泛的啟動子，而延長因子1（EF－l）啟動子是迄今為止啟動轉(zhuǎn)錄能力最強(qiáng)啟動子，可使獲得快速高效的表達(dá)。啟動 來 強(qiáng)EF- 人延長因子 人巨細(xì)胞立 肉瘤 SV40 猿猴40晚 SV40 猿猴40早

注：為便于比較，將SV40early啟動子的強(qiáng)度設(shè)定為1，

2018多聚腺苷酸化位點(diǎn)：多腺苷酸（P0lyA）化信號一般由位于多腺苷酸化位點(diǎn)上游11－30保守序列AAUAAA和一個下游的GU-或U-富含區(qū)組成，它指導(dǎo)PolyA尾的形成，增加mRNA的穩(wěn)定性，從而保證表達(dá)的效率。PolyA聚合酶自U之后將切斷，并加PolyA。如啟動子一樣，也有多個種類PolyA區(qū)供選擇。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中常用的多腺苷酸牛生長激3SV40猿 牛生長激3SV40猿 40晚2單純疤 腺激SV40猿 40早1Hep表面抗1

注：為便于比較，將SV40early區(qū)與其比較得出強(qiáng)度相對值。數(shù)值越大，說明多腺苷酸化效率越

2018 APH滅活

2018藥物選擇標(biāo)記：由于外源整合人細(xì)胞中的幾率非常低，因此用致死性物的抗性來篩選穩(wěn)定整合的細(xì)胞就顯得非常重要。在一般的轉(zhuǎn)染中，約1個細(xì)胞中有個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體（效率因細(xì)胞種類和轉(zhuǎn)染方法而異）。常用的而且相對有效的選擇標(biāo)①APH或neor：新霉素、慶大霉素及卡那霉素的結(jié)構(gòu)類似物氨基糖苷（gellticin，418)可以干擾真核細(xì)胞核糖體的功能而蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞。APH或使G418去毒性，而使細(xì)胞可以在含有G418的培養(yǎng)液中存活。G418應(yīng)溶于100mmol／LHEPES（pH4）溶液中，制成100×液備用。不同細(xì)胞對G418的敏感性不同，應(yīng)該在轉(zhuǎn)染前，先確使用終濃度，就是使所用細(xì)胞完全的最小劑量。

2018②ADA 編碼腺苷酸脫氨酶（adenosine ADA）。Xyl－ 2’－ deoxyconformycin（dCF）組成。其中的dCF是一種 ③博來霉素抗性 ：這種 編碼一種 kDa的蛋白，它可與 bleomycln。phleomycin和④HPH：HPH編碼潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycinBphosphoptransferase，HPH）。hygromycinB通過干擾細(xì)白質(zhì)合成中的轉(zhuǎn)位以及促進(jìn)錯誤翻譯等機(jī)制抑制蛋白質(zhì)的合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞在10－400μg／mlHygromycinB的完全培養(yǎng)基中。過量表達(dá)HPH的轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過使HygromycinB磷酸化而使其滅活，使細(xì)胞在HygromycinB選擇培養(yǎng)基中仍然存活

2018⑤(hnee)及T的篩選：受體細(xì)胞必須是相應(yīng)的hprt在含HAT（H：hypoxanthine黃嘌呤，A：aminopterin氨甲喋呤，T：thiymidine胸苷）的培養(yǎng)基中。在A存在下，核苷酸的從頭合成途徑被阻斷，不能合成AMP、TMP及GMP。這三中核苷酸的合成只能有補(bǔ)償途徑合成，必須具有tk或hprt的存在細(xì)胞才可生長。⑥黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)：哺乳動物細(xì)胞沒有XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動物細(xì)胞可通過IMP生產(chǎn)GMP。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細(xì)胞失去合成DNA能力而。將含XGPRT的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，能表達(dá)XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過XMP補(bǔ)救合成GMP，使DNA合成正常進(jìn)行。加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，克隆受霉酚酸的抑制則，以此來篩選陽性克隆。需要注意的是，無論使用何種選擇標(biāo)記，都要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對所使用的細(xì)胞確定適當(dāng)?shù)乃幬餄?/p>

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2018報告：用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的報告系統(tǒng)的出現(xiàn)和篩選方法的發(fā)展又推動了轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展。1982年,Gorman等建立了氯霉素乙酸轉(zhuǎn)移酶（chiomphenicolCAT）報告系統(tǒng)和相應(yīng)的CAT檢測方法。研究者利用該系統(tǒng)將 的調(diào)節(jié)序列克隆到報的上游，然后觀察報告在調(diào)控序列控制下的表達(dá)情況。這一技術(shù)的出現(xiàn)大大推動了對啟動子機(jī)制的研究。繼CAT報告系統(tǒng)，人們又先后建立了多種報告系統(tǒng)，其中包括熒光素酶、β一半乳目前的細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控研究、蛋白表達(dá)和功能分析以及轉(zhuǎn)生物和治療都得益于轉(zhuǎn)移表位：為方便表達(dá)蛋白的鑒定或純化，人們建立了一些含有表位（epitopetags）的融合表達(dá)載體。常用的表位有：GST、人IgG1的Fc區(qū)、FLAG（DYKDDDDK）、HA（YPYDVPDYA）、（His）6（HHHHHH）和C－myc（EQKLISEEDL）等等。表位在目的蛋白的氨基端，也可以放在羥基端。表位

2018依據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)是否具有自 能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類整合?????游離????

可持續(xù)表達(dá)外安全性低：插入誘SV40載體，逆轉(zhuǎn) 載體， 載體腺相 載不整 載體，痘 載

2018

2018 有牛生長激素(BGH)多腺苷酸化號。在此載體基礎(chǔ)上。又衍生出多種適合各種不同要求的載體，

2018pSI：該質(zhì)粒出自Promega公司。含SV40增強(qiáng)子／早期啟動子區(qū)，在其下游還有珠蛋白／嵌合內(nèi)含子，可進(jìn)一步增強(qiáng)表多腺苷酸化信號為晚期SV40用于瞬時轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。該載體本身不含選擇記，若用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，必須與含選擇標(biāo)記

2018pCMV-HA：pCMV-HAClontech公司產(chǎn)品，該質(zhì)粒載體CMV 19 SV4016SmRNA內(nèi)含子

2018pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一個雙啟動子（CMV

2018（4）pBudCE4.1：是Invitrogen公司的一個雙啟動子（CMV

2018誘導(dǎo)表達(dá)載體系統(tǒng) 原理是：首先用pTet－off（或pTet－On）轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞并建系，這種建系細(xì)胞表達(dá)一種由源于四環(huán)素抑 （HSV）VP16蛋白轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合而成的調(diào)節(jié)蛋白，為 被置于族的四環(huán)素反應(yīng)元件（TRE）的調(diào)控之下。對于Tet－Off系統(tǒng)，在沒有Tet或DOX時，從pTet一載體上表達(dá)的tTA蛋白通過結(jié)合pTRE載體上的TRE元件，激活目的 的轉(zhuǎn)錄，而加入t或DoX后，它們即可與tTA發(fā)生相互作用，使后者不再能結(jié)合TRE，目的 的表達(dá)被封對于Tet－On系統(tǒng),PTet－On載體上表達(dá)的 TetR序列區(qū)改變了四個氨酸，因此在環(huán)境中不存在Tet或Dox時，它不能與TRE元件結(jié)合， 不能表達(dá)，只有加入Tet或Dox后，被Tet或Dox修飾的rtTA才能與TRE結(jié)合，啟動目的 的表

2018pTet-Off（pTet-On）系統(tǒng)載體圖

2018（二）型載型載體已被廣泛地用于將外源導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞或替換哺乳動物細(xì)胞中的缺陷將來在治療中將具有非常重要的價目前應(yīng)用的類型包括：逆轉(zhuǎn)錄（retro）、腺（adeno）、腺相關(guān)－associated）、牛痘（Vaccinia）和桿狀（baculo）等等逆轉(zhuǎn)錄載體逆轉(zhuǎn)錄是RNA，進(jìn)人處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞后，在細(xì)胞過程中反轉(zhuǎn)錄成DNA并整合人宿主組，整合的可以被傳至子代細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。逆轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源整合到組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。從另一角度講，這一點(diǎn)也是它的缺點(diǎn)。由于逆轉(zhuǎn)錄的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的位點(diǎn)時會導(dǎo)致細(xì)胞的異常。

2018很多生物技術(shù)公司提供有多種逆轉(zhuǎn)錄載體。這里以Clontech公司的pLNCX為例說明逆轉(zhuǎn)錄載體的基本結(jié)構(gòu)。載體pLNCX含有來目M01oney小鼠白血?。╩urineleukelnia和Moloney小鼠肉（murinesarvoma）的一些元件，另外還有些元件來自于細(xì)菌質(zhì)粒pBR322。這些元件包括：①來自于pBR322的ColE1起始子和ampr基，使得載體可以在大腸桿菌中和被篩選；②5’和3’端長末端重復(fù)序列（1ongterminalrepeats,R）可以促進(jìn)基因的整合;③5’端LTR里啟動子及增子序列，控制中ф+序列和HygromycinB抗性的達(dá)；④多克隆位點(diǎn)；⑤人巨細(xì)胞立早啟動子（PCMVIE），負(fù)責(zé)啟動外源的表達(dá)。將逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞株ackagingcellline）后，它可瞬時或穩(wěn)定表達(dá)含轉(zhuǎn)有病色裝信號、HygnmycinB抗性和目的的錄本，并由包裝細(xì)胞組表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，裝配成具有一次能力的顆粒。 載體 Clontech公司的pAdeno－XVialDNA、Ptre-Shuttle載體和Qiagen公司的 DNA的大部分序列，它在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可直接得到具備 ，

2018 野生 可定點(diǎn)整合人類19 長臂 表達(dá)穩(wěn)定 可在最鄰近 啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛 組較大，體外DNA重組 載 生物學(xué)特

2018 AAV載體單鏈HSV載體

裂細(xì)胞 在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組

Ex 腫 In 腫 。In Ex 獲得性慢性疾病的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的 腫瘤

2018 腺 結(jié)

2018 細(xì)胞過

2018 組

2018 組DNA全長36kb，其包裝上限為原 組的105%，DNA兩端各有 的調(diào)控因子，L1-L5為編碼 。E3區(qū)缺失只會影 使得載體的裝載量提高到4kb 載

2018轉(zhuǎn)移載

2018表達(dá)載

2018 DNA載體的特

2018期

2018 SV40屬于乳多 科多 屬，呈小型二十面體，由、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成 組為5224bp的雙鏈環(huán)而使其DNA形成類似核小體的微 結(jié)構(gòu) SV40 組t/ 期狀態(tài)時，每個宿主細(xì)胞含有105個

20182SV40DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)

2018

腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其中g(shù)pt

利用SV40DNA載體表達(dá)外 的程

2018 SV40

缺陷的SV40SV40DNA載體的特

2018

2018人乳多 人乳多 表達(dá)載體的構(gòu)刪除編

BKV

BKV

2018

SV40 安裝細(xì)胞色素P450dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng)

Ap子DRE，控制小 啟動子MMTP，由其帶動外 SV40來源的啟動子控制Neor標(biāo) 人牛

2018人牛 是一個大型 細(xì)胞質(zhì)中自 。以前外 插 組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu) 啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛 組較大，體DNA重組 ，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行人牛 DNA表達(dá)載體的構(gòu)

2018目前廣泛使用的牛痘表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重其組上插入了一個可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼。在外源導(dǎo)入受體細(xì)胞之前，先以上述的重組 量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源和T7啟動子的細(xì)菌型重組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源整合在受體細(xì)胞人囊狀纖維化就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。利用人牛 載體表達(dá)外 的程

2018 牛 T7啟動 聚合

2018

2018前面介紹了一些常用的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體及多種表達(dá)載體的功能元件，那么，在具體擇載體的時候，哪些因素需要考慮呢？以下幾個問題也許能提示你選擇出恰當(dāng)?shù)妮d體。表達(dá)蛋白質(zhì)的目的是什么如果你需要檢測或純化目的蛋白質(zhì)，應(yīng)選擇能表達(dá)含附加肽的融合蛋白表達(dá)載如果需要將蛋白分泌出來，應(yīng)選擇有分泌信號的載體若需要表達(dá)天然蛋白，應(yīng)挑選不含附加多肽或選擇在N一端有可切除附加多肽序列的載如果需要一次達(dá)幾種蛋白質(zhì)，你可以采用兩種含不同抗藥標(biāo)記的載體，或者選用含兩個啟動子及兩個多克位點(diǎn)的單一載體。 、熒光素酶 和β一半乳糖苷 等

2018或供重組融合蛋白純化用的多組氨酸（6×HIS）或GST等。如果你所表達(dá)的蛋白質(zhì)需要天然的用綠色熒光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）融合載體，其得到的綠色熒光蛋白融合

2018不同載體有不同的啟動子，同一啟動子在不同的細(xì)胞中也會有不同的活性強(qiáng)度。如果你不知道哪種啟動子適合于你所選的細(xì)胞，則應(yīng)先進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，看看別人應(yīng)用這種細(xì)胞或類似細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)的情況，也可以通過網(wǎng)絡(luò)檢索有關(guān)試劑公司，它們常會提供相關(guān)的信息。萬一你外源有些載體（尤其一些載體）對插入片段的大小有嚴(yán)格要求，不能容納太大的外源

2018轉(zhuǎn)染技術(shù)在初期時發(fā)展相當(dāng)緩慢，分子生物學(xué)技術(shù)，特別是質(zhì)粒DNA克隆技術(shù)的進(jìn)步極推動了轉(zhuǎn)染技的進(jìn)步?，F(xiàn)在人們可以輕而易舉地大 高純度的DNA和RNA，但同時要求有更高效率的轉(zhuǎn)染技術(shù)的細(xì)胞種類。由此，人們發(fā)明了電穿孔和 介導(dǎo)的技術(shù)對外源 轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響細(xì)胞的正常生理活動，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可將轉(zhuǎn)染法分為化學(xué)轉(zhuǎn)染法和物理法兩大類。（一）化學(xué)轉(zhuǎn)染化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸鈣法和人工 法等。目前應(yīng)用最廣泛的是人 法DEAE-葡聚

2018人工脂法具有較高的轉(zhuǎn)染效率 目前已有Invitrogen、Promega、Clontech和Qisgen等多家公司生產(chǎn)的脂 轉(zhuǎn)染試劑。讀者以從公司網(wǎng)頁上找到所需的試劑及操作程序。人工脂 轉(zhuǎn)染的具體方法因不同試劑公司品而異，請參照所購試劑說明書進(jìn)行。（二）物理方包括電穿孔、顯微注射 槍等方法四種常用哺乳動物細(xì)胞電穿 轉(zhuǎn)染緩沖①不含Ca2+或Mg2+的

2018②HEPS（137mmol／LNaCI，5mmol／LKCI、0.7mmol／LNa2HPO4，6mmol／L右旋葡萄糖、21③ 培養(yǎng)④蔗糖一磷酸緩沖液272mmol/L蔗糖、7mmol/LK2PO4(pH至7.4)、1電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物原生 等常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。關(guān)于電穿孔技術(shù)用于 導(dǎo)人的 始見于1982年（Whng等）。其作用原理是，利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)人的微孔。電穿孔技術(shù)可用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可方便地用于懸浮細(xì)胞，重現(xiàn)性好，但需要較多的細(xì)胞。影響轉(zhuǎn)染效率的主要因素是脈沖強(qiáng)度和持續(xù)時間。必須找到能夠使核酸有效釋放而又不殺死細(xì)胞的最佳平衡點(diǎn)。顯微注射

2018 槍該法依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞和在體需要注意的是，沒有法是萬能的，應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。但無論選用何種轉(zhuǎn)染方法，DNA的質(zhì)量和數(shù)量對轉(zhuǎn)染成功與否至關(guān)重要。用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須沒有蛋白質(zhì)。RN和其它化學(xué)物質(zhì)污染，可用CSCI梯度離心、柱層析法或質(zhì)粒DN提取試劑盒DN。吸光度A260nm與A280nm的比值應(yīng)在1.8－1.9之間。轉(zhuǎn)染前用乙醇沉淀DNA，再加人適量滅菌水或TE緩沖液溶解DNA，至終濃度為1mg／ml左右。對于不同的細(xì)胞，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染所需的量不同，因此在實(shí)驗(yàn)開始以DN的比例，轉(zhuǎn)染DN在（三 率、可穩(wěn)定遺傳、適用于各種不同來源的細(xì)胞及操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。但多 有其潛在 性，操作者需要有一定操作經(jīng)驗(yàn)和良好的設(shè)施 表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)容十分豐富，其應(yīng)用已越來越廣泛高效表達(dá)外源蛋白的基本方(1)高效表達(dá)外源蛋白的基本方目的在哺乳動物體、目的和宿主細(xì)

2018

2018高效表達(dá)外源蛋白的基本方(1)

2018擴(kuò)增是外源在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細(xì)胞，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，dhf均得以擴(kuò)增。這些抗性細(xì)胞正是通過增加相關(guān)的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhf本身，即與dhf高效表達(dá)外源蛋白的基本方

2018

0.05mM0.25mM

轉(zhuǎn)染dhfr-細(xì)胞系5mMMTX外 高效表達(dá)外源蛋白的基本方

2018 高效表達(dá)外源蛋白的基本方通過選 的弱化表達(dá)增加拷貝

2018具體實(shí)例：將選擇通過一段寡聚核苷酸連在目的的3′端（如圖）