動(dòng)物毒理學(xué)：實(shí)驗(yàn)二 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)原理微核是在細(xì)胞的有絲分裂后期染色體有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核時(shí)，仍然留在細(xì)胞質(zhì)中的染色單體或染色體的無(wú)著絲粒斷片或環(huán)。它在末期以后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)而形成，由于比核小得多故稱微核。

通過(guò)檢測(cè)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞（PCE）的微核出現(xiàn)率，間接反應(yīng)骨髓細(xì)胞染色體畸變發(fā)生率的高低，從而判斷受試藥物是否具有致突變作用,主要用于測(cè)試干擾細(xì)胞有絲分裂的物質(zhì)。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的形成3實(shí)驗(yàn)材料3.1器材解剖器械，顯微鏡，載玻片等。3.2試劑甲醇（分析純）、甘油（分析純）、Giemsa儲(chǔ)備液、pH6.8磷酸鹽緩沖液、小牛血清、生理鹽水3.3藥物環(huán)磷酰胺3.4動(dòng)物小鼠7-12周齡，體重20-30g，雌雄各半。4操作步驟4.1給藥環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液按50mg/kg劑量腹腔注射2次，間隔24h?？瞻讓?duì)照：生理鹽水4.2骨髓液的制備和涂片試驗(yàn)動(dòng)物第二次染毒6小時(shí)后用頸椎脫臼或麻醉法將其處死，取胸骨，擦凈血污，剔去肌肉。在潔凈的玻片滴小牛血清1滴，剪去骨骺，用止血鉗將骨髓擠到血清中，混勻，推片，干燥。4操作步驟4.3固定將推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇液固定5-10min，取出，晾干。不能及時(shí)染色的涂片也應(yīng)固定好保存。4操作步驟4.4染色將固定晾干后的涂片，用新鮮配制的Giemsa染液(Giemsa儲(chǔ)備液1份+pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10-15min，沖洗，晾干。1/15mol/L磷酸鹽緩沖液(PH6.8)

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

4.50g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)

11.81g

加蒸餾水至1000mL

4操作步驟嗜多染紅細(xì)胞（PCE）呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）呈粉紅色。典型的微核多為單個(gè)、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色。4.5觀察計(jì)數(shù)低倍鏡下觀察，選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，再在油鏡下觀察計(jì)數(shù)。

計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE中含微核的PCE數(shù)，并且計(jì)數(shù)至少200個(gè)細(xì)胞（PCE+NCE≥200個(gè)）中PCE與NCE的比值。4操作步驟MNNCE5結(jié)果記錄細(xì)胞總數(shù)微核細(xì)胞數(shù)微核率（‰）PCE數(shù)NCE數(shù)PCE/NCE空白組染毒組表微核率統(tǒng)計(jì)嗜多染紅細(xì)胞微核率=有微核的嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)/檢查嗜多染紅細(xì)胞數(shù)×1000‰正常小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率為千分之五以下，超過(guò)千分之五為異常。6結(jié)果分析與評(píng)價(jià)本試驗(yàn)中只計(jì)數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE為評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)，受試組PCE/NCE值與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表示受試化學(xué)毒物的劑量過(guò)大，試驗(yàn)結(jié)果不可靠。正常PCE/NCE約為1（