第十章 色譜分離過程

第十章色譜分離過程第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)概述

一、色譜法的由來1．1906年由俄國植物學(xué)家Tsweet創(chuàng)立

植物色素分離見圖示

40年代TLC，紙色譜50年代GC出現(xiàn)使色譜具備分離和在線分析功能60年代末HPLC出現(xiàn)，使色譜分析范圍進一步擴大2．現(xiàn)在：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三圖示固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚

色帶第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三二、色譜法定義、實質(zhì)和目的

定義：利用物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)建立的分離、分析方法實質(zhì)：分離目的：定性分析或定量分析

其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。固定相——除了固體，還可以是液體

流動相——液體或氣體色譜柱——各種材質(zhì)和尺寸被分離組分——不再僅局限于有色物質(zhì)第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測。

兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三三.色譜法的特點（1）分離效率高復(fù)雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。（3）分析速度快一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。

不足之處：被分離組分的定性較為困難。第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)色譜分離過程的基本原理一、分離原理

色譜分離過程的實質(zhì)是溶質(zhì)在不互溶的固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次的交換過程，它借助溶質(zhì)在亮相間分配行為的差別而使不同的溶質(zhì)分離。以吸附色譜為例吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三分配系數(shù)的微小差異→吸附能力的微小差異微小差異積累→較大差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強的組分后流出第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三二、固定相（色譜柱填料）1.固體固定相a常用的固體吸附劑：活性炭，硅膠，氧化鋁，分子篩等作用機理：吸附占主導(dǎo)地位b新型的固體固定相：高分子多孔微球低溫時，吸附占主導(dǎo)地位，高溫時分配占主導(dǎo)地位c化學(xué)鍵合固定相：分配占主導(dǎo)地位主要用于分析永久性氣體，如低級烷烴、氫、氧、一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、硫化氫等。第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三2.液體固定相組成結(jié)構(gòu)：擔(dān)體+固定液，前者是具有較大比表面、化學(xué)呈惰性的一類物質(zhì)，后者在色譜使用溫度下呈液體膜狀態(tài)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不流失或揮發(fā)，主要用于分析較高沸點的有機物。對固定液的基本要求：a蒸汽壓要低，使用溫度下為液體b熱穩(wěn)定要好，不揮發(fā)c惰性，與分析物質(zhì)不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三固定液的選擇原則：“相似相溶”，選擇與試樣性質(zhì)相近的固定相。A非極性樣品選用非極性固定液（主要作用力為色散力）流出順序：沸點低的先流出，同沸點的極性組分先流出B中等極性樣品選用中等極性固定液（主要作用力為靜電力）流出順序：沸點低的先流出，同沸點的極性小的組分先流出C強極性樣品選用強極性固定液（主要作用力為靜電力）流出順序：極性低的先流出第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三三、色譜柱及柱技術(shù)色譜柱的性能依賴于三個因素：色譜柱填充技術(shù)、柱設(shè)計和生產(chǎn)1.色譜柱裝填方法高壓勻漿填充干法填充徑向壓縮法軸向壓縮法環(huán)形壓縮技術(shù)2.色譜柱的設(shè)計多采用大直徑、短柱長的“餅式”柱第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)色譜的分類1.按固定相及流動相的狀態(tài)分類：液相色譜、氣相色譜2.按固定相形狀性質(zhì)分類：柱色譜、紙色譜、薄層色譜第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三3.按色譜過程的機理分類：吸附色譜：用固體吸附劑作固定相，利用組分在吸附劑上吸附力的不同，因而吸附平衡常數(shù)不同而將組分分離分配色譜：用液體作固定相，利用組分在液相中的溶解度不同，因而分配系數(shù)不同進行分離離子交換色譜：利用離子交換原理排阻色譜：利用分子大小不同電色譜：利用帶電物質(zhì)在電場作用下移動速度不同進行分離第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三4.可按儀器分:a氣相色譜(Gaschromatography)填充柱氣相色譜（Packedcolumngaschromatography）毛細管氣相色譜(Capillarycolumngaschromatography)裂解氣相色譜(Pyrolysisgaschromatography)頂空氣相色譜(Headspacegaschromatography)氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gaschromatography-Massspectrometry）b液相色譜儀(Liquidchromatography)高效液相色譜(Highperformanceliquidchromatography)超臨界流體色譜(Supercriticalfluidchromatography)高效毛細管電泳(Highperformancecapillaryelectrophoresis)毛細管電色譜(Capillaryelectrochromatography)液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Liquidchromatography-Massspectrometryc平面色譜法（Planarchromatography）薄層色譜(Thinlayerchromatography)薄層電泳色譜(Thinlayerelectrophoresis)紙色譜(Paperchromatography)第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

(1)色譜過程熱力學(xué)——高選擇性色譜分離的理論基礎(chǔ)；⑵色譜過程動力學(xué)——高效色譜分離的理論基礎(chǔ)；⑶色譜分離條件的選擇——多元混合物分離最優(yōu)化理論。

色譜理論研究色譜過程中分子運動的規(guī)律，探討微觀分子運動與色譜分離的內(nèi)在聯(lián)系。它包括三個基本理論問題：第四節(jié)色譜分離過程基礎(chǔ)理論第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三一、色譜過程

色譜柱檢測器色譜圖

組分在色譜柱內(nèi)運動溶質(zhì)濃度分布柱內(nèi)：譜帶柱后：色譜峰色譜儀第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

差速遷移指不同組分通過色譜柱時的移動速度不同。樣品注入色譜柱時，由于流動相以一定速度通過固定相，使樣品中各組分在兩相之間進行連續(xù)多次的分配。由于組分與固定相和流動相作用力的差別，在兩相中的分配系數(shù)不同。在固定相溶解或吸附大的，即分配系數(shù)大的組分，遷移速度？

慢

在固定相溶解或吸附小，即分配系數(shù)小的組分，遷移速度？

快第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

結(jié)果是樣品各組分同時進入色譜柱，而以不同的速度在色譜柱內(nèi)遷移，導(dǎo)致各組分分離。組分通過色譜柱的速度，取決于各組分在色譜體系中的平衡分布。因此，影響平衡分布的因素，即流動相和固定相的性質(zhì)、色譜柱柱溫等影響組分的遷移速度。第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三二、保留值、分離度和柱效率

1.保留值通常以保留時間tR及容量因子k’表示保留時間tR：從進樣開始到某組分色譜峰頂（濃度極大點）的時間，即組分在色譜柱中的停留時間或組分流經(jīng)色譜柱所需要的時間。第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三容量因子(新定義為保留因子，Retentionfactor)在色譜法中，保留值是表示組分在色譜柱內(nèi)滯留狀況的一個指標(biāo)。而容量因子（k）是一個具有普遍意義的色譜保留值，它指在一定柱溫下,溶質(zhì)在兩相間達到分配平衡時,分配在固定相和流動相中的總量之比。

k=ws/wm=K·Vs/Vm=K/可見，k與組分的分配系數(shù)K和相比有關(guān)，但與流動相流速無關(guān)。k值大小可直接從色譜圖上測量。有關(guān)計算式如下：tr=t0(1＋k)Vr=Ftr

基本保留方程分離因子恒流速t0的測定第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三2.分離度分離條件的選擇主要是提高“難分離物質(zhì)對”的分離度峰寬分離度R國家標(biāo)準分離度

當(dāng)兩峰高相差不大,且峰型接近時可以認為W1=W2=W當(dāng)R=1時，分離程度達到94%當(dāng)R=1.5時，分離程度達到100%第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三3.柱效應(yīng)色譜柱的理論塔板數(shù)、塔板高度反應(yīng)不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計算方法：N---理論塔板數(shù)tR---保留時間W1/2---半峰寬Wb---峰底寬度理論塔板高度：L---柱長第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三三、平衡色譜理論

Wilson等人提出的平衡色譜理論的三個基本假設(shè)：l.溶質(zhì)在流動相和固定相之間的分配平衡在整個色譜過程中都能瞬間實現(xiàn)；2.傳質(zhì)阻力，縱向擴散對平衡的影響可以忽略；3.溶質(zhì)在色譜柱遷移過程中，在一定時間內(nèi)，色譜柱每一小段溶質(zhì)量的變化符合物料平衡原理。第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

流動相固定相

平衡色譜理論物料平衡示意圖

根據(jù)物料平衡：

溶質(zhì)在兩相間的分配或吸附平衡常數(shù)：第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三通過數(shù)學(xué)處理，組分的保留值為：

從平衡色譜理論導(dǎo)出的溶質(zhì)譜帶遷移速率方程及相應(yīng)的保留時間、保留體積表達式，初步揭示了物質(zhì)在色譜柱的差速遷移過程。非線性等溫線比較好地解釋了不對稱色譜峰，特別是拖尾峰的成因。但它未能闡明色譜流出曲線，實際應(yīng)用比較有限。

根據(jù)平衡色譜理論，當(dāng)分布等溫線呈線性時，溶質(zhì)的K為常數(shù)，譜帶遷移速率不變，不產(chǎn)生色譜譜帶擴張。若分布等溫線為非線性，則K隨Cm變化溶質(zhì)遷移速度亦變化，引起色譜峰擴張，形成不對稱色譜峰。第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三四、塔板理論(theplatemodel)

1941年，Martin和Synge闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成；與精餾相似，色譜分離也是一個分配平衡過程。這就是Martin等人提出的塔板理論。掌握這一理論的要點是：假設(shè)→二項式分布（概率密度函數(shù)）→流出曲線→實驗事實第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三塔板理論基本假設(shè)固定相，流動相，H,vm，v3l

色譜柱由一系列塔板組成l

塔板內(nèi)，組分在兩相間迅速達到平衡（理想色譜）l

組分的分配系數(shù)不隨它的濃度變化而變化（線性分布等溫線）l

組分的軸向擴散為零l

流動相的流動是跳躍過程第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三流動相固定相塔板號0123r-1r塔板理論示意圖

如果把上述錯流萃取過程繼續(xù)下去，即“平衡→轉(zhuǎn)移→再平衡→再轉(zhuǎn)移→。。。”第29頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三

0加樣

0平衡流動0101再平衡流動012

塔板理論示意圖

第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三第五節(jié)典型制備色譜工藝及應(yīng)用一、模擬移動床色譜（simulatedmovingbed,SMD）SMB色譜分離技術(shù)是20世紀60年代發(fā)展起來的一種現(xiàn)代化分離技術(shù),具有分離能力強,設(shè)備體積小,投資成本低,便于實現(xiàn)自動控制并特別有利于分離熱敏性及難以分離的物系等優(yōu)點,在制備色譜技術(shù)中最適用于進行連續(xù)性大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三1.模擬移動床色譜的原理

SMB色譜由多根色譜柱（大多為5-12根）組成。每根柱子之間用多位閥和管子連接在一起，每根柱子均設(shè)有樣品的進出口，并通過多位閥沿著流動相的流動方向，周期性地改變樣品進出口位置，以此模擬固定相與流動相之間的逆流移動，實現(xiàn)組分的連續(xù)分離第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三2.建立SMB色譜分離工藝的步驟（1）設(shè)置工藝要求（2）確定溶解度（3）選擇固定相（4）優(yōu)化分離條件（5）工藝參數(shù)模擬（6）中試研究第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三3.SMB色譜的應(yīng)用

20世紀90年代以來，SMB色譜開始用于藥物尤其是手性藥物的分離，到現(xiàn)在SMB已發(fā)展到噸級工藝。SMB色譜技術(shù)在生物分離領(lǐng)域也有較廣泛的應(yīng)用。SMB色譜正逐步地取代cyclosporinA的傳統(tǒng)間歇色譜純化工藝。一般地，SMB色譜技術(shù)應(yīng)用于兩組分分離系統(tǒng)。在制藥工業(yè)中，作為結(jié)晶、選擇性手性合成等拆分手性藥物技術(shù)的取代技術(shù)。第34頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三4.SMB色譜技術(shù)的優(yōu)勢（1）SMB色譜是一個連續(xù)色譜分離過程（2）SMB色譜技術(shù)比其他制備色譜的分離效率高（3）SMB色譜技術(shù)可以實現(xiàn)旋光異構(gòu)物分離過程從分析型色譜條件快速、可靠的放大至生產(chǎn)規(guī)模（4）SMB色譜裝置可以適合不同規(guī)模的色譜分離過程第35頁，共42頁，2023年，2月20日，星期三二、擴展床吸附色譜(expandedbedabsorption,EBA)1.EBA色譜的基本原理和特點使用特殊設(shè)計的擴張床介質(zhì)在床層中適度膨脹，介質(zhì)與介質(zhì)間的空隙能讓發(fā)酵液中的不吸附的固體顆粒直接穿過擴張床；同時，特殊設(shè)計的擴張床介質(zhì)能夠