第四章 凝膠排阻

第四章凝膠排阻1第1頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

排阻層析(exclusionchromatography)，亦稱分子篩層析(molecularsievechromatography)、凝膠過濾(gelfiltration)。凡是利用生物大分子的相對分子質(zhì)量(relativemolecularmass，Mr)差異進(jìn)行層析分離的方法，均稱之為排阻層析。用于排阻層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)。在20世紀(jì)60年代初就開始使用凝膠介質(zhì)分離生物大分子。例如，用淀粉或者瓊脂糖作為電泳支持物分離血清中的蛋白質(zhì)，凝膠在其中起分子篩作用。后來人們將凝膠制成球形微珠，作為液相層析分離介質(zhì)，用于分離生物大分子，并獲得巨大成功。現(xiàn)在使用的凝膠層析介質(zhì)的用途遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了電泳分離介質(zhì)的范疇，已成為分離純化生物大分子最重要的分離介質(zhì)之一，也是作為合成帶有配基的層析介質(zhì)應(yīng)用最廣泛的一種載體。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥在研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。

第一節(jié)概述2第2頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)凝膠層析原理

一、基本原理凝膠類層析介質(zhì)是一種在球體內(nèi)部具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠微粒，不同大小的網(wǎng)狀孔徑像篩子一樣，可以把大小不同的生物大分子按一定的順序進(jìn)行分離，好像“目數(shù)”不同的普通篩子一樣把大小不同顆粒分級篩分。但是排阻層析與普通篩分的原理不同，排阻層析是按生物分子分子量的大小排序進(jìn)行篩分的。3第3頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三相對分子質(zhì)量大的生物分子由于不能進(jìn)入或不能完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀孔，沿著凝膠顆粒間的空隙或大的網(wǎng)狀孔通過，大分子相對于小分子遷移的路徑近，在柱內(nèi)的停留時間短，保留值小，所以在層析過程中遷移率最快，走在小分子的前面，先從柱中流出；4第4頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三分子量小的分子由于能夠進(jìn)入凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀孔，沿著凝膠顆粒不同大小的網(wǎng)狀孔流過，相對于大分子遷移的路徑長，在柱內(nèi)的停留時間長，保留值大，所以在層析過程中遷移率最慢，走在大分子的后面，后從柱中流出。5第5頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三樣品中分子量大小不同的各種分子在流過凝膠內(nèi)部網(wǎng)狀孔時就受到凝膠介質(zhì)排阻效應(yīng)，也稱為分子篩效應(yīng)，將它們一個一個分離，從而達(dá)到分離的目的。普通篩分是大顆粒不能通過篩子的篩孔而被截留在篩板的上面，小顆粒可以通過篩孔。所以普通篩分與凝膠層析篩分的原理是不一樣的。排阻層析分離的基本原理如圖所示。6第6頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三7第7頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三凝膠層析介質(zhì)分離的分子主要分3部分。第一部分是全排阻分子，也可稱之為上限分子量，不能起篩分作用的大分子。第二部分是部分滲透分子，稱為分離分子，是凝膠介質(zhì)有效分離的分子。第三部分是全滲透分子，稱之為下限分子量，是不能起篩分作用的小分子。

8第8頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三從圖可以看出，A-B之間為該凝膠的有效分離范圍，可分離相對分子質(zhì)量范圍是1000～100000，高于相對分子質(zhì)量為100000的是全排阻分子，低于相對分子質(zhì)量為1000的是全滲透分子。凝膠層析的分離范圍示意圖9第9頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三二、參數(shù)的表示方法及其意義1.柱床體積凝膠層析介質(zhì)經(jīng)溶脹、裝柱、沉降、體積穩(wěn)定后，所占層析柱內(nèi)的總體積，稱為柱床體積或床體積，以Vt(totalvolume)表示，單位為ml。2.外水體積存在于柱床體積內(nèi)凝膠顆粒之外、顆粒之間的空隙所占有的那一部分水相體積或溶劑體積，稱之為外水體積或外體積，以Vo(outervolume)表示，單位為m1。10第10頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三3.內(nèi)水體積是凝膠吸水溶脹后，存在于凝膠顆粒內(nèi)所占有的那一部分水相體積或溶劑體積，稱之為內(nèi)水體積或內(nèi)體積以Vi(innervolume)表示，單位為m1。4.凝膠體積是凝膠顆粒自身的體積，也就是床體積減去外水體積和內(nèi)水體積后所占有的體積，稱為膠體積或稱干膠體積,以Vg(gelvolume)表示，單位為m1。11第11頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三5.洗脫體積自加樣液時開始，到洗脫組分濃度最大時出現(xiàn)的峰(洗脫峰峰頂)為止，所收集的體積，以Ve(elutionvolume)表示，單位為m1計算法：根據(jù)層析柱體積計算總體積可用下列公式表示Ｖt=πr2h

干凝膠用量（克）＝πr2h

／膨脹度（床體積／克干膠）12第12頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三三、參數(shù)之間的關(guān)系測量法1.床體積與Vo，Vi，Vg之間的關(guān)系式是：Vt=Vo+Vi+Vg(1-1)2.洗脫體積與Vo，Vi的關(guān)系式為：Ve=Vo+KdVi(1-2)式中Kd-樣品組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)，也可以視為相對分子質(zhì)量不同的溶質(zhì)在凝膠顆粒的內(nèi)部和外部的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小、凝膠顆粒空隙和網(wǎng)狀孔徑大小有關(guān)，與層析柱的長短和粗細(xì)無關(guān)。Kd可以通過實驗獲得。13第13頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三3.Kd與體積之間的關(guān)系可以將式(1-2)變換一下，即可得到Kd與體積之間的關(guān)系式：(1-3)Ve–VoVi式中Ve-實驗測得的實際洗脫體積?？捎貌槐荒z滯留的大的相對分子質(zhì)量組分測得，通常用相對分子質(zhì)量在2×106的藍(lán)色葡聚糖-2000測定，可以通過干膠的吸水量(每克干膠所吸附水的毫升數(shù))求得。對于一定條件的凝膠層析柱來說，只要通過實驗得知某一組分的洗脫體積Ve，就可以計算出Kd值。

以上關(guān)系可以通過圖2表示。Kd=14第14頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三15第15頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三四、Kd的幾種判斷在凝膠柱層析過程中，Kd可以有以下幾種情況：1.Kd=0時，Ve=Vo對于完全不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子(全排阻)，其洗脫體積就等于外水體積。2.Kd=1時，Ve=Vo+Vi。對于完全可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部的小分子(全滲透)，其洗脫體積就等于外水體積和內(nèi)水體積之和。

16第16頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三由此可見，對于某一凝膠介質(zhì)，如果在層析過程中有兩種全排阻的大分子，即Kd=0，盡管它們在分子量之間的差別很大，但由于它們已經(jīng)超出了該凝膠質(zhì)的所能分離大分子的范疇，不可能有分離效果。17第17頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三同樣兩種小分子全部都能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部空隙，

Kd=1，盡管它們在分子量大小仍有差異，但由于它們已經(jīng)超出了該凝膠質(zhì)的所能分離小分子的范疇，同樣也不可能有分離效果。因此，不同型號的凝膠介質(zhì)有不同的相對分子質(zhì)量分離范疇。在進(jìn)行排阻層析之前，根據(jù)分離的相對分子質(zhì)量選擇合適的凝膠介質(zhì)。18第18頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三3.0<Kd<1時，Ve=Vo十KdVi。表示凝膠顆粒內(nèi)部一部分空隙可以被不同大小的分子利用，可以有不同程度的滲入，Ve在Vo+Vi之間變化。4.Kd>1時，表示凝膠具有一定的吸附作用，此時Ve>Vo+Vi。例如某些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)超出理論計算的最大值，這些化合物的Kd值一般都是大于1的。如苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分別為1.2、1.4和2.2。19第19頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

在實際工作中，小分子不易得到Kd=1的數(shù)值，尤其是對交聯(lián)度大的凝膠介質(zhì)Kd差別較明顯，如同樣一個小分子在SphadexG-10柱層析測得的Kd是0.75左右，同樣一個小分子在SphadexG-25柱層析測得的Kd是0.8左右。20第20頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三造成這種差別的原因是由于一部分水分子與凝膠結(jié)合較牢固，成為凝膠本身的一部分，使凝膠的有效網(wǎng)狀孔變小，小分子不能擴(kuò)散和滲透到凝膠內(nèi)部，是凝膠失去了部分篩分作用所致。此時的Vi不能以凝膠的吸水量進(jìn)行計算，因此，通常以小分子化合物通過凝膠柱來測定Vi值。另外一種計算方法是不使用Vi和Kd，而是用Kav，(有效分配系數(shù))代替Kd，定義如下。21第21頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

22第22頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

在這里實際上是將原來以水作為固定相(Vi)改為凝膠顆粒(Vt-Vo)作為固定相，而洗脫劑(Ve-Vo)作為流動相。Kav，和Kd值對交聯(lián)度較小的凝膠介質(zhì)差別不大，而對交聯(lián)度大的凝膠介質(zhì)差異較大。在排阻層析過程中，凝膠層析介質(zhì)一般情況對流動相的組分無吸附作用，當(dāng)流動相的體積Vt流過后，上樣后的所有組分都應(yīng)當(dāng)被洗脫出來，這是凝膠排阻層析與其他的層析方法所不同之處。23第23頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三五、Ve與相對分子質(zhì)量的關(guān)系

對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的相對分子質(zhì)量有關(guān)，各種組分流過凝膠柱時，洗脫順序按相對分子質(zhì)量(Mr)的大小排列先后流出。Ve與Mr的關(guān)系式如下。Ve=K1-K2lgMr(1-7)式中：K1-常數(shù)；K2-常數(shù)；Mr-相對分子質(zhì)量；Ve-洗脫體積。A-SephadexG100;B-sephadexG-20024第24頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

有時Ve也可以用分離體積(Ve-Vo)、相對保留體積(Ve/Vo)、簡化洗脫體積(Ve／Vt)或有效分配系數(shù)(Kav)代替，它們與相對分子質(zhì)量的關(guān)系與公式(1-7)相同，只是常數(shù)不同。但實際操作過程中大多數(shù)都是以Kav對相對分子質(zhì)量的對數(shù)(1gMr)作圖，得到工作曲線，也稱之為“選擇曲線”，如圖3所示。曲線的斜率是表明凝膠的性質(zhì)，是一個重要的特征。在凝膠允許的分離范圍內(nèi)，曲線的斜率越陡，分級分離的效果越好。25第25頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三凝膠排阻層析分離主要決定于溶質(zhì)中相對分子質(zhì)量的大小和相應(yīng)凝膠的交聯(lián)度。在同一類型的生物大分子(球形分子或線形分子)的前提下，凝膠分級分離的范圍越窄，測定的相對分子質(zhì)量越準(zhǔn)確。凝膠排阻層析具有設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好、條件溫和等優(yōu)點，是實驗室測定相對分子質(zhì)量常用的方法，也是生物大分子分離純化常用的分離手段。26第26頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)凝膠層析介質(zhì)

一、凝膠的基本性質(zhì)

自然界天然凝膠和化學(xué)合成的凝膠種類很多，但能用排阻層析的凝膠則不多。排阻層析的凝膠是一種球形顆粒，球內(nèi)部是多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與普通凝膠在性能上主要有以下幾點區(qū)別。27第27頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三1.化學(xué)穩(wěn)定性合成凝膠的原料和合成凝膠介質(zhì)以后所保留的化學(xué)基團(tuán)(如羥基等)必須具有良好的惰性，不與待分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響被分離物質(zhì)原有的性質(zhì)(如生物活性、構(gòu)象等)；在比較苛刻的環(huán)境中(在偏堿或偏酸的溶液中和在高濃度的鹽溶液中)不發(fā)生降解、變性反應(yīng)，保持相對穩(wěn)定。2.無特異性吸附凝膠顆粒上不存在或存在極少的離子基團(tuán)，不與溶液中的離子化合物發(fā)生離子交換、吸附或親和反應(yīng)。在低離子強(qiáng)度下，洗脫峰不出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，被分離物質(zhì)有較高的回收率。28第28頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三3.具有較好的耐受性凝膠顆粒對溫度和有機(jī)溶劑具有較好的耐受性，尤其是對物理聚合的凝膠，在高溫下(100℃左右)不發(fā)生熔融，在有機(jī)溶劑中凝膠的體積不發(fā)生收縮變形。4.剛性好凝膠顆粒具有一定機(jī)械強(qiáng)度，在允許的操作壓范圍內(nèi)，柱床體積保持穩(wěn)定，在層析的過程中流速不發(fā)生改變。29第29頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三二、凝膠層析介質(zhì)的分類

目前，常用于排阻層析的凝膠類介質(zhì)主要有4大類，即葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠等層析介質(zhì)。1.葡聚糖凝膠層析介質(zhì)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)是由多聚葡聚糖通過與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而合成的，是一類具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的珠狀凝膠顆粒。葡聚糖凝膠交聯(lián)的程度(簡稱交聯(lián)度)與凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑的大小有直接關(guān)系，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越小，分離的分子量就??；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越大，分離的分子量就大。葡聚糖凝膠交聯(lián)結(jié)構(gòu)如圖4。30第30頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三31第31頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三交聯(lián)的葡聚糖不溶于有機(jī)溶劑和水的聚合物，但由于其結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基，又具有很強(qiáng)的親水性，能迅速在水和電解質(zhì)溶液中溶脹，在層析過程中非常容易與水溶性溶質(zhì)接觸。合成的葡聚糖凝膠在酸性條件下糖苷鍵容易被水解，在堿性環(huán)境中比較穩(wěn)定。一般在0.25mol／LNaOH溶液中，60℃的條件下放置兩個月以上仍不改變其原有的基本性質(zhì)。所以常用稀堿溶液處理葡聚糖凝膠層析介質(zhì)，以除去殘留在凝膠介質(zhì)上的變性蛋白和其他雜質(zhì)。32第32頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三在氧化劑的作用下葡聚糖凝膠上的羥基容易氧化成羧基，增加了帶電荷基團(tuán)，容易與溶液中的離子化合物發(fā)生交換反應(yīng)，使其非特異性吸附的能力增強(qiáng)，從而影響分離效果和回收率。葡聚糖凝膠對溫度具有較好的耐受性，通常在溶脹狀態(tài)的葡聚糖凝膠可以耐受110℃高溫，而在未溶脹狀態(tài)下的干膠可以耐受120℃的高溫。33第33頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

最常用的葡聚糖凝膠層析介質(zhì)是SephadexG系列產(chǎn)品，它是由Pharmacia生產(chǎn)的，介質(zhì)的型號不同，其交聯(lián)度也不同，分離相對分子質(zhì)量的范圍有差異。例如SephadexG-25、SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG-100、SephadexG-200等，代表著不同型號的葡聚糖凝膠，英文字母G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字，表示凝膠吸水量。不同型號的葡聚糖凝膠的有關(guān)技術(shù)參數(shù)見表-1。34第34頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三表-1葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)凝膠型號顆粒大小／μm

溶脹體積／(m1／g)

分離范圍(Mr)

SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25SephadexG-50SephadexG-75SephadexG-100SephadexG-150SephadexG-200

40～12040～12050～15050～15040～12040～12040～12040～120

2～32．5～3．54～69～1112～1515～2020～3020～40

小于7×102小于1．5×1031．0×103～5．0×1031．5×103～3．0×1043．0×103～8．0×1044．0×103～1．0×1055．0×103～3．0×1055．0×103～6．0×105

35第35頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三SephadexG系列產(chǎn)品，“G”后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，相對分子質(zhì)量分離范圍越大，凝膠的溶脹體積大。與此相反，“G”后面的阿拉伯?dāng)?shù)越小，表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，相對分子質(zhì)量分離范圍越小，凝膠的溶脹體積小。凝膠的特性：具有耐高溫(100℃沸水煮)、在酸性或堿性條件下穩(wěn)定（在pH2～11范圍內(nèi)穩(wěn)定)，但是在高鹽濃度下體積易收縮，凝膠的剛性較差。

36第36頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三2.瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)瓊脂是自然界廣泛存在的一種天然多糖混合物，主要來源于海藻。瓊脂主要由兩部分組成，一部分是中性鏈狀多糖，稱為瓊脂糖(agarose)，其基本結(jié)構(gòu)是由B-D-吡喃半乳糖和3，6-脫水-L-吡喃半乳糖相間結(jié)合而成的鏈狀多糖；另一部分是帶負(fù)電荷的瓊脂糖(agaropectin)，在分子中含有磺酸基和羧基，在制備瓊脂糖時需要用氯代十六烷吡啶或聚乙烯醇等有機(jī)溶劑將瓊膠沉淀除去。其部分結(jié)構(gòu)如下。

37第37頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三圖538第38頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三目前能生產(chǎn)瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)廠家很多，生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品的名稱也因生產(chǎn)廠家不同而異，但介質(zhì)的基本性能都很相近。例如瑞典生產(chǎn)的Sepharose系列、美國生產(chǎn)的SuperAgoGel系列、英國生產(chǎn)的Sagavac系列、丹麥生產(chǎn)的Gelarose系列、我國生產(chǎn)的QT系列等都是以瓊脂糖為原料制成的。

39第39頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

瓊脂糖凝膠是一種大孔膠，由于半乳糖的分子中含有許多羥基，具有良好的親水性，在層析過程中非常容易與水溶性溶質(zhì)或溶劑接觸。它的交聯(lián)度隨著瓊脂的濃度增加而增大，制備時以物理的方式聚膠，首先配制一定濃度的瓊脂糖，加溫直至使其完全融化，然后迅速冷卻獲得凝膠，凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)主要是依靠糖鏈之間的次級鍵如氫鍵來維持穩(wěn)定，網(wǎng)狀孔徑的大小通過改變凝膠的交聯(lián)度來控制。瓊脂糖分子中不帶電荷，所以非特異性吸附較少，樣品在排阻層析分離時回收率較高。40第40頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三由于瓊脂糖凝膠鏈與鏈之間不是共價結(jié)合，所以對于未經(jīng)特殊處理的瓊脂糖凝膠，當(dāng)環(huán)境的溫度高于56oC時就會開始融化，如果經(jīng)過特殊方式處理或經(jīng)過交聯(lián)的瓊脂糖可以耐受100～120℃的高溫，機(jī)械強(qiáng)度也有較大的提高。

41第41頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三最常用的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)是SepharoseB系列產(chǎn)品，它是由Pharmacia生產(chǎn)的，介質(zhì)的型號不同，其交聯(lián)度也不同，分離分子量的范圍有差異。例如，Sepharose4B、Sepharose6B、Sepharose8B等。不同型號的瓊脂糖凝膠表示不同的瓊脂糖百分含量，有關(guān)技術(shù)參數(shù)見表2。42第42頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三凝膠型號

顆粒大?。蘭

凝膠濃度／％

分離范圍(Mr)

Sepharose2BSepharose4BSepharose6B

Sepharmse8BSepharose12B50～13050～13050～130

50～13050～130

246

812

5×105～15×1072×105～15×1065×104～2×106

2×104～7×1055×103～5×104

表2瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)43第43頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三在SepharoseB系列產(chǎn)品中，“B”前面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示瓊脂糖的百分濃度，瓊脂糖濃度越高表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，相對分子質(zhì)量分離范圍越小。與此相反瓊脂糖濃度越低表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，相對分子質(zhì)量分離范圍越大，因此瓊脂糖凝膠的交聯(lián)度表示方法與葡聚糖凝膠相反。

44第44頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三瓊脂糖凝膠的特性：具有良好的大孔性和機(jī)械強(qiáng)度，交聯(lián)的瓊脂糖凝膠除了能耐受120℃蒸汽壓力處理外，還可以耐受一定的酸堿度(在pH3～12范圍內(nèi)穩(wěn)定)和在6M尿素中不變形。45第45頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三3.聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠是一種化學(xué)合成的凝膠，組成的基本單位是丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acy)，也稱之為單體，分子式(CH2＝CII-CONH2)；交聯(lián)劑是N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(N，N，-methylenebisacrylamide，簡稱bis)。丙烯酰胺和N，N二亞甲基雙丙烯酰胺在自由氧基的誘發(fā)下發(fā)生聚合反應(yīng)，在制備過程中經(jīng)過特殊工藝合成球形的聚丙酰胺凝膠珠。通過控制丙烯酰胺濃度和N，N，-亞甲基雙丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交聯(lián)度的聚丙酰胺凝膠。其部分結(jié)構(gòu)式如下。46第46頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三47第47頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)的穩(wěn)定性不如交聯(lián)的聚葡糖凝膠，它在酸性的條件下酰胺鍵容易被水解生成羧酸，使凝膠介質(zhì)帶有一定的離子交換基團(tuán)，在排阻層析時對溶液中帶電荷組分發(fā)生離子交換作用，使介質(zhì)的非特異性吸附增加。因此，聚丙烯酰胺凝膠層析應(yīng)當(dāng)盡量避免使用酸性較強(qiáng)的緩沖液。盡管目前使用的聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)在說明書上表明對酸堿溶液有較大的耐受性(在pH2～11的溶液中)，但是，如果介質(zhì)長時間處于酸性環(huán)境中還是有一定影響的。

48第48頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三最常用的聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)是Bio-Gel-P系列產(chǎn)品，它是由Bio-Rad公司生產(chǎn)的，介質(zhì)的型號不同，其交聯(lián)度也不同，分離相對分子質(zhì)量的范圍有差異。介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)見表3。49第49頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三表3聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)凝膠型號

溶脹體積／(ml／g)

排阻下限(×103)

分離范圍(Mr)

Bio-GelP～2Bio-GelP～4Bio-GelP～6Bio-GelP～10Bio-GelP～30Bio-GelP～60Bio-GelP～100Bio-GelP～150Bio-GelP～200Bio-GelP～300

3.85.88.812.414.919.019.024.034.040.0

1.63.64.6103060100150200300

2×102～2×1035×102～4×1031×103～5×1035×103～1.7×1042×104～5×1043×104～7×1044×104～1×1055×104～1.5×1058×104～3×1051×105～4×105

50第50頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

在Bio-GelP系列產(chǎn)品中，“P”后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越大，表示交聯(lián)越小，凝膠孔徑越大，相對分子質(zhì)量分離范圍越大，凝膠的溶脹體積越大。與此相反，“P”后面的阿拉伯?dāng)?shù)字越小，表示交聯(lián)越大，凝膠孔徑越小，相對分子質(zhì)量分離范圍越小，凝膠的溶脹體積越小。它與葡聚糖凝膠介質(zhì)的表示方法一樣。

51第51頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三聚丙烯酰胺凝膠的特點：具有良好的大孔性和機(jī)械強(qiáng)度，交聯(lián)后具有一定的耐受性。但在低于pH2的酸性環(huán)境中或高溫下，分子中的酰胺基易被水解產(chǎn)生羧酸；對偏酸或偏堿性的化合物及芳香族類化合物均有不同程度的吸附。52第52頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三4.瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠層析介質(zhì)瓊脂糖-聚丙烯酰胺混合凝膠層析介質(zhì)是由瓊脂糖聚丙烯酰胺按不同比例制成的混合型凝膠。它利用聚丙烯酰胺作為三維空間骨架，在骨架中間填充瓊脂糖凝膠，由于聚丙烯酰胺骨架機(jī)械性能比瓊脂糖凝膠高，制成的凝膠剛性好，孔徑大，很適合于生物大分子的分離。制備這類介質(zhì)在工藝和技術(shù)上要比制備單一材料的凝膠復(fù)雜得多。其理化性質(zhì)介于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠之間。最常用的瓊脂糖聚丙烯酰胺混合凝膠層析介質(zhì)是UltrolGelAcA系列。介質(zhì)的主要技術(shù)參數(shù)見表4。

53第53頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三表4瓊脂糖．聚丙烯酰胺混合凝膠層析介質(zhì)的主要技術(shù)參數(shù)凝膠型號

丙烯酰胺

濃度／％瓊脂糖

濃度／％

分離范圍(Mr)UltrolGelAcA22UltrolGelAcA34

UltrolGelAcA44UltrolGelAcA54

23

45

24

44

1×105～1.2×1062×104～3.5×105

1×104～1.3×1055×103～7×104

54第54頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三UltrolGel“AcA”表示合成時用的丙烯酰胺和瓊脂糖的量，其后面阿拉伯?dāng)?shù)字分別表示聚丙烯酰胺和瓊脂糖的百分濃度，阿拉伯?dāng)?shù)字越小表示丙烯酰胺和瓊脂糖濃度越低，其交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分離分子量的范圍越大。與此相反，阿拉伯?dāng)?shù)字越大表示丙烯酰胺和瓊脂糖濃度越高，其交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，分離分子量的范圍越小。交聯(lián)度的表示方法與瓊脂糖凝膠一樣。

55第55頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三三、凝膠的規(guī)格與用途凝膠排阻層析介質(zhì)根據(jù)其用途和使用的規(guī)模，具有不同的規(guī)格，也就是說在同一交聯(lián)度、同一性能的條件下的凝膠介質(zhì)有不同的規(guī)格。主要從球形介質(zhì)的直徑大小可以分為粗、中粗、中細(xì)、細(xì)、超細(xì)等幾類，但不同型號的凝膠分類略有區(qū)別，如中粗葡聚糖凝膠顆粒，直徑大小一般在40～120μm之間，而瓊脂糖凝膠顆粒，直徑大?。骸阍?0～150／μm之間。不同規(guī)格的凝膠見表5所示。56第56頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三表5不同規(guī)格的凝膠及用途

凝膠規(guī)格

粒度范圍/μm

用途

粗中粗中細(xì)細(xì)超細(xì)

100～30040～16020～8010～403～5

大規(guī)模制備或工業(yè)化生產(chǎn)析常規(guī)分析或小量制備實驗室分析測定或微量制備

微量分析超微量分析或用于HPLC填料

57第57頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三四、凝膠性能的比較不同的凝膠層析介質(zhì)，由于合成介質(zhì)的原料不同,其分辨率存在著較大的差別。例如SephadexG-75和Bio-GelP-30分離同一種樣品，SephadexG-75分離的不如Bio-GelP-30好，如圖7-1所示。同一種凝膠介質(zhì)不同型號，由于它們的交聯(lián)度不同，其分辨率也會有較大的差異。例如SephadexG-75、SephadexG-100、SephadexG-150的分辨率有較大的差異。如圖7-2所示。58第58頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三59第59頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)凝膠（排阻）層析分離條件的確定一、凝膠層析介質(zhì)的選擇1.凝膠層析介質(zhì)型號的選擇

根據(jù)相對分子質(zhì)量分離范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)，確定是組別分離還是組分分離。組別分離是指相對分子質(zhì)量之間相差很大(數(shù)十至數(shù)百倍)的樣品，如生物大分子與有機(jī)小分子或無機(jī)鹽等的分離；組分分離是指相對分子質(zhì)量之間相差較小(±2000以上)的生物大分子。60第60頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

組別分離一般選用交聯(lián)度較大的凝膠層析介質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)脫鹽可選用葡聚糖凝膠SephadexG-25或聚丙烯酰胺凝膠Bio-GelP-6、Bio-GelP-10。組分分離要根據(jù)被分離組分所預(yù)測的最大相對分子質(zhì)量的上限值和最小相對分子質(zhì)量的下限值的分離范圍來選擇合適的凝膠。如分離相對分子質(zhì)量在5000～60000之間的多種組分，可選用葡聚糖凝膠SephadexG-75或UltrolGelAcA54。61第61頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三2.凝膠粒度的選擇

選擇凝膠粒度的大小，主要是基于分離樣品是層析的規(guī)?；蛳噜弮山M分相對分子質(zhì)量的差異進(jìn)行選擇。粒度較大的凝膠介質(zhì)流速快，適于具有一定規(guī)模的分離或者組別分離，但由于其顆粒大層析時渦旋擴(kuò)散影響較大，被分離組分在柱內(nèi)容易擴(kuò)散，分辨率較低。粒度較小的凝膠介質(zhì)適于分析分離，層析時渦旋擴(kuò)散影響較小，組分在柱內(nèi)擴(kuò)散小，分辨率相對較高，但流速較慢。實驗室常用的凝膠介質(zhì)的粒度范圍是中粗級。

62第62頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三凝膠介質(zhì)粒度的均勻性也是很重要的，凝膠介質(zhì)的最大顆粒和最小顆粒的差值越小越好，說明介質(zhì)的均勻度好。均勻度好的介質(zhì)流速相對于均勻度差的介質(zhì)快，效率高。63第63頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三二、層析柱的選擇

層析柱的選擇，主要考慮被分離組分相對分子質(zhì)量的差異，選用相應(yīng)的柱長與柱內(nèi)徑之比的層析柱。對于組別分離的層析柱，由于被分離的組分相對分子質(zhì)量差別較大可采用短粗的層析柱，柱長度：柱內(nèi)徑=10：1或20：1，如脫鹽柱。對組分分級分離的層析柱，用細(xì)長的層析柱；柱長度：柱內(nèi)徑=50：1或100：1，如蛋白質(zhì)組分分離。64第64頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三三、流動相的選擇

排阻層析所使用的緩沖溶液比較簡單，一般只使用一種緩沖液。但是在選擇緩沖溶液時主要考慮3方面的因素：1.考慮被分離物質(zhì)的穩(wěn)定性，包括緩沖液的pH值、離子強(qiáng)度及保護(hù)劑等。2.考慮凝膠介質(zhì)的穩(wěn)定性能，不與介質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不變形，不降解。3.考慮分離物質(zhì)的后處理，被分離組分經(jīng)排阻層析分離后還需采用其他層析方法進(jìn)行分離(如用離子交換或親和層析分離等)，最好選用與后續(xù)層析方法相同的緩沖液。如果后處理是冰凍干燥，可選用易揮發(fā)性的溶液。如NH4HC03、HAC或NH40H等。65第65頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三四、樣液的制備

排阻層析的樣液在上樣前，要進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，去部分雜質(zhì)。樣液的濃度不宜太稀，組分不宜太多，質(zhì)量至少要相差±2000以上。

66第66頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三五、上樣體積

排阻層析的上樣量相對于其他層析方法要求更嚴(yán)格，上樣后的各個組分隨著流動相往前流動，不會停留在介質(zhì)上。各個組分的分離峰極容易產(chǎn)生擴(kuò)散效應(yīng)，流出體積只有增大，而不會減少。一般情況，對組分分離的洗脫體積是原體積的幾倍至幾十倍。因此對組分分離的上樣體積不超過柱床體積的0.5％～5％；組別分離的上樣體積不超過柱床體積的30％。67第67頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三第五節(jié)凝膠介質(zhì)的后處理

一、凝膠柱的保存

凝膠柱內(nèi)的層析介質(zhì)是浸泡在溶液中，容易長菌。尤其是葡聚糖和瓊脂糖類凝膠介質(zhì)，極易染菌，某些微生物能分泌降解多糖糖苷鍵的酶，使葡聚糖和瓊脂糖的糖苷鍵發(fā)生降解，而改變凝膠層析介質(zhì)原有的性質(zhì)。68第68頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

雖然聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)不容易被微生物所降解，但長期浸泡在溶液中容易孳生細(xì)菌，使其化學(xué)性質(zhì)發(fā)生某些變化，如發(fā)生氧化，離子化等而改變層析的特性：為了避免微生物的生長，殘留在凝膠柱內(nèi)的磷酸鹽和有機(jī)物必須要洗凈，然后將層析柱真空或低溫保存。低溫保存的溫度不能低于柱內(nèi)溶液的冰點，防止柱內(nèi)的凝膠結(jié)冰，而破壞凝膠的交聯(lián)度和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。69第69頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

防止微生物生長最常用的方法是在凝膠溶液中加人一定的抑菌劑，如0.02％疊氮鈉、0.01％～0.02％三氯丁醇、0.005％～0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉、0.001％～0.01％苯基汞代乙酸鹽、苯基汞代硝酸鹽或苯基汞代硼酸鹽等。70第70頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三二、凝膠介質(zhì)的處理與干燥

凝膠層析介質(zhì)一般不與溶液中的溶質(zhì)發(fā)生任何作用，所以在層析分離后用平衡液稍加平衡即可進(jìn)行下一次層析，但是在實際操作中常常有些雜質(zhì)污染凝膠和層析柱表面的凝膠。因此，層析柱在使用一段時間后必須做適當(dāng)?shù)奶幚?，除去凝膠表面的污染物。處理所用的溶液和溶液濃度略有不同，一般對交聯(lián)的葡聚糖凝膠類介質(zhì)可以用0.1mol／LNaOH和0.5mol／LNaCl混合處理，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠類介質(zhì)可以用0.5～1.0mol／LNaCl溶液處理。

71第71頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三凝膠層析介質(zhì)如果在較長的時間內(nèi)不再使用，可以將其干燥長期保存。使用過的凝膠層析介質(zhì)，首先按一般的再生程序?qū)⒔橘|(zhì)再生處理、漂洗干凈，然后用乙醇從低濃度到高濃度逐級脫水(先后用30％、50％、70％、80％、95％、無水乙醇、乙醚)，脫水后的介質(zhì)在室溫下晾干，將乙醚揮發(fā)盡，即可。72第72頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三第六節(jié)凝膠過濾（排阻）的分離模式一、脫鹽

在生物大分子的分離純化過程時，常用一些無機(jī)鹽或有機(jī)小分子作為洗脫劑，在洗脫液中常常含有較高濃度的鹽或其他小分子化合物，一般要將小分子和生物大分子分開，常采用透析的方法。雖然透析法操作簡單，但是費時，處理的量有限；如果采用排阻層析法除鹽，既可以節(jié)省時間，又不影響生物大分子的特性。73第73頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三74第74頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

脫鹽最常用的凝膠介質(zhì)是SephadexG-25。例如經(jīng)三氯乙酸提取的卵黏蛋白，經(jīng)SephadexG-25柱層析除去雞卵黏蛋白中的鹽，見圖8所示。蛋白質(zhì)脫鹽時，某些蛋白質(zhì)由于脫鹽后溶液中電解質(zhì)下降，導(dǎo)致其溶解度降低，有時會出現(xiàn)沉淀或被吸附在柱上洗不下來。遇見這種情況，可以用揮發(fā)性的鹽類洗脫，然后冰凍干燥。75第75頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三76第76頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三二、測定相對分子質(zhì)量凝膠排阻層析是測定相對分子質(zhì)量的一個常用的方法。使用一系列已知相對分子質(zhì)量的混合標(biāo)準(zhǔn)品在同一凝膠柱內(nèi)同一條件下進(jìn)行分離，收集每一個組分的洗脫體積，然后將每一個組分的洗脫體積對相對分子質(zhì)量的對數(shù)作圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量的工作曲線，也稱之為標(biāo)準(zhǔn)曲線。77第77頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三在同樣的條件下將未知樣品通過凝膠排阻層析分離，并獲得未知樣品的洗脫體積，用該洗脫體積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得未知樣品相對分子質(zhì)量的對數(shù)值，在查反對數(shù)就知道該樣品的相對分子質(zhì)量。如圖9所示，以牛血清蛋白(67000)、雞卵清清蛋白(43000)、糜蛋白酶原(25000)、(20000)、細(xì)胞色素(12000)為例。78第78頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三79第79頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

凝膠排阻層析是測定相對分子質(zhì)量的方法不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，操作簡單，樣品用量少，具有一定的使用價值。但是此法測定的相對分子質(zhì)量會產(chǎn)生一定偏差，線形分子和球形分子也有所不同，在同樣的條件下線形分子的結(jié)果會偏大，球形分子會偏小。凝膠排阻層析測定的相對分子質(zhì)量與生物大分子的形狀有密切的關(guān)系，如某些線形蛋白、球形蛋白、纖維蛋白和糖蛋白等。80第80頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三因此，在測定時如果未知樣品是球形分子最好選擇球形分子作標(biāo)準(zhǔn)蛋白，未知樣品是線形分子最好選擇線形分子作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，這樣產(chǎn)生的偏差相對小一些。如果對未知樣品相對分子質(zhì)量的精確測定還需要與其他相對分子質(zhì)量的測定方法進(jìn)行比較，參考其他方法做出判斷。81第81頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三三、分離蛋白質(zhì)

凝膠排阻層析是生物大分子在分離純化過程中不可缺少的一種手段，它是通過分子的質(zhì)量進(jìn)行分離唯一的一種技術(shù)。在層析方法中絕大多數(shù)都是以化合物的電荷差異進(jìn)行分離的(如離子交換層析、螯合層析、吸附層析等)或以化合物的極性進(jìn)行分離(如分配層析、反相層析、疏水層析等)。82第82頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三凝膠排阻層析可以將相對分子質(zhì)量相近、分子結(jié)構(gòu)和形狀相似的化合與其他分子分開。例如SephadexG-75柱層析可以分離相對分子質(zhì)量在3000～80000球形蛋白分子或1000～50000線形蛋白分子。用SephadexG-50柱層析從大鼠睪丸的提取液中分離金屬結(jié)合蛋白，如圖10所示。83第83頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三84第84頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三第七節(jié)應(yīng)用實例

雞卵黏蛋白相對分子質(zhì)量的測定一、原理葡聚糖凝膠SephadexG-75的相對分子質(zhì)量分離范圍在3000～80000之間。用4種已知相對分子質(zhì)量蛋白通過SephadexG-75排阻層析分離，得到相應(yīng)的洗脫峰，分別合并各洗脫峰的體積，并可計算出各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Kav,以相對分子質(zhì)量的對數(shù)lgMr為橫坐標(biāo)，Kav為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將卵黏蛋白在SephadexG-75排阻層析分離得到相應(yīng)的洗脫峰所計算出來的Kav值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的lgMr，即可知道卵黏蛋白的相對分子質(zhì)量。85第85頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三

二、試劑與材料試劑:標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，卵黏蛋白，藍(lán)色葡聚糖-2000，乙酸，乙酸鉀等。材料:SephadexG-75，層析柱(1cm×l00cm)。

86第86頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三三、操作步驟1.凝膠介質(zhì)的選擇及溶脹稱取10gSephadexG-75干粉放人500ml的燒杯中，加入200m10.025mol／L氯化鉀,0.2mol／L乙酸緩沖液，在沸水浴中熱溶脹2h，冷卻至室溫后，抽真空脫去凝膠中殘留的空氣，或在室溫下溶脹24h，真空脫氣，備用。87第87頁，共93頁，2023年，2月20日，星期三2.裝柱取一支長度為100cm，內(nèi)徑為lcm的層析柱。洗凈，向柱內(nèi)裝人1/4左右柱床體積的緩沖液，然后把溶脹處理好的SephadexG-75，一次裝入層析柱內(nèi)，在柱的下