抗生素微生物檢定法

抗生素微生物檢定法第1頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一HPLC紫外分光光度法化學(xué)滴定法效價(jià)測(cè)定第2頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一SH

SL

THTL第3頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一前言

抗生素微生物檢定法是國(guó)際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價(jià)測(cè)定方法。自20世紀(jì)40年代建立至今，在各國(guó)藥典中被普遍采用。雖然伴隨著HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素品種的效價(jià)測(cè)定已被化學(xué)方法所取代，但由于以下原因：第4頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一前言微生物檢定法可直觀、特異地反映出抗生素藥品的抗菌活性；多組分抗生素由于不同活性組分生物活性的差異，化學(xué)測(cè)定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征組分組成、含量和生物活性間的關(guān)系；許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性。

所以抗生素微生物檢定法目前在各國(guó)藥典中仍占有重要地位，且短期內(nèi)化學(xué)分析法不可能取代微生物檢定法。第5頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1定義——抗生素微生物檢定法抗生素微生物檢定法是利用抗生素在低微濃度下有選擇地抑制或殺死微生物的特點(diǎn)，以抗生素的抗菌活性為指標(biāo)，來衡量抗生素中的有效成分效力的方法。第6頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1定義——抗生素青霉素

“抗生素是微生物在代謝中產(chǎn)生的具有抑制它種微生物生長(zhǎng)活動(dòng)、甚至殺滅他種微生物的化學(xué)物質(zhì)”?！笆窃诘臀舛燃纯蓪?duì)某些生物的生命活性有特異抑制作用的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物及其衍生物”“抗生素是生物（包括微生物、植物、動(dòng)物在內(nèi)）在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的（或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的），能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱?！?/p>

由生物發(fā)酵改為化學(xué)合成（氯霉素）、全新結(jié)構(gòu)的全合成抗生素（氨曲南）抗腫瘤、抗寄生蟲等抗生素的不斷發(fā)現(xiàn)、化學(xué)改造推動(dòng)半合成抗生素的迅速發(fā)展——定義為1942年，鏈霉素的發(fā)現(xiàn)者Waksman定義：1929年Flemming發(fā)現(xiàn)第一種抗生素（）第7頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗菌活性抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力?？股氐目咕钚酝ǔＳ眯r(jià)單位來表示。在臨床應(yīng)用中，抗生素的抗菌活性可準(zhǔn)確地反映抗生素的醫(yī)療價(jià)值。硫酸鏈霉素798單位/毫克青霉素G鈉1670單位/毫克桿菌肽74單位/毫克第8頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義“活性”重量單位重量折算單位特定單位第9頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義“活性”重量單位：以抗生素中所含特定的抗菌（抗腫瘤細(xì)胞、抗病毒）活性部分的重量作為效價(jià)單位。如堿性抗生素，以純堿的量作為有效部分的量；酸性抗生素，以純酸的量作為有效部分的量。第10頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義在抗生素的生產(chǎn)、研究和應(yīng)用等方面，均以抗生素活性成分的“活性”重量計(jì)量抗生素的效價(jià)單位，采用活性成分的“活性”重量1μg＝1效價(jià)單位的方法表示?？股匦r(jià)以“單位（u）”或“微克（μg）”表示。

第11頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義例：硫酸鏈霉素抗菌活性是以鏈霉素效價(jià)單位表示的，其鏈霉素的效價(jià)單位是以具活性成分鏈霉素堿的“活性”重量表示的，即1鏈霉素效價(jià)單位＝1微克鏈霉素堿，這里是“活性微克”而不是“重量微克”。第12頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義在制成鹽類或其他衍生物后，其相應(yīng)的折算效價(jià)，可以從分子量折算而得。如：硫酸鏈霉素的折算效價(jià)為第13頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義重量折算單位：以特定的純抗生素制品的某一重量為1單位而加以折算。如：青霉素G鈉以青霉素單位也稱牛津單位（Oxfordunit）表示其抗菌活性，最初的定義為“1個(gè)青霉素效價(jià)單位（u）為能在50毫升肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)育的最小青霉素劑量”。第14頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義例：青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品第一批青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，青霉素G鈉稱重0.6微克為1單位，即1667單位/毫克。第二批青霉素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，青霉素G鈉稱重0.5988微克為1單位，即1670單位/毫克。第15頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素效價(jià)定義特定單位：這一類抗生素大都組成成分較復(fù)雜，或還不易得到純品，在開始生產(chǎn)及臨床使用時(shí)，只能以一特定量的標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌罚┳鳛?單位。如：桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品第一批桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為55單位/毫克；第二批桿菌肽國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為74單位/毫克。第16頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－抗生素微生物檢定法抗生素微生物檢定法可分為：（1）稀釋法（2）比濁法（3）瓊脂擴(kuò)散法（管碟法和打孔法）各國(guó)藥典通常采用后兩種方法測(cè)定抗生素的效價(jià)。

第17頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－稀釋法通過監(jiān)測(cè)等量的試驗(yàn)菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，觀察含不同濃度抗生素的液體培養(yǎng)基中有無細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而測(cè)定抗生素最低抑菌濃度（MIC）的方法，常用于新藥研制及臨床藥敏試驗(yàn)等方面。第18頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一12345678一一一一一一一一不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基濃稀等量的試驗(yàn)菌菌液第19頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－比濁法通過監(jiān)測(cè)等量的試驗(yàn)菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，利用分光光度法測(cè)定含不同濃度的抗生素的液體培養(yǎng)基的濁度，從而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素藥物的含量（效價(jià)）測(cè)定。第20頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－（瓊脂）擴(kuò)散法通過測(cè)定由不同濃度的抗生素溶液在含有試驗(yàn)菌固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散，而在其表面所產(chǎn)生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素藥物的含量（效價(jià)）測(cè)定。第21頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一抗生素微生物檢定方法比較：

第22頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.定義－管碟法

此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈直徑（面積）呈直線關(guān)系而設(shè)計(jì)，通過檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小，計(jì)算出供試品的效價(jià)。

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SHSL第23頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.原理－抑菌圈的形成兩種互動(dòng)作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴(kuò)散作用；另一種是試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時(shí)間，瓊脂培養(yǎng)基中的兩種互動(dòng)作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。第24頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.原理－量反應(yīng)平行線原理量反應(yīng)平行線原理：“在屬量反應(yīng)的指標(biāo)中，當(dāng)對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的作用性質(zhì)相同時(shí)，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的兩條對(duì)數(shù)劑量和反應(yīng)關(guān)系直線相互平行”。第25頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.原理－量反應(yīng)平行線原理在抗生素微生物檢定法中，一定劑量范圍內(nèi)，抗生素對(duì)數(shù)劑量與其所致抑菌圈的大小呈直線關(guān)系。這就在理論上決定了，（活性）成分相同的標(biāo)準(zhǔn)品與供試品在一定劑量范圍內(nèi)產(chǎn)生的兩條劑量反應(yīng)直線相互平行，符合量反應(yīng)平行線原理的基本要求。第26頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.原理－量反應(yīng)直線兩位微生物學(xué)者HamphreyLight和Brown推導(dǎo)出的瓊脂球面擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)公式：該方程奠定了管碟法量反應(yīng)直線公式的基礎(chǔ)。第27頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一將上述公式簡(jiǎn)化、移行，并將自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換為常用對(duì)數(shù)得：上述公式表明，抗生素總量的對(duì)數(shù)(lgM)與所形成的抑菌圈半徑的平方(r2)呈直線關(guān)系，即通過抑菌圈的大小來測(cè)定抗生素抗菌活性物質(zhì)的量。第28頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.檢定方法分類一劑量法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）二劑量法（2?2法）三劑量法（3?3法）第29頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一二劑量法（2?2法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各兩個(gè)劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗(yàn)條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對(duì)微生物產(chǎn)生的效力。二劑量法用于抗生素藥品效價(jià)的常規(guī)測(cè)定；3.1管碟法的操作步驟第30頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟預(yù)試驗(yàn)→試驗(yàn)準(zhǔn)備→雙碟底層的制備→供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→菌層的制備→滴加抗生素溶液→雙碟的培養(yǎng)→抑菌圈的測(cè)量→結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定第31頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟預(yù)試驗(yàn)：確定最佳的試驗(yàn)條件：調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定：高劑量濃度溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm。高劑量與低劑量的抑菌圈直徑之差最好不小于2mm。高低劑量之比為2:1（如高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時(shí)，可用4:1的劑量比率）。第32頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟試驗(yàn)準(zhǔn)備：雙碟、鋼管、毛細(xì)滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無菌間的紫外消毒等。第33頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟雙碟底層的制備：每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml，待培養(yǎng)基凝固，待用。第34頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：估計(jì)供試品的效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液。第35頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟菌層的制備：菌層培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中添加一定量的菌懸液，振搖混勻。注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量。每只雙碟加入5ml菌層培養(yǎng)基。注意制備菌層的速度和平整度。第36頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟滴加抗生素溶液：注意標(biāo)準(zhǔn)品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。每組雙碟至少為8個(gè)，一般為10個(gè)。在每個(gè)雙碟的4個(gè)鋼管中，對(duì)角的兩個(gè)鋼管分別滴加高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余兩個(gè)對(duì)角位置的鋼管分別滴加相應(yīng)的高、低濃度的供試品溶液。按SH→TH→SL→TL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低劑量溶液。第37頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟雙碟的培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜。第38頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟抑菌圈的測(cè)量：

將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開陶瓦蓋，將鋼管倒入1：1000新潔爾滅溶液或其他消毒液內(nèi)浸泡，檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或不圓整圈應(yīng)將碟棄去，切忌主觀挑選抑菌圈和雙碟，是結(jié)果造成偏離。抑菌圈測(cè)量?jī)x的使用：每組試驗(yàn)雙碟應(yīng)在相同的測(cè)量參數(shù)下進(jìn)行測(cè)量。手工測(cè)量：游標(biāo)卡尺第39頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定：抑菌圈測(cè)量?jī)x提供計(jì)算結(jié)果或手工計(jì)算結(jié)果。第40頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1管碟法的操作步驟培養(yǎng)后的雙碟第41頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1結(jié)果計(jì)算及判斷可靠性檢驗(yàn)抗生素微生物檢定法前提條件是：標(biāo)準(zhǔn)品S和供試品T各對(duì)數(shù)劑量與反應(yīng)呈直線關(guān)系，且標(biāo)準(zhǔn)品S和供試品T的兩條直線平行。可靠性測(cè)驗(yàn)是利用生物統(tǒng)計(jì)方法驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的量反應(yīng)關(guān)系是否顯著偏離直線、偏離平行。對(duì)在一定概率水平下不顯著偏離直線、不顯著偏離平行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為可靠，所得檢定結(jié)果有意義。第42頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1結(jié)果計(jì)算及判斷以紅霉素眼膏為例，紅霉素標(biāo)示量為0.5%，即每1g紅霉素眼膏中含5000u紅霉素。假設(shè)投料量為100%，那么估計(jì)效價(jià)為100%。試驗(yàn)采用二劑量法；劑間比為2；濃度比為1；試驗(yàn)菌為短小芽孢桿菌[CMCC（B）63202]。

第43頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1結(jié)果計(jì)算及判斷可靠性測(cè)驗(yàn)計(jì)算：結(jié)論：回歸非常顯著F2＞7.82（P＜0.01）(即不顯著偏離直線）；偏離平行不顯著F3＜4.26（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。試品間F1=0.5326P=0.05F=4.2600

回歸F2=873.2370P=0.01F=7.8200

偏離平行F3=0.2537P=0.05F=4.2600P>0.05

劑間F6=291.3411P=0.01F=4.7200碟間F7=2.1653P=0.01F=3.6700回歸（F2）表示測(cè)驗(yàn)的量反應(yīng)值是否隨劑量而有規(guī)律的增加或降低。回歸項(xiàng)變異（P<0.01）應(yīng)非常顯著，說明劑量反應(yīng)的直線關(guān)系成立，且直線的斜率滿足實(shí)驗(yàn)要求。偏離平行（F3）表示標(biāo)準(zhǔn)品量反應(yīng)直線斜率b（回歸系數(shù)）與供試品量反應(yīng)直線斜率b（回歸系數(shù)）無顯著性差異。如果F（偏離平行）（P>0.05）不顯著，則平行關(guān)系是可靠的。第44頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1結(jié)果計(jì)算及判斷抑菌圈測(cè)量值：

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碟號(hào)ds1ds2dt1dt2ym------------------------------------------------------------------------------No.118.1319.2418.0919.6375.09No.217.8519.4117.9619.6074.82No.318.1419.5518.0919.8975.67No.418.0519.8318.1019.7575.73No.518.0719.9818.2119.7075.96No.618.1519.3717.8819.5274.92No.718.1919.4617.9719.6375.25No.817.9319.8518.0619.9475.78No.918.0920.0418.3519.6776.15------------------------------------------------------------------------------yk162.60176.73162.71177.33679.37------------------------------------------------------------------------------第45頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1結(jié)果計(jì)算及判斷效價(jià)計(jì)算：碟數(shù)m=9圈數(shù)K=4估計(jì)效價(jià)At=100%劑間比r=2.0000濃度比D=1.0000對(duì)數(shù)值I=0.3010t表t=2.0640樣品方差S^2=0.0263自由度f=24R的對(duì)數(shù)M=0.0074回歸系數(shù)g=0.0049標(biāo)準(zhǔn)誤差Sm=0.0102對(duì)數(shù)比值R=1.0173R上限Rh=1.0680R下限Rl=0.9691測(cè)定效價(jià)Pt=101.7265%Pt上限Ph=1067.9584下限Pl=969.1406平均可信限率Pt的FL%=4.86%PT的可信限FL和平均可信限率FL%

可信限FL和平均可信限率FL%是反映檢定結(jié)果精密度的統(tǒng)計(jì)量。PT的可信限是PT標(biāo)準(zhǔn)誤差SM和t值（在95%的概率水平下）的乘積?？尚畔薹秶≒T±t·SM）表示對(duì)該供試品進(jìn)行100次檢驗(yàn)，95次的結(jié)果在PT＋t·SM～PT－t·SM范圍里。PT平均可信限率FL%：

FL%=(t·SM)/PT×100%中國(guó)藥典中，一般抗生素微生物檢定平均可信限率限定在5%范圍內(nèi)，個(gè)別品種放寬至7%。第46頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.1結(jié)果計(jì)算及判斷重試判定抑菌圈大小的要求可靠性檢驗(yàn)：

符合可靠性檢驗(yàn)各項(xiàng)規(guī)定后，才能認(rèn)為試驗(yàn)結(jié)果可靠，方可進(jìn)行效價(jià)和可信限率計(jì)算?？尚畔蘼剩?/p>

供試品效價(jià)測(cè)定結(jié)果（PT）的可信限率除特殊規(guī)定外，不得大于5%。實(shí)測(cè)效價(jià)與估計(jì)效價(jià)：

試驗(yàn)計(jì)算所得效價(jià)應(yīng)在估計(jì)效價(jià)的±10%以內(nèi)，即：試驗(yàn)所得效價(jià)低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%，則檢驗(yàn)結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計(jì)效價(jià)，予以重試。效價(jià)測(cè)定結(jié)果不符合規(guī)定時(shí)，需換人加倍復(fù)試。

第47頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一標(biāo)準(zhǔn)曲線法（一劑量法）：將標(biāo)準(zhǔn)品一組劑量的對(duì)數(shù)與微生物的反應(yīng)繪制成直線圖，相同條件下，測(cè)得供試品對(duì)微生物的反應(yīng)值，在標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出引起該反應(yīng)的抗生素的相對(duì)濃度及效力。一劑量法一般用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線或測(cè)定血藥濃度。3.2一劑量法第48頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－標(biāo)準(zhǔn)曲線法中心點(diǎn)濃度C0的選取中心點(diǎn)的抑菌圈直徑應(yīng)在16～17.5mm。劑距按等比級(jí)數(shù)選取。一般采用1:0.8、1:0.88、1:0.85。C0C0C0CCC第49頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－標(biāo)準(zhǔn)曲線法分組按選取的C0及劑距，一般分為8個(gè)組，即溶液濃度為C1、C2······C8。每組雙碟數(shù)應(yīng)不少于3個(gè)，一般可用5個(gè)，個(gè)別情況可增至10個(gè)。C0C0C0CCC第50頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－標(biāo)準(zhǔn)曲線法點(diǎn)樣每個(gè)雙碟安置6枚鋼管。在各組每個(gè)雙碟6枚鋼管相間隔的三個(gè)鋼管內(nèi)，均滴加C0標(biāo)準(zhǔn)液。在第一組每個(gè)雙碟的其余三個(gè)鋼管內(nèi)滴加C1的溶液，在第二組每個(gè)雙碟的其余三個(gè)鋼管內(nèi)滴加C2的溶液······滴加藥液的順序，可從中心濃度組開始向高、低兩端交叉滴加。如8個(gè)稀釋度的雙碟，滴加次序可為C4、C5、C3、C6、C2、C7、C1及C8。C0C0C0CCC第51頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－標(biāo)準(zhǔn)曲線法抑菌圈的測(cè)量雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，采用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量每組試驗(yàn)雙碟抑菌圈的直徑。結(jié)果計(jì)算及可靠性檢驗(yàn)以抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)，以濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算得到回歸直線方程相關(guān)系數(shù)：1>r≥0.99第52頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.3檢定方法三劑量法（3?3法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各三個(gè)劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，在相同試驗(yàn)條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對(duì)微生物產(chǎn)生的效力。三劑量法用于抗生素藥品的仲裁或標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定。第53頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－三劑量法基本要點(diǎn)中劑量點(diǎn)的抑菌圈直徑應(yīng)在15～18mm。三個(gè)劑量之比為1:0.8（1.25:1）。點(diǎn)樣每組雙碟至少為9個(gè)，一般為15個(gè)。在每個(gè)雙碟的6個(gè)鋼管中，互相間隔的3個(gè)鋼管分別滴加高、中、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余3個(gè)鋼管內(nèi)分別滴加相應(yīng)的高、中、低濃度的供試品溶液。按SH→TH→SM→TM→SL→TL或TH→SH→TM→SM→TL→SL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、中、低劑量溶液。第54頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－三劑量法三劑量法雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖S3：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量S2：標(biāo)準(zhǔn)品中劑量S1：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量T3：供試品高劑量T2：供試品中劑量T1：供試品低劑量第55頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作步驟－三劑量法抑菌圈的測(cè)量雙碟在規(guī)定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，采用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)量每組試驗(yàn)雙碟抑菌圈的直徑。結(jié)果計(jì)算及可靠性檢驗(yàn)第56頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.實(shí)例及操作要點(diǎn)硫酸慶大霉素第57頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法實(shí)驗(yàn)條件培養(yǎng)基：培養(yǎng)基I（pH7.8～8.0）試驗(yàn)菌：短小芽孢桿菌[CMCC(B)63202]第58頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法實(shí)驗(yàn)條件緩沖液：pH7.8磷酸鹽緩沖液取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過，在115℃滅菌30分鐘。

K2HPO4·3H2O5.59/174.18×（174.18+3×18）=7.32第59頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法實(shí)驗(yàn)條件雙碟的制備：將雙碟置于水平面上，加底層培養(yǎng)基20ml，待凝固后，加菌層培養(yǎng)基5ml，凝固后備用。菌層培養(yǎng)基中菌懸液的量約為培養(yǎng)基量的2%。加菌懸液的量可視抑菌圈大小及清晰程度進(jìn)行調(diào)節(jié)。第60頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一稱樣量的計(jì)算按標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)識(shí)效價(jià)、供試品的標(biāo)識(shí)量或估計(jì)效價(jià)計(jì)算稱樣量：第61頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：假設(shè)：硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為636單位/mg，理論計(jì)算應(yīng)精密稱取78.62mg，置50ml量瓶（636單位/mg×78.62mg≈50000單位）中，恰好為1000單位，但實(shí)際操作中一般稱量數(shù)接近即可，如精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品80.10mg。第62頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：80.10mg[水]50ml制成1018.87單位/ml①精密量取①5mlbuffer50ml制成101.887單位/ml②精密量?、?mlbuffer50ml制成10.189單位/ml精密量?、?mlbuffer100ml制成5.094單位/ml慶大霉素2～12單位/ml第63頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：供試品溶液的制備（原料）：根據(jù)硫酸慶大霉素原料的估計(jì)效價(jià)計(jì)算供試品的稱樣量。假設(shè)：供試品的估計(jì)效價(jià)為590單位/mg，則稱樣量為50000/590=84.74mg，但實(shí)際取樣量為84.24mg，第一步稱樣置50ml量瓶中，實(shí)際估計(jì)效價(jià)為80.10mg×636u/mg/84.24mg＝604.7436單位/mg。第64頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：84.24mg[水]50ml①精密量?、?mlbuffer50ml②精密量?、?mlbuffer50ml精密量?、?mlbuffer100ml第65頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：供試品溶液的制備（制劑）片劑：取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（根據(jù)平均片重及標(biāo)示量折算，約相當(dāng)于慶大霉素0.1g）,如為糖衣片，取5片，全部研細(xì)，加滅菌水振搖使硫酸慶大霉素溶解，并稀釋成每1ml中約含1000單位的懸浮液，搖勻，靜置，取上清液適量，照硫酸慶大霉素項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定。第66頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：平均片重為0.1357g規(guī)格為40mg(4萬單位)暫估計(jì)其標(biāo)示量為95%第一步需制成1000單位/ml溶液，擬取供試品10萬單位為：100000×0.1357g/(40000×95%)=0.3618g，實(shí)際稱取0.3702g，則實(shí)際估計(jì)標(biāo)示量為：第67頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典硫酸慶大霉素二劑量法操作步驟：用鋼管放置器或適宜方法等距離均勻放置不銹鋼小管，并靜置5～10分鐘，使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下沉穩(wěn)定后，再滴加抗生素溶液。

每次以5個(gè)雙碟為一“小分隊(duì)”滴加藥液。滴加溶液：按SH→TH→SL→TL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低劑量溶液?？梢允垢叩蛣┝康囊志χ睆讲町愶@著，從而提高檢定靈敏度。培養(yǎng)溫度和時(shí)間：培養(yǎng)溫度為35～37℃，培養(yǎng)時(shí)間為14～16h。結(jié)果計(jì)算：測(cè)定抑菌圈，進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，計(jì)算效價(jià)，可靠性檢查若能通過，且可信限率不超過7%，則試驗(yàn)數(shù)據(jù)有效。如果所測(cè)得的效價(jià)結(jié)果低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于110%時(shí)，則檢驗(yàn)結(jié)果只作為初試，應(yīng)調(diào)整供試品估計(jì)效價(jià)，重新試驗(yàn)。第68頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一平均可信限率不大于7%的品種紅霉素、琥乙紅霉素、依托紅霉素克拉霉素硫酸西索米星硫酸奈替米星硫酸依替米星硫酸慶大霉素硫酸小諾霉素第69頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作要點(diǎn)第一步一般應(yīng)制成500或1000單位/毫升的溶液，以后逐步稀釋至供試濃度的溶液，每步稀釋的量取量以不少于2ml為宜，稀釋步驟應(yīng)少于3步。溶解：對(duì)于需用乙醇溶解的樣品，由于溶解樣品時(shí)所用乙醇量較大，加滅菌水后溶液放熱，因此需充分搖勻后加滅菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室溫后再稀釋至刻度。第70頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作要點(diǎn)培養(yǎng)基的pH值，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大，使用時(shí)培養(yǎng)基的pH值應(yīng)調(diào)節(jié)到適合該品種試驗(yàn)的最佳范圍。通常滅菌后的pH值范圍為7.8～8.0或6.5～6.6。對(duì)堿性抗生素而言，在偏堿性條件下它的抗菌活力強(qiáng)，如氨基糖苷類的鏈霉素在pH值7.8以上時(shí)活力強(qiáng)，抑菌圈清晰，當(dāng)抑菌圈偏小時(shí)，可考慮把培養(yǎng)基的pH值適當(dāng)調(diào)高至8.0或更高些。對(duì)酸性或兩性抗生素，在酸性條件下它的抗菌作用強(qiáng)，使用pH值6.5～6.6培養(yǎng)基為合適。通常滅菌后pH值會(huì)下降0.2左右，因此pH值應(yīng)略高0.2～0.4。調(diào)節(jié)時(shí)要注意逐漸加堿，防止過量，否則再加鹽酸矯正，將會(huì)增加培養(yǎng)基的含鹽量，從而降低培養(yǎng)基的使用效果。第71頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作要點(diǎn)

試驗(yàn)菌的菌齡對(duì)抑菌圈有一定影響。故檢定時(shí)應(yīng)保持菌種及菌液的新鮮。一般菌種一月轉(zhuǎn)種一次，冰箱冷藏保存。對(duì)易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進(jìn)行單菌分離；其他菌株可半年分離一次。試驗(yàn)菌傳代最好不超過5次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后，應(yīng)在65℃加熱30分鐘，使菌體的菌齡一致，用革蘭氏染色，應(yīng)有芽孢85%以上。第72頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作要點(diǎn)加入菌懸液的體積，一般不少于0.3ml，并且不大于上層培養(yǎng)基體積的2%。如果加入菌懸液的體積過小，則在同樣實(shí)驗(yàn)中，不同次加入菌懸液的體積相差較大，造成實(shí)驗(yàn)誤差；如果加入菌懸液的體積過大，則會(huì)使上層培養(yǎng)基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養(yǎng)基中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊，影響測(cè)定結(jié)果。對(duì)于加入菌懸液體積的控制，可通過調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來實(shí)現(xiàn)。第73頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作要點(diǎn)在制備菌層培養(yǎng)基時(shí)，將菌液加入菌層培養(yǎng)基后，立即充分搖勻，但應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。加入芽孢懸液時(shí)，菌層培養(yǎng)基的溫度為65℃，對(duì)非芽孢懸液時(shí)，菌層培養(yǎng)基的溫度一般為48～50℃。放置孵箱培養(yǎng)時(shí)排放應(yīng)不得超過三層，避免因培養(yǎng)溫度不均勻而導(dǎo)致各雙碟中抑菌圈大小不一。第74頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.檢定的影響因素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的同質(zhì)性抑菌圈質(zhì)量的控制直線斜率的控制直線截距的控制第75頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－標(biāo)準(zhǔn)品與供試品同質(zhì)抗生素效價(jià)測(cè)定方法依據(jù)的原理是量反應(yīng)平行線原理，即標(biāo)準(zhǔn)品與供試品劑量的反應(yīng)直線是相互平行的。如不平行，則斜率不等，計(jì)算結(jié)果將產(chǎn)生較大的誤差。第76頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－標(biāo)準(zhǔn)品與供試品同質(zhì)多組分抗生素標(biāo)準(zhǔn)品所含的抗菌活性物質(zhì)或影響抗菌活性（增強(qiáng)或拮抗）物質(zhì)的量與供試品有所不同，則可使量反應(yīng)直線不平行。用于標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液制備的緩沖溶液pH、鹽濃度不相同。供試品中所含有的如維生素、氨基酸、無機(jī)鹽或其他生長(zhǎng)物質(zhì)，而標(biāo)準(zhǔn)品中沒有，在營(yíng)養(yǎng)條件低的培養(yǎng)基上即會(huì)產(chǎn)生影響。某些對(duì)光敏感的多烯類抗生素在標(biāo)準(zhǔn)品、供試品溶液配制，及試驗(yàn)過程中應(yīng)注意避免光線直射。有差向異構(gòu)特性的抗生素在測(cè)定時(shí)，尤其注意pH、鹽濃度、溫度和光照對(duì)抗生素差向化的影響，保證標(biāo)準(zhǔn)品與供試品在相同條件下進(jìn)行測(cè)定，以消除影響。（如四環(huán)素在1mol/L磷酸鹽或枸櫞酸鹽緩沖液中，pH3.2（23℃）時(shí)可形成55%差向四環(huán)素異構(gòu)體，它的活性相當(dāng)于四環(huán)素的5%，造成二者反應(yīng)直線不平行）第77頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－標(biāo)準(zhǔn)品與供試品同質(zhì)“乙酰吉他霉素”是以“吉他霉素”來表征其抗菌活性的，日抗基有收載，效價(jià)測(cè)定時(shí)以“吉他霉素”為標(biāo)準(zhǔn)品，將“乙酰吉他霉素”水解24小時(shí)后再進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定時(shí)曾發(fā)現(xiàn)測(cè)定結(jié)果的誤差較大，重現(xiàn)性差。采用HPLC法對(duì)乙酰吉他霉素水解后的組分進(jìn)行測(cè)定，以考察其是否水解為吉他霉素。第78頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一乙酰吉他霉素乙酰吉他霉素水解24小時(shí)吉他霉素組分第79頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一結(jié)果顯示，乙酰吉他霉素經(jīng)24小時(shí)水解后并未轉(zhuǎn)變?yōu)榧顾?，并與乙酰吉他霉素的成分也不同，提示采用吉他霉素為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定乙酰吉他霉素效價(jià)時(shí)，吉他霉素標(biāo)準(zhǔn)品與乙酰吉他霉素水解后的樣品的成分不同，易引起實(shí)驗(yàn)誤差。根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的同質(zhì)性，改用乙酰吉他霉素為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品與供試品同時(shí)水解后測(cè)定，減小了誤差。第80頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一水解條件的修訂琥乙紅霉素水解條件由：（CP2000）→（CP2005）依托紅霉素（CP2000）→（CP2005）→（CP2010）室溫2h室溫16h或40℃6h室溫2h37℃6h60℃4h第81頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－抑菌圈質(zhì)量的控制抑菌圈的形狀抑菌圈大小的控制抑菌圈邊緣清晰度的控制第82頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－抑菌圈質(zhì)量的控制抑菌圈的形狀：實(shí)驗(yàn)中抑菌圈常多有破裂、不圓、甚至無圈的現(xiàn)象，其原因是多方面的：在滴加抗生素溶液時(shí)藥液濺出、毛細(xì)滴管碰到鋼管壁使抗生素溶液漏出，抑菌圈出現(xiàn)不圓；雙碟、鋼管、鋼管放置器內(nèi)有殘留抗生素污染（如慶大霉素、平陽霉素等容易吸附在鋼管、玻璃儀器的表面），出現(xiàn)細(xì)菌不生長(zhǎng)，或者有多余的抑菌圈產(chǎn)生，或者抑菌圈非正常的變大；試驗(yàn)菌菌齡過老、菌層培養(yǎng)基加菌液時(shí)培養(yǎng)基溫度過高，將檢定菌燙死等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌不生長(zhǎng)；稀釋抗生素溶液所用緩沖液的pH值和鹽濃度也可影響抑菌圈的圓整，如氨基糖苷類抗生素，當(dāng)緩沖液的pH值偏低、鹽濃度偏高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)無抑菌圈或呈向心形、橢圓形抑菌圈。第83頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－抑菌圈質(zhì)量的控制抑菌圈大小的控制

M=C0V當(dāng)抗生素濃度C0不變時(shí)，體積V（即加樣量）的對(duì)數(shù)與抑菌圈直徑或面積呈直線關(guān)系，故鋼管中滴加抗生素的體積應(yīng)一致。鋼管（截面積A，高度L）的大?。ㄖ亓?、直徑、高度）應(yīng)嚴(yán)格控制。第84頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－抑菌圈質(zhì)量的控制抑菌圈大小的控制抑菌圈大小受T值（抗生素?cái)U(kuò)散時(shí)間，即細(xì)菌剛生長(zhǎng)到顯示抑菌圈所需的時(shí)間）增減的影響，故預(yù)先延長(zhǎng)抗生素的擴(kuò)散時(shí)間可使抑菌圈變大。第85頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一操作中若各鋼管中加液時(shí)間不同，差值為?t，則T變成T＋?t，此時(shí)可影響抑菌圈的大小不均一，所以一組雙碟加樣時(shí)，應(yīng)盡量縮短加樣間隔時(shí)間，并保持加樣速度的均勻性，以減少誤差。抑菌圈的大小還受抗生素?cái)U(kuò)散系數(shù)D的影響，若在緩沖液中加入0.3%的氯化鈉或在培養(yǎng)基中加一定量的鹽或吐溫，可增加抗生素的擴(kuò)散能力，使抑菌圈增大。第86頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－抑菌圈質(zhì)量的控制抑菌圈邊緣清晰度的控制抑菌圈邊緣清晰度是影響測(cè)定結(jié)果的重要因素之一，導(dǎo)致抑菌圈邊緣不清晰的原因有多種：在抑菌圈形成過程中抗生素的擴(kuò)散系數(shù)紊亂、不均一，不符合動(dòng)力學(xué)公式中各項(xiàng)之間的關(guān)系或各擴(kuò)散系統(tǒng)交叉所致。如試驗(yàn)菌種放置時(shí)間過長(zhǎng)，菌群中個(gè)體的生長(zhǎng)周期不同，對(duì)抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成雙圈或多圈，使邊緣模糊不清。培養(yǎng)基原材料的成分及質(zhì)量、pH值、鹽濃度及培養(yǎng)時(shí)間均可影響抑菌圈邊緣的清晰度。多組分抗生素中，各組分抗菌活性的不同，擴(kuò)散系數(shù)也不同，其交叉作用影響抑菌圈邊緣的清晰度。

第87頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－斜率的控制由公式中斜率（）來推算：反應(yīng)直線的斜率愈小愈好，因?yàn)樾甭试叫?，直線越平穩(wěn)，抗生素效價(jià)的微弱差別，可導(dǎo)致抑菌圈大小的差別較大，使測(cè)定結(jié)果更精確。如擴(kuò)散快，即擴(kuò)散系數(shù)D值大，則斜率??；如細(xì)菌生長(zhǎng)慢，時(shí)間長(zhǎng)，T值大，則斜率小。如擴(kuò)散系數(shù)D值不變，T值變小，則試驗(yàn)菌生長(zhǎng)快，時(shí)間短，斜率就大，這樣生物反應(yīng)的靈敏度低，重現(xiàn)性差。為使T值增大，可在滴加藥液后，在室溫放置約1小時(shí)，再置孵箱培養(yǎng)。

第88頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.影響因素－直線截距的影響相同濃度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效價(jià)測(cè)定的靈敏度高。截距的大小取決于數(shù)值，除溫度、擴(kuò)散系數(shù)和抗生素最低抑菌濃度對(duì)截距有影響外，培養(yǎng)基厚度H也是影響因素之一。培養(yǎng)基厚度越薄，截距減小，抑菌圈增大，所以在制備雙碟時(shí)，應(yīng)保持在相同的試驗(yàn)組內(nèi)，每只雙碟中底層和菌層培養(yǎng)基的厚度應(yīng)保持一致性和均勻性。第89頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一管碟法特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：基本操作和設(shè)計(jì)適用于各種抗生素，試驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定；樣品用量少，靈敏度高；適合于大批樣品的測(cè)定。第90頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一管碟法特點(diǎn)缺點(diǎn):凡具有抗菌活性的物質(zhì)都會(huì)干擾測(cè)定結(jié)果；試驗(yàn)過程長(zhǎng)，需第二天才有結(jié)果；操作手工化，需熟練人員才能得到較正確的結(jié)果；受擴(kuò)散因素的影響，如培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量，一般瓊脂中的雜質(zhì)可能影響擴(kuò)散速度及效價(jià)強(qiáng)度。第91頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一0個(gè)（cp2000)

1個(gè)（cp2005）22個(gè)（cp2010)比濁法第92頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一比濁法定義基本原理應(yīng)用舉例操作步驟注意事項(xiàng)檢定的影響因素比濁法的特點(diǎn)和儀器第93頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一1.比濁法的定義中國(guó)藥典2005年版的定義：本法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。第94頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.檢定原理基本原理：細(xì)菌接種于澄清的營(yíng)養(yǎng)豐富的液體培養(yǎng)基中，在一定的溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，變渾濁，其渾濁程度與細(xì)菌數(shù)的增加、細(xì)菌群體質(zhì)量的增加和細(xì)菌群體細(xì)胞容積的增大之間存在著直接的關(guān)系。當(dāng)一定的光束照射其已經(jīng)渾濁的液體培養(yǎng)基時(shí)，通過測(cè)定其透過率就知道細(xì)菌生長(zhǎng)情況，在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，劑量響應(yīng)為一直線。因此，在劑量響應(yīng)曲線的直線范圍內(nèi)，可設(shè)計(jì)比濁法測(cè)定抗生素含量。第95頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.檢定原理細(xì)菌的群體生長(zhǎng)期的選擇：細(xì)菌的群體生長(zhǎng)的整個(gè)變化過程大致可劃分為如下階段或時(shí)期：（A）誘導(dǎo)期（延滯期）（B）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（C）穩(wěn)定期（D）死亡期第96頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.檢定原理(A)誘導(dǎo)期（延滯期）：

本階段為增殖準(zhǔn)備期，細(xì)胞處于適應(yīng)時(shí)期，本階段時(shí)間的長(zhǎng)短受多種因素的影響。當(dāng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，新鮮，培養(yǎng)條件適宜，接種的培養(yǎng)物又具有很強(qiáng)的活力時(shí)，時(shí)間將會(huì)縮短，反之，則時(shí)間延長(zhǎng)。本階段內(nèi)各種酶合成旺盛，體積增大。(B)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：在誘導(dǎo)期后，細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)、恢復(fù)，在提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)條件下，細(xì)胞數(shù)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)速率，此時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)率是細(xì)胞數(shù)、基質(zhì)的濃度與抑菌物質(zhì)濃度三者的函數(shù)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)率一般是一個(gè)常數(shù)。第97頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.檢定原理（C）穩(wěn)定期：本階段細(xì)胞增長(zhǎng)率逐步下降到零，一部分細(xì)胞繁殖、生長(zhǎng)，另一部分細(xì)胞死亡，趨于平衡。

（D）死亡期：

細(xì)菌細(xì)胞的死亡率超過增長(zhǎng)率，細(xì)胞總數(shù)開始減少，主要是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏、代謝產(chǎn)物的毒性、自溶酶的產(chǎn)生而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞溶解或死亡。第98頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一2.檢定原理測(cè)定時(shí)間的選擇劑量－反應(yīng)平穩(wěn)生長(zhǎng)時(shí)間段：一定抗生素濃度范圍內(nèi)，檢定菌在單位時(shí)間內(nèi)的生長(zhǎng)速度相同，即生長(zhǎng)速率相同，也就是在一段時(shí)間內(nèi)反應(yīng)－培養(yǎng)時(shí)間(A-t)呈顯著的直線關(guān)系，且在不同抗生素濃度下的生長(zhǎng)速率也相同。第99頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一3.應(yīng)用舉例第100頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典2005版比濁法品種：

硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定

抗生素試驗(yàn)菌培養(yǎng)基滅菌緩沖液pH值抗生素濃度范圍單位/ml培養(yǎng)類別條件

編號(hào)pH值溫度/℃慶大霉素金黃色葡萄球[CMCC(B)26003III7.0~7.27.80.15~1.035~37第101頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定：（1）試驗(yàn)菌液的配制：取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在35～37℃培養(yǎng)20～22小時(shí)后，用0.9%滅菌氯化鈉溶液洗下菌苔，并用0.9%滅菌氯化鈉溶液稀釋，使其在650nm波長(zhǎng)處的吸收值為1.0。（2）含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基配制：取試驗(yàn)菌液1.5ml置100mlpH7.0～7.2培養(yǎng)基III中，搖勻，備用。臨用前，取規(guī)定的試驗(yàn)菌懸液適量（35～37℃培養(yǎng)3～4小時(shí)后測(cè)定的吸光度在0.3～0.7之間，且劑距為2的相鄰劑量間的吸光度差值不小于0.1），加入到各規(guī)定的液體培養(yǎng)基中，混合。使在實(shí)驗(yàn)條件下能得到滿意的劑量-反應(yīng)關(guān)系和適宜的測(cè)定濁度。已接試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基應(yīng)立即使用。第102頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定：（3）緩沖液：pH7.8磷酸鹽緩沖液第103頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定：陽性對(duì)照：取1支試管，加入滅菌水1.0ml，再加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml。陰性對(duì)照（空白對(duì)照）：取1支試管，加入滅菌水1.0ml，再加入含試驗(yàn)菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即加入甲醛溶液0.5ml，混勻，作為吸光度測(cè)定的空白液。第104頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一中國(guó)藥典2005年版硫酸慶大霉素的效價(jià)測(cè)定：（4）效價(jià)測(cè)定：供試品溶液的配制：取慶大霉素制劑適量，精密稱定，按標(biāo)示量用滅菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液適量，用pH7.8磷酸鹽緩沖液稀釋成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：取慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用滅菌水制成1000u/ml的溶液，精密量取溶液適量，用pH7.8磷酸鹽緩沖液稀釋成0.4和0.8u/ml(1:2)的溶液。分別精密量取高低劑量的供試品溶液和對(duì)照品溶液各1.0ml，置滅菌試管中，每個(gè)濃度6管，分別加入實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基9.0ml，立即搖勻，置37℃水浴培養(yǎng)3～4小時(shí)，取出，立即加入甲醛溶液，搖勻，照分光光度法，在530nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法（附錄XIV）中的2.2法計(jì)算，同時(shí)與管碟法進(jìn)行了比較，結(jié)果如下：第105頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一測(cè)定結(jié)果的比較第106頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟：

預(yù)試驗(yàn)→試驗(yàn)準(zhǔn)備→供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→菌液培養(yǎng)基的制備→加抗生素溶液→比色管的培養(yǎng)→菌濃度的測(cè)量→結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定第107頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟預(yù)試驗(yàn)：確定最佳的試驗(yàn)條件：調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)基等，使高、低劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的菌液濃度的吸收值在0.3~0.7范圍；高、低劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的菌液濃度的吸收值的差值大于0.1為佳。第108頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟試驗(yàn)準(zhǔn)備：

比色管、攪拌轉(zhuǎn)子、塞子的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無菌間的紫外消毒等。

第109頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：估計(jì)供試品的效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液。第110頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟菌液培養(yǎng)基的制備：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入液體培養(yǎng)基的菌液量，注意制備菌液與培養(yǎng)基充分混勻。第111頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟加抗生素溶液：

在比色管中定量加入抗生素溶液后，再定量加入菌液培養(yǎng)基，混勻后，在規(guī)定溫度培養(yǎng)。第112頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一4.比濁法的操作步驟菌濃度的測(cè)量：

在530nm或其他波長(zhǎng)(580nm)處測(cè)定各比色管的菌液濃度，注意測(cè)定時(shí)間的一致性。結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)結(jié)果第113頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.注意事項(xiàng)：加菌量的影響：加菌量的多少（0.25%、0.5%、1.0%），影響培養(yǎng)至適宜的菌液測(cè)定濃度所用的時(shí)間，加菌量過少，則測(cè)定時(shí)可利用的濃度范圍窄。各抗生素各濃度之間的吸收度的差值在0.1以上為佳，此時(shí)菌液對(duì)不同濃度的抗生素敏感，測(cè)定誤差較低。第114頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.注意事項(xiàng)：比色池的清潔：測(cè)定用的比色管需用硝酸－硫酸（5：95）浸泡并用蒸餾水沖洗干凈，不要有污漬和劃痕，與分光光度計(jì)的試管要匹配，要清除抗生素殘留和清洗液的痕跡，除去纖維等雜質(zhì)。第115頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.注意事項(xiàng)時(shí)間的一致性：主要是使每管的培養(yǎng)時(shí)間相等，實(shí)驗(yàn)時(shí)在試管中加入含試驗(yàn)菌液的培養(yǎng)基后，應(yīng)立即加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，混合均勻。必要時(shí)可先將培養(yǎng)基冷卻至2～4℃左右，再接種菌種，并在此溫度下，將含菌培養(yǎng)基加至各試管中，可避免加注試管先后的誤差。培養(yǎng)終止時(shí)將各管同時(shí)放入冰浴中，并盡快加入甲醛溶液滅活，使各試驗(yàn)管的培養(yǎng)時(shí)間一致。第116頁，共134頁，2023年，2月20日，星期一5.注意事項(xiàng)測(cè)定時(shí)氣泡的影響：在測(cè)定比濁法讀數(shù)前必須將培養(yǎng)基充分搖勻才能準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌的濃度，但振搖產(chǎn)生的氣泡嚴(yán)重干擾了測(cè)定結(jié)果。如在充分搖勻后放置一段時(shí)間，待氣泡消失后再進(jìn)行測(cè)定，雖然仍可逐漸下沉，但其誤差較小。第117頁，共134頁，