本檢驗亂七八糟

畢業(yè)論文

申請人：王麗媛醫(yī)學檢驗系09級（本)19班18號指導教師：沈薇S100A4基因真核表達載體構建及其在細胞中的表達前言實驗材料實驗方法及結果討論參考文獻前言胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。目前胃癌的治療方法主要為手術及輔助化療，但傳統(tǒng)的化療副作用大，研發(fā)新的輔助治療方法對胃癌治療具有重要意義。深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制，將有助于研發(fā)更有效的診斷及治療方法。前言S100A4蛋白是S100蛋白家族的成員之一，由101個氨基酸組成，分子量約11kDa。S100A4的表達可見于多種人類腫瘤，其表達與胃癌浸潤、淋巴結轉移密切相關，但S100A4基因在胃癌中的作用機制仍不十分清楚。

本研究擬通過RT-PCR與基因重組技術,構建重組真核表達載體pcDNA3.1-S100A4,轉染胃癌細胞系MKN1,為深入研究S100A4對胃癌細胞生物學功能的影響及在胃癌發(fā)病中的作用奠定實驗基礎。前言前言實驗材料實驗方法及結果討論參考文獻實驗材料人胃粘膜上皮細胞系GES-1；人胃癌細胞系MKN1克隆載體pMD18-TsimpleVector;真核表達載體pcDNA3.1（+）

大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞TRIZOLReagent;反轉錄試劑盒；PCRKit;膠回收純化試劑盒;質粒提取試劑盒

脂質體LipofectamineTM2000;限制性核酸內切酶RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清前言實驗材料實驗方法及結果討論參考文獻實驗方法S100A4基因真核表達載體的構建及其在細胞中的表達③重組S100A4在胃癌細胞MKN1中的表達(RT-PCR)②pcDNA3.1-S100A4真核表達載體構建①構建S100A4編碼區(qū)克隆載體（一）構建S100A4編碼區(qū)克隆載體：

1.提取胃粘膜上皮細胞GES-1總RNA,反轉錄合成cDNA第一鏈，PCR擴增S100A4編碼區(qū)序列；擴增片段長度327bp。所用引物序列如下：5'-CCCAAGCTTGTCATGGCGTGCCCT-3'；5'-CGCGGATCCTCATTTCTTCCTGGGCT-3'PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳確認，應用膠回收試劑盒回收、純化目的片段。實驗結果1實驗方法2.構建pMD18-Tsimple-S100A4克隆載體；

PCR產物連接入pMD18-Tsimple載體轉化感受態(tài)細胞提取質?？寺‘a物的PCR、酶切、測序鑒定

實驗結果2實驗方法

(二)pcDNA3.1-S100A4真核表達載體構建：

重組質粒pMD18-Tsimple-S100A4以BamHI/HindⅢ雙酶切，與經BamHI/HindⅢ雙酶切的真核表達載體pcDNA3.1(+)連接，轉化，篩選重組克隆并提取質粒，酶切鑒定。實驗結果3實驗方法（三）重組S100A4在胃癌細胞MKN1中的表達：

1.應用脂質體介導技術進行細胞轉染。在胃癌細胞系MKN1中轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體，以轉染pcDNA3.1空載體和正常未轉染的MKN1細胞作為對照。2.RT-PCR方法檢測轉染后細胞內S100A4mRNA表達。相關引物序列：實驗結果4實驗方法引物序列

S100A4F5’-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3’R5’-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3’

β-actinF5’-CTCTTCCAgCCTTCCTTCCT-3’R5’-CACCTTCACCgTTCCAgTTT-3’實驗結果(1)RT-PCR進行S100A4基因片段的擴增將RT-PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳可見預期的327bp大小的基因片段，

圖1S100A4基因RT-PCR擴增結果：M:DL2000marker;1.RT-PCR擴增S100A4基因實驗結果（2）S100A4基因的序列測定

PCR產物連接克隆載體測序結果顯示與GeneBank公布序列一致，無突變（見圖2）實驗結果（3）pcDNA3.1-S100A4表達載體的構建

構建的pcDNA3.1-S100A4載體經HindⅢ/BamHI雙酶切鑒定結果見圖3。由結果可以確定真核表達載體pcDNA3.1-S100A4構建成功。圖3pcDNA3.1-S100A4載體雙酶切。M:DL2000marker;1.pcDNA3.1-S100A4;2.pcDNA3.1-S100A4載體雙酶切結果；實驗結果（4）pcDNA3.1-S100A4表達載體的鑒定

在胃癌細胞系MKN1中轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體，以轉染pcDNA3.1空載體和正常未轉染的MKN1細胞作為對照。結果表明轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體48小時后，S100A4mRNA表達水平明顯升高（如圖4）。圖4，轉染pcDNA3.1-S100A4

表達載體后S100A4的表達。M:DL2000marker;1：未轉染的正常MKN1細胞；2:轉染pcDNA3.1-empty陰性對照；3：轉染pcDNA3.1-S100A4前言實驗材料實驗方法及結果討論參考文獻討論S100A4與腫瘤：

S100A4蛋白是S100蛋白家族的成員之一，許多研究表明S100A4在多種腫瘤表達高于癌旁組織，如：乳腺癌、結腸癌、胰腺癌、甲狀腺癌等，并且與腫瘤不良預后相關。討論S100A4參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，其在腫瘤中作用的分子機制是目前研究的熱點。由此我們推測：如能通過實驗性過表達的方法改變S100A4表達，檢測其對腫瘤細胞生物學特性的影響，將有助于進一步證實S100A4在腫瘤中的作用。討論

pcDNA3.1-S100A4真核表達載體的構建：本實驗利用RT-PCR及基因重組技術，成功構建了真核表達載體pcDNA3.1-S100A4。它的構建有助于我們通過細胞轉染手段，將S100A4導入細胞內，讓S100A4在胃癌細胞中高度表達，為進一步研究S100A4對胃癌的增殖，侵襲及凋亡等生物學特性的影響提供良好的基礎。重組S100A4在胃癌細胞MKN1中的表達應用脂質體介導技術進行細胞轉染。在胃癌細胞系MKN1中轉染cDNA3.1-S100A4表達載體（以轉染pcDNA3.1空載體和正常未轉染的MKN1細胞作為對照）。結果表明轉染pcDNA3.1-S100A4表達載體48小時后，S100A4mRNA表達水平顯著升高，說明構建的質粒轉染到細胞內并成功表達。本實驗為研究S100A4

在胃癌發(fā)病中的作用以及進一步探索S100A4

基因是否作為胃癌診治的靶標奠定了實驗基礎。討論參考文獻[1]FengG,XuX,YoussefEM.DiminishedexpressionofS100A2,aputativetumorsuppressor,atearlystageofS100A2humanlungcarcinogenesis.CancerRes,2001,61:7999-8004.[2]LuoX,SharffKA,ChenJ，etal.S100A6expressionandfunctioninhumana.ClinOrthopRelatRes,2008,466:2060-2070.[3]DonatoR.SLOO.Amuitigenicfamilyofcalcium-modulatedproteinsofEF-handtypewithintracellularandextra-cellularfunctionalroles.TntJBiochemCellBiol,2001,33:637668.[4]姬俊芳.S100蛋白家族與腫瘤.國外醫(yī)學(腫瘤學分期),2002,29:261-263.[5]IngoM,ArminV,AndreasZ,etal.GeneticAnalysisoftheEpidermalDifferentiationComplex(EDC)onHumanChromosome1q21:ChromosomalOrientation,NewMarkers,anda6-MBYACContig.Genomics,1996,37:295-302.[6]SherbetGV,LakshmMS.S100A4(MTSI)calciumbindingproteinincancergrowth,invasionandmetastasis.AnticancerRes,1998,8:2415-2421參考文獻[7]IsmailNI,KaurG,HashimH,etal.S100A4overexpressionprovestobeindependentmarkerforbreastcancerprogression.CancerCellInt,2008,8:2867-2889.[8]RostyC,UekiT,ArganiP,etal.OverexpressionofS100A4inpancreaticductaladenocarcinomasisassociatedwithpoordifferentiationandDNAhypomethylation.AmJPathol,2002,160:45-50.[9]YonemuraY,EndouY,KimuraK,etal.InverseexpressionofS100A4andE-cadherinisassociatedwithmetastaticpotentialingastriccancer.ClinCancerRes,2000,6:4234-4242.[10]ItoY,YoshidaH,TomodaC,etal.S100A4expressionisanearlyeventofpapillarycarcinomaofthethyroid.Oncology,2004,67:397-402.[11]PedersenKB,AndersenK,FodstadO,etal.Sensitizationofinterferon-gammainducedapoptosisinhumanacellsbyextracellularS100A4.BMCCancer,2004,19;4:52.[12]GaoXN,TangSQ,ZhangXF,etal.S100A4antisenseoligodeoxynucleotidesuppressesinvasivepotentialofneuroblastomacells.JPediatrSurg,2005,40:648-652.[13]HuaJ,ChenD,FuH,etal.ShorthairpinRNA-mediatedinhibitionofS100A4PromotesapoptosisandsuppressesproliferationofBGC823gastr