基因組分析和醫(yī)學(xué)應(yīng)用

基因組分析和醫(yī)學(xué)應(yīng)用第一節(jié)基因組學(xué)基礎(chǔ)人類基因組人類基因組特點(diǎn)基因(Gene)是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA或RNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，是控制遺傳性狀的基本遺傳單位。1909年丹麥學(xué)者WL.約翰森提出了基因這一名詞?；蚪M(Genome)泛指一個生命有機(jī)體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體(單倍體)DNA。基因組(genomes)一詞是1920年Winkles從GENes和chromosOMEs組成的?；蚪M學(xué)(Genomics)是研究基因組結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)。具體指發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機(jī)程序，分析生命體(包括人類)全部基因組結(jié)構(gòu)和功能o1986年美國科學(xué)家ThomasRoderick提出了基因組學(xué)(Genomics)人類基因組特點(diǎn)?人類基因組單倍體約含有3x109個堿基對。?由線性DNA與蛋白質(zhì)組成染色體結(jié)構(gòu)。?含有大量重復(fù)順序?；蚪M中大約只有2%-5%為編碼序列，約含3萬個基因。?單拷貝基因(占基因組50-80%)多數(shù)只在分化細(xì)胞中翻譯為專一蛋白質(zhì)，如胰島素基因在胰島p細(xì)胞表達(dá)。因?yàn)檫@些基因只在極少數(shù)細(xì)胞甚至只在生物發(fā)育的某個階段才表達(dá)，所以它們在基因組上所占的份額只需單拷貝即能滿足生理需要。?多拷貝基因(約1/3)是一些與生物的基本功能密切相關(guān)的基因，如組蛋白基因、tRNA基因等，只有多拷貝才能滿足生理需要?；蚣覉@壘基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有多個復(fù)制原點(diǎn)，但每個復(fù)制子的長度較小。壘基因是不連續(xù)的。壘轉(zhuǎn)錄單位一般是單順反子。即一個基因一種mRNA一種蛋白質(zhì)，但蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)物可因剪接方式的不同而有差異(如Bcl-x：Bcl-x1；Bcl-xs)o壘存在重復(fù)序列。Kpnl家族：人和靈長類DNA經(jīng)Kpnl酶解后，產(chǎn)生4個片段(1.2,1.5,1.8,1.9kb)，被命名為Kpnl家族。人類基因組中Kpnl序列約在3-6%，散在分布。Alu家族：有3萬個成員，平均每6kb就有一個，長度約300bp，因在170bp處有一AluI位點(diǎn)(AG/CT)而得名，具有種的特異性。存在多基因家族(multigenefamily)：亦稱基因家族，是指一組具有類似功能，核苷酸序列又有同源性的基因。些存在超基因家族(supergenefamily):由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族。成員間有不同程度的同源，但功能并不相似。如Ig超家族?；蚪M學(xué)分類結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics):通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、基因定位的科學(xué)。功能基因組學(xué)(functionalgenomics)：利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息，進(jìn)行基因和非基因序列功能的研究。比較基因組學(xué)(comparativegenomics)：比較不同生物間基因和基因組結(jié)構(gòu)的差異，以增進(jìn)對基因功能的了解、闡明物種進(jìn)化關(guān)系。第二節(jié)人類基因組計劃人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)一項(xiàng)多國合作的國際研究計劃，旨在闡明人類基因組DNA3X109bp的序列，發(fā)掘所有人類基因，確定其在染色體上的位置，從而破譯人類的全部遺傳信息°HGP還對包括大腸桿菌、酵母、線蟲、果蠅、擬南芥和小鼠等在內(nèi)的一系列模式生物體基因組的測序。人類基因組計劃目的?闡明人類基因組30億個堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因，并搞清其在染色體上的位置?破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識自我；?解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律；?認(rèn)識種屬之間和個體之間存在差異的起因、認(rèn)識疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。人類基因組計劃的歷程人類基因組計劃的任務(wù)1）人類基因組的基因圖構(gòu)建與序列分析（遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜、基因圖譜）2）人類基因的鑒定3）基因組研究技術(shù)的建立4）人類基因組研究的模式生物（細(xì)菌、酵母菌、線蟲、果蠅、小鼠、擬南介）的基因組5）生物信息學(xué)的建立6）有關(guān)的倫理、法律和社會問題研究HGP研究成果與醫(yī)學(xué)人類基因組約有3.1Gbp，約有30000多個基因，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個功能基因，，其中尚有42%的基因尚不知道功能?；驍?shù)量比預(yù)期少很多。人與人之間基因組99.99%是相同的，差異僅萬分之一，不存在優(yōu)秀基因組之說。不存在白種人基因組、黃種人基因組。發(fā)現(xiàn)了大約一百四十萬個單核苷酸多態(tài)性SNP，并進(jìn)行了精確的定位，初步確定了30多種致病基因人類基因組中存在“熱點(diǎn)”和大片“荒漠”。19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少。男性的基因突變率是女性的兩倍人類基因組中大約有200多個基因是來自于插入人類祖先基因組的細(xì)菌基因人類基因組編碼的全套蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組）比無脊椎動物編碼的蛋白質(zhì)組更復(fù)雜在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有—無用DNA”——不包含或含有極少基因的成分?；蚪M上大約有1/4的區(qū)域沒有基因的片段。35.3%的基因包含重復(fù)的序列。編碼序列：僅占基因組的5%基因組重復(fù)序列：基因組的36%包含重復(fù)序列，19號染色體57%區(qū)為重復(fù)序列，重復(fù)序列占整個基因組的50%以上。插入重復(fù)、反轉(zhuǎn)錄后整合的假基因、簡單重復(fù)、片段性重復(fù)、串聯(lián)重復(fù)。人類基因組與黑猩猩的相似性達(dá)到96%，約有4000萬堿基對差異，多位于非功能區(qū)，僅有300萬對bp位于功能基因區(qū)。例如黑猩猩缺乏人類的50個基因，其中3個與炎癥有關(guān)。人類缺乏黑猩猩的1個基因。人類基因組與黑猩猩的基因組核苷酸序列差異約在編碼序列中差異小于1.5%，非編碼區(qū)差異小于3%。個別非編碼區(qū)差異較大，如著絲粒區(qū)。奇異的Y與X人類Y染色體的進(jìn)化速度比其他染色體快。與黑猩猩的Y染色體有約30%的區(qū)別，遠(yuǎn)高于人類其它遺傳密碼與黑猩猩2%的區(qū)別。3億年前，Y與X染色體一樣。但是3億年的進(jìn)化使Y越來越小，基因越來越少（1500-78genes）。由于在男性性腺外露，易受外界環(huán)境影響，經(jīng)歷的減數(shù)分裂次數(shù)比X染色體多350倍，而每次都是有變異風(fēng)險的，從父親傳到兒子，Y染色體要有600個堿基的變化，所以Y染色體受的遺傳影響比任何染色體都多。占Y染色體在減數(shù)分裂時，只有其端部和X染色體可以配對重組，導(dǎo)致基因的變化、丟失機(jī)會增大。JY染色體上存在許多回文序列，占Y染色體的10%,睪丸發(fā)育基因、精子產(chǎn)生基因位于此處。其上的基因在回文序列兩端存在2個拷貝，可以自身交換、重組，或內(nèi)部基因轉(zhuǎn)變，用此方式進(jìn)行基因的修復(fù)。早女性多一條X染色體，失活的那條X染色體上的15%的基因仍在活動，還有10%為異質(zhì)性失活逃逸。中國對人類基因組計劃的貢獻(xiàn)?1994年，我國HGP在吳旻、強(qiáng)伯勤、陳竺、楊煥明的倡導(dǎo)下啟動，最初由國家自然科學(xué)基金會和863高科技計劃的支持下，先后啟動了“中華民族基因組中若干位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)的研究'和“重大疾病相關(guān)基因的定位、克隆、結(jié)構(gòu)和功能研究'；?1998年在上海成立了南方基因中心；?1999年在北京成立了北方人類基因組中心；?1999年7月在國際人類基因組注冊，得到完成人類3號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測序任務(wù)，該區(qū)域約占人類整個基因組的1%。國際人類基因組測序任務(wù)分配情況承擔(dān)人類3號染色體測序，僅占整個基因組的1%。識別出122個基因，在已知的86個基因中，55個基因功能明確，8個與腎細(xì)胞癌、肌肉萎縮貧血等疾病有關(guān)在31個基因中找到75種不同的剪接方式，其中一個基因可以產(chǎn)生8種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)最大的基因88萬bp，兩個最小的基因，僅編碼21個氨基酸和110個氨基酸。?建立了腫瘤、心血管病、神經(jīng)、免疫、遺傳性疾病材料收集網(wǎng)絡(luò)。高血壓家系200個，糖尿病家系88個。?建立了較完整的基因組研究體系。我國北京華大基因組研究中心為世界上第六大基因測序中心。?疾病基因、功能基因研究。肝病相關(guān)基因、造血系統(tǒng)基因、腫瘤相關(guān)基因神經(jīng)疾病相關(guān)基因等。?建立了生物信息和基因組信息庫。?完成了一些模式生物的基因組計劃。如：秈稻基因組4.66億bp。人類基因組計劃展望人類基因組計劃完成之后，進(jìn)入“后基因組時代”1）繪制基因組遺傳整合圖（單體型圖），尋找不同人群之間、不同人之間的差異，建立“個人醫(yī)學(xué)”。2）功能基因組學(xué)，對基因組進(jìn)行功能研究，對非編碼區(qū)進(jìn)行基因調(diào)控功能的研究。3）比較基因組學(xué)，揭示生命起源，解決生物進(jìn)化的重大問題。例如:比較人類與細(xì)菌的基因組，篩選出僅在細(xì)菌中存在的基因，成為新的抗菌素藥靶。第三節(jié)基因組學(xué)研究范疇結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structuralgenomics）：通過基因作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、基因定位的科學(xué)。功能基因組學(xué)（functionalgenomics）：利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息，進(jìn)行基因和非基因序列功能的研究。比較基因組學(xué)（comparativegenomics）：比較不同生物間基因和基因組結(jié)構(gòu)的差異，以增進(jìn)對基因功能的了解、闡明物種進(jìn)化關(guān)系。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)遺傳圖譜又稱連鎖圖譜（linkagemap）通過遺傳重組所得到的基因線性排列圖。通過計算連鎖遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定相對距離。它是以具有遺傳多態(tài)性（在一個遺傳位點(diǎn)上具有一個以上的等位基因，在群體中的出現(xiàn)頻率皆高于1%）的遺傳標(biāo)記為“路標(biāo)”，以遺傳學(xué)距離（在減數(shù)分裂事件中兩個位點(diǎn)之間進(jìn)行交換、重組的百分率，1%的重組率稱為1cM）為圖距的基因組圖。遺傳連鎖圖:通過計算連鎖的遺傳標(biāo)志之間的重組頻率，確定它們的相對距離，一般用厘摩（cM，即每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%)表示。第1代標(biāo)記：經(jīng)典的遺傳標(biāo)記，?ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記，?HLA位點(diǎn)標(biāo)記。?限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，用限制性內(nèi)切酶特異性切割DNA鏈，由于DNA的一個“點(diǎn)”上的變異所造成的能切與不能切兩種狀況，可產(chǎn)生不同長度的片段(等位片段)可用凝膠電泳顯示多態(tài)性，從片段多態(tài)性的信息與疾病表型間的關(guān)系進(jìn)行連鎖分析，找到致病基因。如Huntington癥。?第2代標(biāo)記1985年，小衛(wèi)星中心(mini-satellitecore)、可變串聯(lián)重復(fù)VNTR(variablenumberoftandemrepeats)可提供不同長度的片段，其重復(fù)單位長度為6~12個核苷酸，1989年微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellitemarker)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)和建立，重復(fù)單位長度為2~6個核苷酸，又稱簡短串聯(lián)重復(fù)(STR)。?第3代標(biāo)記1996年Lander提出了SNP(singlenucleotidepolymorphysm)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。對每一核苷酸突變率為10-9,雙等位型標(biāo)記，在人類基因組中可達(dá)到300萬個，平均約每1250個堿基對就會有一個。3~4個相鄰的標(biāo)記構(gòu)成的單倍型(haplotype)就可有8~16種。物理圖譜-iaia路標(biāo)與路軌物理圖譜是指有關(guān)構(gòu)成基因組的全部基因的排列和間距的信息，它是通過對構(gòu)成基因組的DNA分子進(jìn)行測定而繪制的。繪制物理圖譜的目的是把有關(guān)基因的遺傳信息及其在每條染色體上的相對位置線性而系統(tǒng)地排列出來。?把龐大的DNA先“敲碎”，再拼接。以Mb、kb、bp作為圖距，以DNA探針的STS(sequencetagssite)序列為路標(biāo)。構(gòu)建物理圖的一個主要內(nèi)容是把含有STS對應(yīng)序列的DNA的克隆片段連接成相互重疊的“片段重疊群(contig)”。用“酵母人工染色體(YAC)作為載體的載有人DNA片段的文庫已包含了構(gòu)建總體覆蓋率為100%、具有高度代表性的片段重疊群”，近幾年來又發(fā)展了可靠性更高的BAC、PAC庫或cosmid庫等。轉(zhuǎn)錄圖譜iaja生命的樂譜?轉(zhuǎn)錄圖譜是在識別基因組所包含的蛋白質(zhì)編碼序列的基礎(chǔ)上繪制的結(jié)合有關(guān)基因序列、位置及表達(dá)模式等信息的圖譜。在人類基因組中鑒別出占具2%~5%長度的全部基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能，最主要的方法是通過基因的表達(dá)產(chǎn)物mRNA反追到染色體的位置。?作圖方法：連鎖分析/關(guān)聯(lián)分析：也叫等位基因關(guān)聯(lián)、連鎖不平衡。指同一染色體上位點(diǎn)間緊密連鎖的基因，在同一配子中某些等位基因的組合頻率增加。如紅綠色盲基因。?其原理是：所有生物性狀和疾病都是由結(jié)構(gòu)或功能蛋白質(zhì)決定的，而已知的所有蛋白質(zhì)都是由mRNA編碼的，這樣可以把mRNA通過反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA或稱作EST的部分的cDNA片段，也可根據(jù)mRNA的信息人工合成cDNA或cDNA片段，然后，再用這種穩(wěn)定的cDNA或EST作為“探針”進(jìn)行分子雜交，鑒別出與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的基因。用PolyA互補(bǔ)的寡聚T或克隆載體的相關(guān)序列作為引物對mRNA雙端尾側(cè)的幾百個bp進(jìn)行測序得到EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)。?轉(zhuǎn)錄圖譜的意義：在于它能有效地反應(yīng)在正常或受控條件中表達(dá)的全基因的時空圖。通過這張圖可以了解某一基因在不同時間不同組織、不同水平的表達(dá)；也可以了解一種組織中不同時間、不同基因中不同水平的表達(dá)，還可以了解某一特定時間、不同組織中的不同基因不同水平的表達(dá)。序列圖譜隨著遺傳圖譜和物理圖譜的完成，測序就成為重中之重的工作。DNA序列分析技術(shù)是一個包括制備DNA片段化及堿基分析、DNA信息翻譯的多階段的過程。通過測序得到基因組的序列圖譜。大規(guī)模測序基本策略運(yùn)用計算機(jī)軟件進(jìn)行序列拼接功能基因組學(xué)(functionalgenomics)又稱為后基因組學(xué)(postgenomics)，它利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學(xué)研究從對單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向多個基因或蛋白質(zhì)同時進(jìn)行系統(tǒng)的研究。-人類基因組DNA序列變異性研究-基因組表達(dá)調(diào)控的研究-模式生物體的研究-生物信息學(xué)功能基因組學(xué)J基因的識別、鑒定和克隆J基因的結(jié)構(gòu)與功能及相互關(guān)系J基因的表達(dá)調(diào)控基因組表達(dá)及調(diào)控的研究-在全細(xì)胞的水平，識別所有基因組表達(dá)產(chǎn)物：-mRNA：cDNA陣歹U-蛋白質(zhì)：二維電泳一質(zhì)譜-研究生物大分子相互作用：闡明基因組表達(dá)在發(fā)育過程中的時、空的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。-蛋白質(zhì)組學(xué)：高通量解析蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，是連接基因組功能研究和新藥開發(fā)的橋梁。比較基因組學(xué)(ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。比較基因組學(xué)的產(chǎn)生伴隨著基因組的研究，相關(guān)信息出現(xiàn)了爆炸性增長，迫切需要對大量基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，比較基因組學(xué)作為一門重要的工具學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生。比較基因組學(xué)是通過對系統(tǒng)發(fā)育中的代表性物種之間的全方位基因和基因家族的比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育的遺傳圖譜，來揭示基因、基因家族的起源和功能及其在進(jìn)化過程中復(fù)雜化和多樣化的機(jī)制。比較基因組學(xué)研究內(nèi)容?研究生命是從哪里起源的？?生命是如何進(jìn)化的？?遺傳密碼是如何起源的？?估計最小獨(dú)立生活的生物至少需要多少基因，這些基因是如何使它們活起來的？?鼠和人的基因組大小相似，都含有約三十億堿基對，基因的數(shù)目也類似?？墒鞘蠛腿瞬町惔_如此之大，這是為什么？?不同人種間基因組的差別僅為0.1%；人猿間差別約為1%。但他們表型間的差異十分顯著。這又為什么？比較基因組學(xué)的應(yīng)用?揭示非編碼功能序列?發(fā)現(xiàn)新基因?發(fā)現(xiàn)功能性SNP?闡述物種間的進(jìn)化史?闡明人類疾病過程的分子機(jī)制第四節(jié)基因組學(xué)與醫(yī)學(xué)研究基因與疾病關(guān)系主要目的確定致病基因或疾病易感基因；闡明這些基因的功能和在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制；指導(dǎo)臨床診斷、治療和預(yù)后的實(shí)踐。從遺傳-環(huán)境-表型的復(fù)雜關(guān)系中歸納出一些有規(guī)律性和特征性的性質(zhì)，如突變類型、修飾基因、表觀遺傳、多基因作用、基因組不穩(wěn)定性等等，為臨床診斷提供可靠指標(biāo)，為疾病治療特別是個體化治療提供新靶點(diǎn)和新思路，為疾病預(yù)測、預(yù)防和預(yù)后提供依據(jù)。基因組學(xué)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一、發(fā)現(xiàn)新的致病基因二、復(fù)雜疾病的早期基因診斷方法，如腫瘤基因組解剖計劃、遺傳病診斷。三、基因治療四、疾病易感基因的識別及對風(fēng)險人群進(jìn)行生活方式、環(huán)境因子的干預(yù)五、人類基因多樣性與個體化醫(yī)學(xué)療“基因病”:?基因相關(guān)論：所有疾病都與人類基因有關(guān)；?基因修飾論：所有藥物都是通過修飾基因本身結(jié)構(gòu)、改變基因的表達(dá)調(diào)控、影響基因產(chǎn)物的功能而起作用的；?基因的外調(diào)性：基因的表達(dá)受外界因素的調(diào)節(jié)，如地理氣候、食物、生活方式等環(huán)境影響；?基因的多態(tài)性：人類基因組的多樣性、個體特異性，決定了人對疾病或病原的易感性或抵抗力?；虿》譃槿箢愐弧位虿。河蓡蝹€基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因?。河啥鄠€基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、糖尿病、先天畸形等、三、獲得性基因?。褐竿庠椿颍―NA）侵入，在機(jī)體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。單基因?。菏侵改撤N疾病的發(fā)生主要由一對等位基因的一個或兩個基因位點(diǎn)存在缺陷而引起，其遺傳方式遵循孟德爾遺傳規(guī)律。?囊性纖維化：常染色體隱性遺傳?鐮型紅細(xì)胞貧血癥：常染色體隱性遺傳?亨廷頓舞蹈?。撼Ｈ旧w顯性遺傳?杜興氏肌營養(yǎng)不良：X染色體連鎖隱性遺傳?相關(guān)治病基因的鑒定，需要確定家族性疾病并加以描述和檢測。?定位克隆和定位候選克隆，導(dǎo)致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結(jié)腸癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎(chǔ)。?多基因疾病這類疾病發(fā)病的基因機(jī)制涉及一個以上的等位基因以及基因與環(huán)境因素的相互作用。包括心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾病（老年性癡呆、精神分裂癥）自身免疫性疾病等。1997年相繼提出了廣腫瘤基因組解剖計劃i土和i°環(huán)境基因組學(xué)計劃i土。-獲得性基因?。哼@類疾病由病原微生物感染引起，不符合孟德爾遺傳規(guī)律。疾病相關(guān)基因的鑒定?染色體制圖定位及疾病相關(guān)基因克隆?疾病相關(guān)基因表達(dá)譜篩選及疾病相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的確定?SNPs篩選二基因診斷?感染性疾病的基因診斷?遺傳病的基因診斷?復(fù)雜性疾病的基因診斷（例如：腫瘤）基因診斷的基本策略1、檢測已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因，這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細(xì)菌、霉菌和寄生蟲的基因、與致病有關(guān)的癌基因、抗癌基因、地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。2、檢測與某種遺傳標(biāo)志連鎖的致病基因遺傳連鎖一一同一染色體相鄰的二個或二個以上的基因或限制性酶切位點(diǎn)，由于位置十分靠近，在遺傳時分離幾率很低，常一起遺傳------稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖一一用限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)作遺傳標(biāo)志，定位與之相連鎖的正?；蚺c致病基因，建立相應(yīng)的遺傳連鎖圖譜。定位性克隆一一根據(jù)遺傳連鎖圖進(jìn)行定位性克隆。比較正常和異?；虻牟顒e，可找出導(dǎo)致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆策略是當(dāng)前基因診斷的重要基礎(chǔ)。3、檢測表型克隆基因該策略既不需預(yù)先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數(shù)目及其相互作用方式的影響。針對多基因?。ㄈ纾褐囟确逝帧⑾?、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾?。１硇涂寺〖夹g(shù)一一是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接分離該表型的相關(guān)基因，并對疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異?；蚪M尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯配篩選技術(shù)：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷基因診斷的臨床應(yīng)用：1、在感染性疾病檢測中應(yīng)用1、病原微生物2、病毒如：HIV,非典型性肺炎（SARS）3、寄生蟲4、不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌）5、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原體（克立氏體）艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細(xì)胞（CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷°HIV感染后，95%感染者5個月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測。2、在遺傳病檢測中的應(yīng)用產(chǎn)前診斷檢測妊娠8-12周的絨毛DNA或羊水細(xì)胞PCR診斷一系列遺傳疾病鐮刀狀細(xì)胞貧血的診斷方法：一RFLP診斷MstII酶切識別序列：CCTNAGG切割正常8鏈序列：CCTGAGG不切割突變序列：CCTGTGG-ASO探針診斷在腫瘤檢測中的應(yīng)用原癌基因生物正常細(xì)胞基因中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的癌基因，Ras,myc抑癌基因一類抑制細(xì)胞增殖的基因，其失活可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。P53,Rb……兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長處于平衡狀態(tài)。法醫(yī)學(xué)鑒定免疫組化篩選基因診斷的常用技術(shù)?核酸分子雜交?聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）?限制性片段長度多態(tài)性（RELP）?擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）?等位基因特異的寡核苷酸（ASO）?單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）?基因芯片三、基因治療（genetherapy）將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因缺陷和異?；蛞鸬募膊。_(dá)到治療目的。導(dǎo)入的基因可以與缺陷基因?qū)?yīng)、在體內(nèi)表達(dá)具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關(guān)的治療基因。概念的擴(kuò)展：凡是采用分子生物學(xué)方法原理，將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，達(dá)到治療目的的方法，都可稱為基因治療?；蛑委煵呗钥傇瓌t：----直接補(bǔ)替缺陷基因一一抑制非正常基因產(chǎn)物表達(dá)一一間接調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力。一一利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特異性殺傷1、基因矯正：將致病基因的堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留。2、基因置換：用正?；蛲ㄟ^體內(nèi)基因同源重組，原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常3、基因增補(bǔ)：將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異?；?，而是通過目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強(qiáng)。4、基因失活：利用反義技術(shù)特異封閉基因表達(dá)，抑制有害基因的表達(dá)。5、免疫調(diào)節(jié)：將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療的目的。6、調(diào)節(jié)性基因治療：導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因，治療基因表答異常的疾病7、化療保護(hù)性基因治療：導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥物的抗性基因，提高正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力8、特異性細(xì)胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的“導(dǎo)彈”，“彈頭”部分是分子重組的各種生物細(xì)胞毒素，它們以酶催化方式發(fā)揮抑制蛋白合成作用，造成細(xì)胞殺傷。9、生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償性治療四易感基因與危險人群對環(huán)境因素?fù)p害敏感的那部分人群稱為高危險人群，在同一污染環(huán)境中，高危險人群比正常人出現(xiàn)健康危害早而且程度也嚴(yán)重。在任何居民群體中都有高危險人群，而且所有的健康人，在其一生的不同年齡段，不同環(huán)境條件下，都有某一時間處于高危險狀態(tài)的可能。不同個體對環(huán)境有害因素易感性存在差異。決定某個體對某種疾病易感性的基因稱為易感基因(susceptibilitygene)。若遺傳易感性程度達(dá)到100%，表明該基因型在發(fā)病過程中起主要作用，亦即遺傳因素起決定性作用，單基因遺傳病屬于這種情況。若遺傳易感性程度低于100%，大于50%，表明該基因型在發(fā)病過程中起重要作用，但環(huán)境因素也在其中起到重要作用。若遺傳易感性程度低于50%，則表明環(huán)境因素在發(fā)病過程中起的作用比遺傳因素(基因型)為大。多基因遺傳病屬后兩種情況。疾病易感基因篩查、鑒定和克隆策略：-候選基因篩查策略(candidategenestrategy)階段；-基因組定位掃描(genome-wildscanning)階段；-基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wildassociationstudy,GWAS)階段。目前國際上對數(shù)十種人類最常見的多基因復(fù)雜性狀疾病如冠心病、高血壓、糖尿病、癌癥、精神神經(jīng)性疾病、骨質(zhì)疏松癥，肥胖…….進(jìn)行了GWAS，鑒定出眾多候選的疾病易感基因。例：腫瘤的易感基因基因組不穩(wěn)定性會造成一些基因激活而另一些基因失活，呈現(xiàn)出各種基因表達(dá)譜的變化。所有參與癌發(fā)生發(fā)展過程的基因是構(gòu)成細(xì)胞癌變和腫瘤發(fā)生發(fā)展的易感性要素，故稱為癌易感基因。目前已知有2類癌易感基因：主效基因和微效基因。高外顯率、高危險度的癌易感基因?yàn)橹餍Щ蜻@類易感基因多半是由對家族性癌胚系遺傳突變的分析所得。目前發(fā)現(xiàn)的這類癌易感基因有視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的RB1、乳腺癌的BRCA1和BRCA2、結(jié)腸癌的APC、8-聯(lián)蛋白(8-catenin)、Cowden綜合征的PTEN、VonHippelLindeu綜合征的VHL以及50多種腫瘤的TP53等。這些基因數(shù)量少，外顯率高，危險度高。相對而言，在家族性乳腺癌中，這類易感基因被研究的較多。家族性乳腺癌在所有乳腺癌中只占5%?10%的比例，因此，即使找到了所有家族性乳腺癌易感基因，最多也只能發(fā)現(xiàn)乳腺癌(包括家族性癌和散發(fā)癌)全部易感基因中5%?10%；其他大部分易感基因是由與環(huán)境因素相互作用所形成，通常表現(xiàn)為低外顯率和低危險度，屬于微效易感基因。低外顯率、低危險度的癌易感基因?yàn)槲⑿Щ蝮w細(xì)胞突變是散發(fā)癌發(fā)生的基礎(chǔ)。體細(xì)胞突變的特點(diǎn)是發(fā)生可遺傳的基因組不穩(wěn)定性。結(jié)構(gòu)(序列)異常改變，如單核苷酸突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、基因組拷貝數(shù)增加或減少，基因擴(kuò)增、重排和缺失，染色體雜合性丟失(LOH)和純合性丟失；表觀遺傳或表基因組效應(yīng)。一般而言，體細(xì)胞突變所形成的癌易感基因?qū)儆诘屯怙@率、低危險度基因，與散發(fā)癌發(fā)生相關(guān)，它們與環(huán)境因素作用緊密相關(guān)，涉及不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和不同類型的基因。五、基因多樣性和個體醫(yī)療?基因多樣性(基因多態(tài)性)代表生物種群之內(nèi)和種群之間的遺傳結(jié)構(gòu)的變異。每一個物種包括由若干個體組成的若干種群。各個種群由于突變、自然選擇或其他原因，往往造成遺傳上的差異。這些遺傳差別使得有機(jī)體能在局部環(huán)境中的特定條件下更加成功地繁殖和適應(yīng)。不僅同一個種的不同種群遺傳特征有所不同，即存在種群之間的基因多樣性；在同一個種群之內(nèi)也有基因多樣性——在一個種群中某些個體常常具有基因突變。基因突變與基因多態(tài)性突變(mutation)DNA永久的結(jié)構(gòu)改變。在大多數(shù)情況下，這樣的DNA變化或者沒有影響或者導(dǎo)致傷害，但是有時突變能改善生物體生存的機(jī)會，將有利的突變傳給后代?；虻亩鄳B(tài)性(genepolymorphism)在人群中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為。這種多態(tài)性可以分為兩類，即DNA位點(diǎn)多態(tài)性(sitepolymorphism)和長度多態(tài)性(lengthpolymorphism)0位點(diǎn)多態(tài)性?:?是由于等位基因之間在特定的位點(diǎn)上DNA序列存在差異，也就是基因組中散在的堿基的不同，包括點(diǎn)突變(轉(zhuǎn)換和顛換)，單個堿基的置換、缺失和插入。突變是基因多態(tài)性的一種特殊形式，單個堿基的置換又稱為單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。?:?SNP的頻率在1/1000-2/1000，數(shù)量巨大，分布頻密，檢測易于自動化和批量化，被認(rèn)為是新一代的遺傳標(biāo)記。???嚴(yán)格來說,只有當(dāng)?shù)任换虻念l率大于或等于1%時才能稱得上是SNP。長度多態(tài)性?:?一類為可變數(shù)目的重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeats,VNTRS)，它是由于相同的重復(fù)順序重復(fù)次數(shù)不同所致，它決定了小衛(wèi)星(minisatellite)DNA長度的多態(tài)性。小衛(wèi)星是由15-65bp的基本單位而成，重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的。???另一類長度多態(tài)性是由于基因的某一片段的缺失或插入所致，如微衛(wèi)星DNA(microsatellite)，它們是由重復(fù)序列構(gòu)成，基本序列只有1-8bp,如(TA)n及(CGG)n等，通常重復(fù)10-60次。???長度多態(tài)性是按照孟德爾方式遺傳的，它們在基因定位、DNA指紋分析，遺傳病的分析和診斷中被廣泛地應(yīng)用?；蚨鄳B(tài)性的生物學(xué)意義(1)遺傳密碼的改變：錯義突變(missensemutation)、無義突變(nonsensemutation)、同義突變(samesensemutation)、移碼突變(frame-shiftingmutation)對mRNA剪接的影響：如果點(diǎn)突變發(fā)生在內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生兩種影響：一是原有的剪接位點(diǎn)消失，二是產(chǎn)生新的剪切位點(diǎn)。導(dǎo)致mRNA的錯誤剪接，產(chǎn)生異常的mRNA，最終產(chǎn)生異常的表達(dá)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)肽鏈中的片段缺失：無義突變和DNA片段的缺失都可以導(dǎo)致肽鏈中的片段缺失，致使基因編碼的蛋白質(zhì)失去原有的功能。移碼突變不僅翻譯后的肽鏈中氨基酸序列發(fā)生改變，而且也導(dǎo)致肽鏈中的大片段缺失。啟動子的突變及非轉(zhuǎn)錄區(qū)的突變：可以使基因的轉(zhuǎn)錄水平或活性增強(qiáng)或降低。基因多態(tài)性的醫(yī)學(xué)意義＞在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，基因多態(tài)性的研究涉及的范圍廣泛，包括基因多態(tài)性與病因未知的疾病關(guān)系的研究，也包括對已知特定環(huán)境因素致病易感基因的篩選。因此開展我國人群的基因多態(tài)性與環(huán)境的作用關(guān)系的研究具有重要的意義。＞在職業(yè)病醫(yī)學(xué)中。對易感基因和易感性生物標(biāo)志物的分析，將某些攜帶敏感基因型的人甄別開來，采取針對性預(yù)防措施，提高預(yù)防職業(yè)性危害工作的效率。對特定的污染物易感人群和耐受人群的基因多態(tài)性研究，有助于闡明環(huán)境因素的致病機(jī)制，也推動了遺傳易感性標(biāo)志物的研究。1應(yīng)激蛋白及其基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系熱休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)的多態(tài)性與疾病或機(jī)體遭受應(yīng)激的易感性或耐受性有關(guān)。2癌基因、抑癌基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系3代謝酶基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系P450家族中存在的基因多態(tài)性使不同基因型攜帶個體對特定的外源化合物代謝能力不同，由此造成個體在環(huán)境因素暴露引起的健康損害存在易感性的差異。4修復(fù)基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系在外來有害因素作用下會導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)堿基錯配、插入、缺失等結(jié)構(gòu)改變，而人體內(nèi)的基因修復(fù)酶可通過不同機(jī)制幫助機(jī)體修復(fù)這些錯誤，保護(hù)人體健康，相反如果修復(fù)基因出現(xiàn)突變以致修復(fù)酶功能缺陷可與某些疾病的發(fā)生有關(guān)。如：MED1是一種堿基切除修復(fù)酶，能夠直接或間接地幫助細(xì)胞修復(fù)癌癥對基因的損害。因此對修復(fù)基因多態(tài)性進(jìn)行研究有助于深入了解某些疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制并可采取有效措施如：對高危險人群進(jìn)行篩選等對相關(guān)疾病進(jìn)行預(yù)防?；蚨鄳B(tài)性的檢測方法DNA水平遺傳多態(tài)性標(biāo)記物的研究已經(jīng)歷了三個階段。1限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)，這是第一代DNA遺傳標(biāo)記，是D.Botstein于1980年提出的。RFLP的原理：如果存在DNA的多態(tài)性，會使DNA分子的限制酶切位點(diǎn)及數(shù)目發(fā)生改變，用限制酶切割基因組時，所產(chǎn)生的片段數(shù)目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態(tài)性。最早是用SouthernBlot/RFLP方法檢測，現(xiàn)在多采用PCR-RFLP法進(jìn)行研究基因的限制性片段長度多態(tài)性。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)2DNA重復(fù)序列的多態(tài)性標(biāo)記重復(fù)序列的多態(tài)性有小衛(wèi)星DNA多態(tài)性和微衛(wèi)星的DNA多態(tài)性等多種。3第三代DNA遺傳標(biāo)記——SNP其分析的經(jīng)典方法是采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析、RFLP、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、變性高效液相色譜(dHPLC)和高通量基因芯片技術(shù)(HA)等。個體化醫(yī)療(PersonalizedMedicine)?個體化用藥，就是藥物治療因人而異、量體裁衣，在充分考慮每個病人的遺傳因素(即藥物代謝基因類型)、性別、年齡、體重、生理病理特征以及正在服用的其它藥物等綜合情況的基礎(chǔ)上制定安全、合理、有效、經(jīng)濟(jì)的藥物治療方案。根據(jù)患者的基因結(jié)構(gòu)特別是發(fā)生變異的基因結(jié)構(gòu)，有針對性地選擇藥物和給予適合患者的劑量，這種用藥模式稱為基因?qū)蛐杂盟幠Ｊ健?候選基因的選擇要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。5當(dāng)確定某一候選基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生、發(fā)展有肯定的聯(lián)系后，應(yīng)進(jìn)行“復(fù)核驗(yàn)證”。即根據(jù)初步研究中所得出的結(jié)論在“散發(fā)”病例的觀察中進(jìn)行驗(yàn)證。?基因多樣性是進(jìn)化材料。具有較高基因多樣性的種群，可能有某些個體能忍受環(huán)境的不利改變，并把它們的基因傳遞給后代。環(huán)境的加速改變，使得基因多樣性的保護(hù)在生物多樣性保護(hù)中占據(jù)著十分重要的地位?；蚨鄻有蕴峁┝嗽耘嘀参锖图茵B(yǎng)動物的育種材料，使人們能夠選育具有符合人們要求的性狀的個體和種群。?個體化醫(yī)療(PersonalizedMedicine)通過對基因多態(tài)分析，例如SNPs與疾病和藥物治療的關(guān)聯(lián)性分析，使得醫(yī)生不僅可以通過所檢測出的遺傳變異來預(yù)測、確定與疾病有關(guān)的基因，同時也將能夠事先把握患者個體對于某種藥物的反應(yīng)特點(diǎn)，并根據(jù)這一特點(diǎn)選擇治療效果最好、不良反應(yīng)等危險性最小的藥物進(jìn)行準(zhǔn)確的治療。對生物技術(shù)的影響?基因工程藥物：分泌蛋白(多肽激素，生長因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等)及其受體；?診斷和研究試劑產(chǎn)業(yè)：基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯片、疾病和篩藥模型；?對細(xì)胞、胚胎、組織工程的推動：胚胎和成年期干細(xì)胞、克隆技術(shù)、器官再造。?轉(zhuǎn)基因食品和轉(zhuǎn)基因藥物.篩選新藥和藥物的靶點(diǎn)，分析藥理過程。.進(jìn)行藥物設(shè)計，對基因蛋白產(chǎn)物的高級結(jié)構(gòu)分析、預(yù)測、模擬藥物作用i°口袋i土。.個體化的藥物治療：藥物基因組學(xué)。根據(jù)基因的特性為某個群體或個人設(shè)計藥物。第五節(jié)基因組學(xué)新技術(shù)基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)展測序新技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)表觀基因組學(xué)外顯子組學(xué)經(jīng)典方法包括Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger和Coulson1977)Maxam-GilbertDNA化學(xué)降解法(Maxam和Gilbert,1977)新技術(shù)包括＞新技術(shù)方法雜交測序法＞質(zhì)譜法＞單分子測序法?原子探針顯微鏡測序法＞流式細(xì)胞儀測序法＞大規(guī)模平行實(shí)測法、DNA芯片法轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組是轉(zhuǎn)錄后的所有mRNA的總稱(mRNA,smallRNA,andNONcodingRNA.)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)就是在基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，即研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)。-轉(zhuǎn)錄組譜可以提供什么條件下什么基因表達(dá)的信息，并據(jù)此推斷相應(yīng)未知基因的功能，揭示特定調(diào)節(jié)基因的作用機(jī)制。-通過這種基于基因表達(dá)譜的分子標(biāo)簽，不僅可以辨別細(xì)胞的表型歸屬，還可以用于疾病的診斷。表觀基因組學(xué)表觀遺傳學(xué)現(xiàn)在成為了腫瘤研究中的熱點(diǎn)問題。腫瘤的形成都伴隨著DNA甲基化和組蛋白的修飾異常。全基因組的低甲基化(hypomethylation)，抑癌基因啟動子CpG島高度甲基化(hypermethylation)，眾多關(guān)鍵基因的組蛋白密碼被改變，以及組蛋白H4去已?；腿谆@些都是腫瘤細(xì)胞異常表觀遺傳譜的明顯特征。外顯子組學(xué)?外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異。?外顯子組序列捕獲及第二代測序是一種新型的基因組分析技術(shù):外顯子序列捕獲芯片可在同一張芯片上以高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，后續(xù)利用Solexa/SOLiD/Roche454測序直接解析數(shù)據(jù)。與全基因組重測序相比，外顯子組測序只需針對外顯子區(qū)域的DNA即可，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，更加簡便、經(jīng)濟(jì)、高效?？捎糜趯ふ覐?fù)雜疾病如癌癥、糖尿病、肥胖癥的致病基因和易感基因等的研究。第六節(jié)人類基因組研究的倫理問題?基因組計劃創(chuàng)建了一個科學(xué)環(huán)境，在一定程度上導(dǎo)致了醫(yī)學(xué)思維模式的變化。P4醫(yī)學(xué)(預(yù)測、預(yù)防、個性化和參