基因工程在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

生命科學(xué)院分子生物學(xué)期末綜述題目：基因工程在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望班級(jí)：09動(dòng)物科學(xué)姓名：曾雪婷學(xué)號(hào)：2009084548【摘要】本文闡述了基因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的原理、基本路線(xiàn)，介紹了轉(zhuǎn)

基因技術(shù)和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，總結(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動(dòng)物領(lǐng)域的應(yīng)用，提出了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物面臨的問(wèn)題，并對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的前景進(jìn)行了展望?！娟P(guān)鍵詞】基因工程；原理；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；應(yīng)用；展望基因工程是改變生物的遺傳組成，增加生物的遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因生物新的表型特征，使其能夠更好地服務(wù)于人類(lèi)社會(huì)的一項(xiàng)工程技術(shù)?；蚬こ淘谵D(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ龠M(jìn)了轉(zhuǎn)基因方法的不斷發(fā)展和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用領(lǐng)域的迅速擴(kuò)大?；蚬こ膛c動(dòng)物基因工程的原理基因工程又名遺傳工程(geneticengineering)、一主要包括DNA重組技術(shù)、分子克隆或基因克隆等技術(shù)，它是指在分子水平上提取(或合成)不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割，再和一定的載體拼接重組，然后把重組的DNA分子引入細(xì)胞或生物體內(nèi)，使這種外源DNA(基因)在受體細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行了復(fù)制與表達(dá)，按人們的需要繁殖擴(kuò)增基因或生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向創(chuàng)造生物的新性狀，并能穩(wěn)定遺傳給后代［1］?；蚬こ痰暮诵膬?nèi)容包括基因克隆和表達(dá)。動(dòng)物基因工程就是利用基因工程技術(shù)來(lái)人為地改造動(dòng)物遺傳特性的技術(shù)體系。它的具體應(yīng)用就是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimal)，即用基因工程的方法獲得目的基因并導(dǎo)入到動(dòng)物的受精卵中，使外源基因與動(dòng)物本身的基因組DNA整合到一起，并隨細(xì)胞的分裂而增殖，從而在動(dòng)物體內(nèi)得到表達(dá)，產(chǎn)生具有特定性狀的個(gè)體。這種在基因組中穩(wěn)定有效地整合有人工導(dǎo)入外源基因的動(dòng)物稱(chēng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。應(yīng)用實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)和分子生物學(xué)原理，將來(lái)自一種生物的特定基因?qū)肆硪粍?dòng)物的受精卵或早期胚胎細(xì)胞中，并整合到宿主染色體中，在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，并能通過(guò)生殖細(xì)胞傳遞給后代。其基本程序?yàn)椋耗康幕虻闹苽湟灰荒康幕虻膶?dǎo)入一染外源基因供體的培養(yǎng)——篩選外源基因的供體檢驗(yàn)——受體細(xì)胞的準(zhǔn)備——轉(zhuǎn)基因重組胚的構(gòu)建——轉(zhuǎn)基因重組胚的培養(yǎng)——轉(zhuǎn)基因重組胚胎的移植——產(chǎn)下轉(zhuǎn)基因動(dòng)物——轉(zhuǎn)基因動(dòng)物鑒定——生殖細(xì)胞傳遞給后代。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出現(xiàn)弓I起了世人的矚目。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域2.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)完全可以按照人類(lèi)的主觀愿望設(shè)計(jì)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)定向精心培育，使物種符合人類(lèi)經(jīng)濟(jì)目的的變異，能加快其積累和保存的步伐。在畜牧業(yè)生產(chǎn)上，主要是用于遺傳改良，加速動(dòng)物育種，研究真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理。當(dāng)出現(xiàn)符合我們預(yù)想結(jié)果的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，再利用優(yōu)良動(dòng)物品種的體細(xì)胞作核供體克隆動(dòng)物，用于大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以很快地在實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)造出新物種。在動(dòng)物雜種優(yōu)勢(shì)利用方面，可增強(qiáng)選育的種畜性狀穩(wěn)定，提高育種效率，大大縮短育種年限，加速動(dòng)物育種的進(jìn)程。另外，對(duì)于家畜可以做基因工程改造，將結(jié)合特異抗原抗體基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，制造出對(duì)細(xì)菌、病毒及寄生蟲(chóng)等疾病具有遺傳免疫特性的轉(zhuǎn)基因抗性動(dòng)物。2.2轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用目前，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺可以用作生產(chǎn)醫(yī)用蛋白，提高轉(zhuǎn)入基因（如K-酪蛋白基因）以及一些激素（如生長(zhǎng)激素）及酶（如轉(zhuǎn)乳糖酶基因）的基因表達(dá)的經(jīng)濟(jì)有效的生物反應(yīng)器，即通過(guò)乳腺生物反應(yīng)器可得到治療一些疑難病癥的藥物。把一些目的基因（即能夠產(chǎn)生治療某種疾病特效物質(zhì)的基因）注射到一個(gè)奶牛受精卵的原核里，通過(guò)基因整合、胚胎發(fā)育，再將其移人母體子宮中繼續(xù)發(fā)育成后代，在雌性性成熟后的乳汁中提取有用的藥物。這種方法整合率低乳腺里的表達(dá)量很低，得不到理想的藥物。現(xiàn)在可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合克隆技術(shù)來(lái)生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器。首先把目的基因整合到體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞中培養(yǎng)，再篩選出高表達(dá)量的細(xì)胞進(jìn)行克隆，其后代動(dòng)物乳腺里就有高表達(dá)量的蛋白質(zhì)。即動(dòng)物成為“制藥廠”。2003年，Brophy等[2]通過(guò)轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)使牛奶中B-伊酪蛋白的含量提高了8%~20%,k-酪蛋白的含量提高了兩倍。由此表明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法利用乳腺生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物制劑具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。2.3轉(zhuǎn)基因技術(shù)在建立動(dòng)物模型和器官移植等醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鼠是人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型，它可以幫助人們深入了解復(fù)雜疾病的病因和發(fā)展過(guò)程?？茖W(xué)家們已經(jīng)建立了包括老年性癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、肌肉營(yíng)養(yǎng)缺乏癥、腫瘤發(fā)生、高血壓、神經(jīng)衰變癥、內(nèi)分泌功能障礙、動(dòng)脈硬化癥等疾病鼠模型［3］。在器官移植方面，研究者成功敲除a-1,3-半乳糖苷酶基因的豬，這為人類(lèi)異體器官移植的設(shè)想帶來(lái)了曙光。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物3.1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究方法利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種既可以加快家畜品種的改良速度提高肉，奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)，又可以生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白。常用的制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法主要有：原核期胚胎的顯微注射法(genmicroiniectioninpronucleus’embryo);逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)(retrovirus-mediatedgenetransfer);精子載體法(sperm-mediatedgenetransfer);生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法(germcell—mediatedgenetransfer);胚胎干細(xì)胞(ES)技術(shù)及原始生殖細(xì)胞(PGCs)技術(shù)(embryostemcell/primordialgermcells一mediatedgenetransfer);受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(recipient—mediatedgenetransfer)等。DNA顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法和轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)足目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中常用的方法［4］。隨著研究的深入，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已從簡(jiǎn)單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植方向發(fā)展，從外源基因隨機(jī)插入(或整合)到定點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)變，從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變。3.2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的技術(shù)方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)始于20世紀(jì)80年代，隨著研究的深入，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作技術(shù)得到了突破性進(jìn)展?，F(xiàn)已建立了許多融合有外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠，轉(zhuǎn)基因兔、豬、羊、牛等已誕生5］。目前常用DNA顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法和轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。3.2.1DNA顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1990年12月，美國(guó)GenpharmInternational公司用酪蛋白啟動(dòng)子與人乳鐵蛋白(humanLactoferrin，hLF)的cDNA構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體，通過(guò)顯微注射法獲得了世界上第一頭名為Herman的轉(zhuǎn)基因公牛。該公牛與非轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因后代，1/4后代母牛乳汁中表達(dá)了人乳鐵蛋白含量達(dá)1000ug/mLo2002年，Berkel等利用牛asl-酪蛋白啟動(dòng)子與人乳鐵蛋白基因組6.2kb片段構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體,通過(guò)顯微注射獲得了轉(zhuǎn)基因牛。ELISA(Enzyme-LinkedlmmunosorbentAssay)結(jié)果分析表明，轉(zhuǎn)基因牛奶中人乳鐵蛋白的含量為300~2800ug/mLo這一研究結(jié)果表明，可以用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)人乳鐵蛋白。3.2.2胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物利用胚胎干細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)和便于基因操作的優(yōu)點(diǎn)用自體細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)生產(chǎn)完全相同的胚胎干細(xì)胞用特定的物質(zhì)進(jìn)行處理和誘導(dǎo)，得到所需要的各種組織細(xì)胞，再送回人體便能夠修補(bǔ)和更新因疾病或老化而受損的器官組織。此構(gòu)想已經(jīng)初步在小鼠以及大型哺乳類(lèi)上試驗(yàn)成功。將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的胚胎干細(xì)胞，結(jié)合基因敲除(geneknock-out)和基因?qū)?geneknock-in)等手段，進(jìn)行基因定點(diǎn)整合實(shí)驗(yàn)，創(chuàng)建動(dòng)物疾病實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)模型和治療遺傳疾病及作為醫(yī)用器官移植的供體等方面，有望成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新穎的治療途徑。人的異種器官移植的主要問(wèn)題在于克服致命的超急性排斥反應(yīng)。排斥反應(yīng)是由人體內(nèi)抗體通過(guò)結(jié)合到豬血管內(nèi)的半乳糖而引發(fā)，會(huì)導(dǎo)致植入器官在被移植后幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)被破壞掉。因而防止排斥的最直接方法是將供體動(dòng)物的a-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除掉。但真正將豬器官臨床應(yīng)用到人體內(nèi)前，還須考慮豬內(nèi)源性病毒傳播給人類(lèi)的潛在危險(xiǎn)，基因打靶是目前解決此問(wèn)題的有效探索。3.2.3轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)踴動(dòng)物PPL公司在Dolly綿羊誕生的同年，由Schnieke等共同合作得到了用于治療血友病的第一批攜帶外源基因——人凝血因子(IX):HumanFactorIX基因的克隆綿羊，凝血因子IX可在乳中的表達(dá)量達(dá)到125ug/mL。Cibelli等用標(biāo)記物p-gal/neo對(duì)雄性牛胎兒的成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再經(jīng)新霉素篩選所得到抗性細(xì)胞克隆獲得都在同一個(gè)染色體位點(diǎn)整合了外源基因P-半乳糖苷酶的4頭小牛。Baguisi等克隆得到高效表達(dá)人抗凝血因子B的轉(zhuǎn)基因山羊。McGreath等獲得第一只定點(diǎn)整合外源基因的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊；Lai等用G2/M期細(xì)胞做核供體得到表達(dá)綠色熒光蛋白的小豬；同年Lai等成功得到敲除a-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)有許多課題組掌握了體細(xì)胞克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，成勇等［6似轉(zhuǎn)基因山羊體細(xì)胞為供體細(xì)胞克隆出轉(zhuǎn)基因山羊。龔國(guó)春等［7］獲得了第一頭轉(zhuǎn)基因克隆牛。石德順研究員領(lǐng)導(dǎo)的課題組正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因克隆水牛的研究，已經(jīng)建立了基因打靶的技術(shù)平臺(tái)，獲得了轉(zhuǎn)人a-乳清蛋白、TPO基因的克隆水牛胚胎；中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授獲得一批轉(zhuǎn)有人體基因的轉(zhuǎn)基因克隆奶牛，轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的移植受體牛妊娠率達(dá)到33.3%（國(guó)際水平30.7%）;轉(zhuǎn)基因克隆胚的移植受體牛產(chǎn)犢率達(dá)到37.5%（國(guó)際水平11.5%）,因此，我國(guó)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛生產(chǎn)的總體效率達(dá)到了10%,轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆牛技術(shù)達(dá)到國(guó)際前沿水平。我國(guó)是繼美國(guó)之后第二個(gè)擁有高效轉(zhuǎn)基因克隆牛技術(shù)的國(guó)家，這促使我國(guó)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品種培育效率大幅提高。轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前出現(xiàn)的問(wèn)題及分析盡管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究和應(yīng)用取得了重大進(jìn)展，同時(shí)也面臨著不少的問(wèn)題和困難。目前出生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物定點(diǎn)整合效率低，外源基因表達(dá)不穩(wěn)定，成本昂貴；對(duì)家畜染色體上控制眾多經(jīng)濟(jì)性狀的基因位置知道不多，動(dòng)物的生產(chǎn)性狀的基因由多基因控制，難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)大批基因的轉(zhuǎn)移；控制各種主要性狀的基因在宿主表達(dá)（受體）組織內(nèi)特異性表達(dá)的調(diào)控因子和啟動(dòng)因子尚未完全發(fā)現(xiàn);其食品及產(chǎn)品的安全性問(wèn)題也引起了世人關(guān)注。2007年，Yang等首次對(duì)克隆牛與非克隆牛的生物化學(xué)組分進(jìn)行了分析，表明兩者在生物安全評(píng)價(jià)指標(biāo)上沒(méi)有大的差異。同年，Laible等在分析了轉(zhuǎn)基因和克隆奶牛的奶樣和奶酪的化學(xué)成分后得出結(jié)論，克隆牛與傳統(tǒng)育種獲得的牛奶各項(xiàng)指標(biāo)含量基本一致和類(lèi)似，轉(zhuǎn)有酪蛋白基因的奶牛初乳與正常奶牛的IgG含量和動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)類(lèi)似。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步深入研究和推廣應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物應(yīng)用方面存在的一些問(wèn)題會(huì)逐漸被攻克，技術(shù)會(huì)更加日趨成熟完善。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物被更多的人們認(rèn)可和接受，其應(yīng)用也將更加廣泛。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展前景基因工程技術(shù)以其巨大的生命力影響著人類(lèi)的生活，并已逐步滲透到人類(lèi)生活的各個(gè)領(lǐng)域。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域的不斷拓展，在實(shí)驗(yàn)室獲得的新突破和技術(shù)成果不斷地運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去，創(chuàng)造出更多具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的不同種類(lèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使地球的生物圈變得更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為研究動(dòng)物改良、抗病育種方面，探明人類(lèi)疾病發(fā)病機(jī)理研究以及建立人類(lèi)遺傳疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，建立動(dòng)物生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)天然活性藥物蛋白和基因治療以及生產(chǎn)人類(lèi)器官代用品等方面極具有開(kāi)發(fā)潛力，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟和推廣將給人類(lèi)帶來(lái)無(wú)限光明。參考文獻(xiàn)：李立家.肖庚富.基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2004:1.BROPHYB,SMOLENSKIG,WHEELERT-etal.Clonedtransgeniecattleproducemilkwithhigherlevelsofbeta-caseinandkappa-casein[J].NatBioteehnOl.2003.21(2