固相有機合成課件

第三講固相有機合成1選題1有機硅連接體在固相有機合成中的應用選題2組合化學的高通量合成策略選題3高分子載體上的固相合成2固相有機合成經歷了幾個重要的發(fā)展時期：1、20世紀50年代——離子交換樹脂的發(fā)展與應用；2、20世紀60年代——固相肽合成的提出與發(fā)展；3、20世紀70年代——固相過渡金屬催化劑的應用；3、20世紀80年代——各類寡聚型化合物的固相合成，固相多重合成，固相自動合成儀的應用，分-混法合成OBOP型肽庫；5、20世紀90年代——組合化學的全面發(fā)展，有機小分子的固相合成，固相有機試劑以及固相清除劑的應用，天然產物的固相合成，新型固相載體以及Linker多樣性的發(fā)展，多通道固相自動合成儀的應用。3固相有機合成（solid-phaseorganicsynthesis，簡稱SPOS），就是把反應物或催化劑鍵合在固相高分子載體上，生成的中間產物再與其它試劑進行單步或多步反應，生成的化合物連同載體過濾、淋洗，與試劑及副產物分離，這個過程能夠多次重復，可以連接多個重復單元或不同單元，最終將目標產物通過解脫試劑從載體上解脫出來（產物脫除反應）。其基本原理如下圖所示：一、固相有機合成基本原理和特點5固相有機合成反應總體上可以分為3類:(1)反應底物以共價鍵和高分子支持體相連，溶液中的反應試劑和底物反應。反應后產物保留在支持體上，通過過濾、洗滌與反應體系中的其它組分分離，最后將產物從支持體上解離下來得到最終產物;(2)反應試劑與支持體連接形成固相合成試劑，反應底物溶解在溶液相中，反應后副產物連接在樹脂上，而產物留在溶液中，通過過濾、洗滌、濃縮得到最終產物;（一）固相有機合成反應的分類:6(3)將催化劑連接在支持體上，得到固相高分子催化劑。使用這種催化劑可以在反應的任何階段把催化劑分離出來，從而控制反應進程，而且這種催化劑通常還具有更好的穩(wěn)定性和可循環(huán)使用性，因而降低了成本。（二）固相合成方法的優(yōu)越性:(2)易于實現(xiàn)自動化：固相樹脂對于重復性反應步驟可以實現(xiàn)自動化，具有工業(yè)應用前景;(1)后處理簡單：通過過濾、洗滌就可以將每一步反應的產物和其它組分分離;7二、固相載體固相合成中的組成要素為固相載體、目標化合物和連接體。固相有機合成的研究包括四個方面：

載體(support)的選擇和應用；(2)載體的功能基化及其與反應底物結合的連接基(linker)；(3)固相載體上的化學反應及條件優(yōu)化；(4)產物從固相載體上解離的方法。9在進行固相有機合成之前，要選擇和尋找適宜的固相載體。通常對載體的要求有以下幾點（一）固相載體的要求(1)不溶于普通的有機溶劑；(2)有一定的剛性和柔性；(3)要能比較容易功能基化，有較高的功能基化度，功能基的分布較均勻；(4)聚合物功能基應容易被試劑分子所接近；(5)在固相反應中不發(fā)生副反應；(6)機械穩(wěn)定性好，不易破損；(7)能通過簡單、經濟和轉化率高的反應進行再生，重復使用。10（二）載體材料的類型根據(jù)骨架的主要成分可分為：有機載體：苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)樹脂：PS-DVB，簡稱聚苯乙烯樹脂；TentaGel樹脂：在交聯(lián)聚苯乙烯PS樹脂上接枝聚乙二醇PEG，得到的這種樹脂稱為TentaGel樹脂，TentaGel樹脂可在末端羥基位上引入帶有各種功能基的連接橋，形成一個系列載體；PolyHIPE樹脂：高度支化、被聚二甲基丙烯酰胺接枝的多孔PS—DVB樹脂；聚丙烯酰胺樹脂；PEGA樹脂：丙烯酰胺丙基-PEG-N，N-二甲基丙烯酰胺；11131、聚苯乙烯（PS）類載體Merrifield樹脂就屬于此類。它是一種低交聯(lián)的凝膠型珠體。凝膠型聚苯乙烯樹脂通常用1%或2%二乙烯苯交聯(lián)。一般說來，凝膠型聚苯乙烯樹脂在有機溶劑中有較好的溶脹性并具有較高的負載量，但是機械性能和熱穩(wěn)定性較差，所以它們不適合連續(xù)裝柱方式操作，反應溫度不能超過100℃。另外還有大孔型樹脂，它具有較高的交聯(lián)度，機械穩(wěn)定性好，在溶劑中溶脹度低，但是負載量較小。1415在固相合成過程中，要將目標化合物連接到固相載體上，高聚物骨架上必須帶有活性化學官能團。在聚苯乙烯骨架上引入活性化學官能團的方法主要有兩種:

對高聚物骨架進行化學修飾；

用帶有化學活性基團的單體與苯乙烯、二乙烯苯共聚。17通常所用的Merrifield樹脂是將PS-DVB樹脂中苯環(huán)進行氯甲基化后得到的樹脂，其制備方法是在四氯化錫或二氯化鋅的催化下，用氯甲醚處理PS-DVB樹脂即可實現(xiàn)氯甲基化(見圖2)。但是，氯甲基化試劑氯甲醚有致癌作用，且氯甲基化過程難于控制氯含量，是一種潛在的麻煩。18改進的氯甲基化方法是：采用適量的p-氯甲基苯乙烯作為官能團衍生單體，用過氧化苯甲酰作為引發(fā)劑，與苯乙烯、二乙烯苯于80℃左右懸浮共聚(見圖3)。該方法克服了用氯甲醚氯甲基化的缺點,同時可以有效地控制芐基氯的含量。其它比較常用的PS-DVB類樹脂還有氨甲基樹脂和羥甲基樹脂等，兩者皆從Merrifield樹脂衍生得到19TentaGel樹脂是德國聚合物公司RappPolymerGmbh的一類固相合成樹脂產品的商標。事實上，TentaGel樹脂是聚乙二醇(PEG)接枝改性的PS-DVB樹脂，結構見圖8，其PEG鏈末端包含具有反應活性的基團，可以作為固相載體的衍生官能團2、TentaGel樹脂21POE是乙烯-辛烯共聚體，最常用的增韌劑。22聚乙二醇（PEG）樹脂很早就被用作載體來合成多肽，聚乙二醇在許多溶劑中可溶，從而形成均相反應體系，但產物不易分離提純。它在水、甲醇、乙腈、二氯甲烷和DMF中有相當高的溶脹體積（4~6ml/g）。烷烴和醚可以破壞它的凝膠相。在固相有機合成多肽庫中使用較多。這種樹脂增加了極性試劑的可接近性（accessibility）。反應大多數(shù)在無水介質中進行。該樹脂在高壓下穩(wěn)定，適于裝柱進行流動反應，但其在強酸和強親核試劑中及高溫下側鏈易裂解。另外，此樹脂與普通PS樹脂相比，負載量低、價格貴、機械強度低。2325雖然TentaGel樹脂作為固相載體具有諸多優(yōu)點，但研究發(fā)現(xiàn)產物很容易受到PEG碎片的污染。為此，人們尋求結構更具穩(wěn)定剛性的接枝PEG鏈的聚苯乙烯樹脂，ArgoGel樹脂(見圖9a)和NovaGel樹脂(見圖9b)就是這樣的例子。它們的結構與TentaGel樹脂略有不同，ArgoGel樹脂的PEG鏈通過穩(wěn)定的叔碳原子與聚苯乙烯鏈連接，而NovaGel樹脂PEG接枝率較低。26（三）載體的穩(wěn)定性無機載體只能在特定很窄的酸堿范圍(pH=6~7)內使用，它們的耐氧化性、耐還原性較好。有機載體對一般的酸堿液比較穩(wěn)定，尤其是對不帶氧化性的酸更穩(wěn)定。但有機樹脂不能在強酸、強堿(濃度大于2mol/L)中長期浸泡和使用。一般情況下，交聯(lián)度越高耐氧化性越好。有機樹脂一般對還原劑比較穩(wěn)定。1、化學穩(wěn)定性29物理穩(wěn)定性包括機械強度、耐磨損、耐壓力負荷及滲透壓變化等。在應用上，尤其在自動化操作上更為重要。無機載體耐輻射性能比較好，而有機載體均易降解。有機載體在一般情況下，交聯(lián)度越高，物理穩(wěn)定性越強。一般對有機溶劑，包括醇、醛及酮類都比較穩(wěn)定。有機載體熱穩(wěn)定性一般不如無機載體好，常見的凝膠型樹脂使用的上限溫度為120℃，大孔樹脂有的可達150℃。2、物理穩(wěn)定性30（四）載體的環(huán)境效應載體上的功能基團處于聚合物鏈的包圍之中，因而功能基團的反應活性會受到聚合物鏈的影響。這些影響包括局部濃度效應、擴散效應、分子篩效應、活性部位的隔離效應等。聚合物載體對非均相反應中小分子反應物的富集或排斥，使得反應速度比相應的均相反應大或小。1、局部濃度效應如果一個反應體系的反應速度與載體的顆粒半徑成反比，則說明此體系中存在擴散限制作用。2、擴散效應31由于聚合物載體孔徑不同對不同大小的底物分子具有篩分作用，因而不同大小的分子具有不同的反應活性。3、分子篩效應擴散作用的存在一般對反應是不利的，但分子篩效應的存在有時可以提高固相反應的選擇性，而低分子體系無此特性。32減小擴散限制作用對反應的影響的方法：

降低載體顆粒粒徑；制備載體時加入稀釋劑以增大載體的孔體積；選擇合適的溶劑體系；

提高攪拌速度；

采用薄殼型載體幾乎可完全避免擴散限制作用。采用較小顆粒的聚合物載體制得的試劑和催化劑可以減小反應物到達這些物種活性部位的擴散限制作用，但粒徑過小的載體應用起來常常會引起處理上的麻煩。因此研究工作多采用粒徑為50-200μm的珠體作載體。33指載體將能自身反應的物種固定分離開，以避免同一物種多分子之間的副反應發(fā)生，類似于均相反應中的“稀釋作用”。

采用以下措施可增大活性部位的隔離效應：

增大聚合物的交聯(lián)度；降低載體的功能基化程度；降低反應的溫度。4、活性部位的隔離效應34在固相合成的過程中，連接基團是不可或缺的部分，它決定了目標化合物能否在固相載體上進行活性測定，也決定了是否具有適合的反應條件，以及是否可以采用溫和的或選擇性的切割條件將產物從固相載體上解離出來，因此直接關系到合成策略的成功與否。三、連接體很多固相合成中的連接基團是從傳統(tǒng)液相合成中的保護基團發(fā)展而來的，執(zhí)行與保護基團相似的作用。事實上，組合固相合成技術中的“樹脂-連接基團”單元可以考慮為一類不溶的、固定化的保護基團。然而，連接基團與保護基團又有很多不同之處。35（一）連接體的性能1、連接基團是一種雙功能保護基。它一方面通過一種容易切割的不穩(wěn)定的鍵(如酯鍵、酰胺鍵等)與目標分子相連，另一方面又通過一種相對穩(wěn)定的鍵(如C—C鍵、醚鍵等)把目標分子固定在固相載體上。2、在組合固相合成技術中，把目標化合物從固相載體上解離出來的切割條件不僅取決于連接基團的類型、與連接基團相連的目標分子，而且樹脂類型及其上載量和粒度對此也有重要的影響。3637在合成過程中采用保護基團策略至少要考慮兩方面的問題：（1）必須保證受保護基團在合成過程中不受損害；（2）不能引入很難除去的雜質。

而連接基團不僅要考慮以上兩方面的問題，而且理想的連接基團還需具有一些新的特點:(1)由于需引入上載步驟和切割步驟，理想的連接基團應該保證在這兩個步驟中的化學反應都是定量進行的;(2)對目標分子進行化學反應時，連接基團應不受到影響38（二）連接基團的分類根據(jù)切割步驟所采用的反應條件，可以把常用的連接基團簡單地分成以下4類：酸切割連接基團、堿切割連接基團、光切割連接基團和氧化-還原切割連接基團。1、酸切割連接基團強酸是固相合成中最常使用的切割試劑之一。其中揮發(fā)性酸如HF和TFA(三氟乙酸)，由于其反應后剩余部分很容易除去，因此被廣泛作為切割試劑使用。39以酯類和酰胺類連接基團最為常見，如琥珀亞酰胺碳酸酯連接基團1、二苯甲基樹脂240在苯環(huán)的對位或鄰位引入給電子基團(如甲氧基等)，增加了其在切割過程中生成的碳正離子的穩(wěn)定性，可以顯著增加連接基團對酸的敏感程度。Wang連接基團4和SASRIN(superacidsensitiveresin)連接基團(5)比Merrifield羥甲基樹脂類連接基團對酸更敏感；而Rink連接基團(6)比相應的二苯甲基樹脂對酸更敏感，前者在弱酸性條件下即可實現(xiàn)切割。412、堿切割連接基團如下圖所示的反應中，堿作為親核試劑進攻酰肼連接基團，使發(fā)生分子內環(huán)化反應，生成吡唑啉酮類產品。而在式3所示的反應中，堿作為催化劑，使發(fā)生季銨鹽的β-消除反應,得到叔胺產品。42堿作為切割試劑可通過兩種不同的途徑，使連接基團與目標分子之間的化學鍵斷離。（1）作為親核試劑，發(fā)生親核加成或親核消除反應；（2）通過酸堿中和反應，或在堿催化下發(fā)生消除反應或成環(huán)反應。43常見的光切割連接基團帶有鄰位硝基苯單元(7,8,9)，其光化學反應切割機理涉及到從鄰位硝基到亞硝基的轉化及芐位C—H鍵的斷裂。3、光切割連接基團44在光照的條件下，發(fā)生奪取氫的反應，生成活潑中間體a，a進一步重排形成中間體b，接著發(fā)生消去反應而得到羧酸產品。45用氧化-還原反應來對目標化合物進行解離，是固相有機合成中經常使用的方法，相應的連接基團稱為氧化-還原切割連接基團。氧化-還原方法經常與其它切割方法(如酸堿、親核、親電和光化學等方法)同時采用。這類連接基團還可以進一步細分為還原性切割和氧化性切割連接基團。4、氧化-還原切割連接基團目前廣泛用于固相有機合成的還原方法主要有4種：催化氫化、二硫化物還原、脫磺酸基作用和金屬氫化物還原。而氧化的方法主要有臭氧氧化法和采用其它如CAN（硝酸鈰銨

）、DDQ（2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌

）、m-CPBA（間氯過氧化苯甲酸

）等氧化劑的方法。46可以引入一系列基團(如碳鏈)在連接基團與固 相載體之間作為隔離單元，其形式為： （三）具有特殊功能的連接基團1、帶隔離單元(spacer)的連接基團（1）使反應活性點遠離固相載體，從而在一定程度上克服了固液兩相反應速度慢的缺點。（2）可以專門賦予樹脂材料溶解特性，使其更好地與溶劑相溶。（3）還可以改變連接基團復雜的電子效應和減少空間位阻效應，從而改變連接基團的切割條件。隔離單元的作用：47在Merrifield羥甲基樹脂(14)上引入親水性的聚乙二醇鏈(如15,TentaGel樹脂)，可以增加樹脂材料的水溶性。與傳統(tǒng)的Merrifield羥甲基樹脂(14)比較，引入一個亞甲基作為隔離單元(16)，明顯增加了對酸的穩(wěn)定程度。48（4）使樹脂反應活性位點彼此遠離，從而可以抑制交聯(lián)和多偶合等副反應。下面一個例子綜合說明了引入隔離單元給固相合成帶來的好處Kobayshi研究小組比較研究了Merrifield氯甲基樹脂(17)、Wang型樹脂(4)以及他們自制的CMPP(5-(4′-Chloromethylphenyl)pentyl-polystyrene)樹脂(18)。實驗表明，CMPP樹脂不僅切割條件溫和，而且在上載率、收率等方面都有所改進。49大多數(shù)連接基團在切割完畢之后留下一個殘基官能團在目標化合物上，如羥基、酰胺基、羧基等。但是，對一些化合物庫的合成，殘基的存在并不是所希望的。為了解決這個問題，固相合成化學家們專門設計了一類無痕跡連接基團。2、無痕跡連接基團(tracelesslinker)無痕跡連接基團，顧名思義，即是在合成結束以后，目標化合物沒有留下任何固相合成的痕跡。1995年,Pluntett和Chenera首次設計出了兩種無痕跡連接基團。較早的時候，無痕跡連接基團指的是在切割部位形成新的C—H或C—C鍵的那一類連接基團。50現(xiàn)在，無痕跡連接基團的定義有所擴大，只要在切割點沒有引入雜原子(如氧、氮、硫等)，包括生成芳基、烷基等，都可以稱為無痕跡切割。因此，在切割過程中發(fā)生諸如環(huán)加成這樣的反應的連接基團也該歸入無痕跡連接基團的范疇。有些文獻把在切割過程中通過芳環(huán)與胺類的親核取代反應，或通過Hafmann消去反應來切割叔胺類化合物產品的連接功能基也稱為無痕跡連接基團。51（1）最常見的無痕跡連接基團：有機硅烷類連接功能基，如芳基三烷基硅烷(19,20,21)、芳基二烷基硅醚(22)和烯丙基硅烷(23)等。這類連接基團是從目前廣泛使用的有機硅保護基發(fā)展而來的，其切割方法與有機硅保護基的脫保護方法有所類似。52（2）另一類較為常見的無痕跡連接基團是通過脫羧基反應來切割目標化合物的連接基團。在酸性條件下，與羧基相連的亞甲基可以被活化，從而發(fā)生脫羧基化作用。如式5、式6所示的反應即是屬于用脫羧基化作用來實現(xiàn)無痕跡切割的兩種分別制備芳基胺基酮和氰基乙脒的固相合成方法。53早在1971年，Kenner首次提出了“安全拉手”的概念，之后因為其顯著的優(yōu)點得到廣泛的應用。所謂“安全拉手”的原理是連接基團的最初化學結構對化合物庫的合成條件是穩(wěn)定的，不發(fā)生反應，但它可以通過一個簡單的化學轉化而活化，隨后可以發(fā)生切割反應將目標化合物從固相載體上切割下來。這類連接功能基的切割過程涉及到兩個步驟：先活化連接基團；然后再實施真正意義上的切割。3、安全拉手型連接基團(safety-catchlinker)安全拉手型連接基團的主要優(yōu)點：可以保證連接基團不受到合成過程中的后續(xù)反應影響54在一系列的固相反應結束之后，經過活化步驟把對切割試劑穩(wěn)定的linkerA轉化成對切割試劑敏感的linkerB，然后再把目標分子從固相載體上釋放出來。通過這樣一種機制，可巧妙地避免后續(xù)反應對連接基團的影響其過程示意圖如式7。55目前，文獻報道的安全拉手型連接基團主要有如下幾種類型：(1)Kenner型安全拉手連接基團

以磺酰胺基作為連接功能基，把氮上的氫原子烷基化而實現(xiàn)連接基團的活化。在N烷基化之前，磺酰胺鍵對強親核試劑和強堿溶液都是穩(wěn)定的；烷基化以后，由于鄰近基團的吸電子誘導效應，使羰基活化，連接功能基從一種穩(wěn)定的形式轉化為不穩(wěn)定形式。56上式8所示，以二氮甲烷作為烷基化試劑，用0.5M的NaOH溶液作為切割試劑制備羧酸，而用0.5M的二烷基胺溶液作為切割試劑則可以制備酰胺。57Maclean報道了酰氨基位于固相載體與磺酰基之間的新型Kenner安全拉手連接基團，可以用于制備磺胺類化合物庫(式9)。58Marshall型安全拉手連接基團的設計原則是基于醚與砜的轉化反應。在活化之前，硫醚基團對切割條件是穩(wěn)定的。經氧化硫醚生成砜后，砜基的吸電子誘導效應使α碳原子活化，有利于親核試劑的進攻。用胺、氨基酸等親核試劑實現(xiàn)對目標化合物的切割(式10)。(2)Marshall型安全拉手連接基團59Wieland型安全拉手連接基團指的是芐位聯(lián)胺連接功能基。芐位聯(lián)胺經氧化可形成具有更高反應活性的二氮烯，從而實現(xiàn)連接基團的活化，然后與各種親核試劑反應來切割目標化合物(式11)。(3)Wieland型安全拉手連接基團60復合型連接基團指的是固相合成體系中存在兩個或兩個以上的基團可以作為連接功能基，其形式圖2所示：4、復合型連接基團(multidetachablelinker)61復合型連接基團主要應用：（1）可以根據(jù)切割條件的不同而制備不同的產物。

如芐胺基Wang樹脂在強酸性條件下(TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯或TFA：三氟乙酸

)切割，得到的產物是酚類；而在氧化性條件下(DDQ：2,3-二氯-5，6-二氰-1，4-苯

)切割，得到的產物是胺類(式12)62（2）使用這種方法對產品的分析檢測非常方便在復合連接基團中引入有利于分析檢測的片斷，使之置于兩連接功能基(圖2的linkerA與linkerB)之間。這樣，有選擇地少量切割連接基團A，得到化合物中就帶有有利于分析檢測的片斷，使分析檢測變得方便、準確且不造成產品的大量損失。分析檢測結果滿意之后，再選擇性切割連接基團B，即可得到目標化合物。63四、固相法在多肽合成領域的應用多肽合成的化學方法是有機合成和藥物合成的一個非常特殊的分支?；瘜W多肽合成，是按照設計的氨基酸順序，通過定向形成酰胺鍵方法得到目標分子。從理論上講這并不復雜，但實施起來卻非常困難。簡單的羧酸與胺之間形成酰胺鍵,一般是先將羧基轉變成一個活潑的羧基衍生物(如酰氯或酸酐)再與胺作用，或者在反應體系中加入縮合劑。64氨基酸之間形成酰胺鍵情況則復雜得多，每一個氨基酸既含有氨基，同時又含有羧基。如果將一種氨基酸的羧基活化，則其可以和同一種或另一種氨基酸分子的氨基反應；如果將幾種氨基酸混合在一起，加入縮合劑，則只能得到由具有多種不同氨基酸順序的多肽組成的混合物。隨著肽鏈的增長，副產物更多，合成將更困難。65Merrifield創(chuàng)建并發(fā)展了多肽的固相合成方法之后，多肽研究領域發(fā)生了劃時代的變化。固相方法以快速簡便的操作和高產率顯示了無可比擬。的優(yōu)越性，應用這一神奇的方法幾乎可以隨心所欲地合成任何多肽。其基本原理如下圖所示:66用固相方法合成具有特定氨基酸順序的多肽必須滿足3個條件：1、通常把要合成多肽的羧基端鍵合到固相載體上，然后從氨基端逐步增長肽鏈；2、需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基加以保護,同時對氨基酸側鏈上的活性基團也要保護，反應完成后再將保護基團除去；3、對參與形成酰胺鍵的羧基必須進行活化。67（一）聚合物載體和連接分子（1）對載體的要求：a.用于固相合成多肽的載體在合成條件下應是惰性的、不溶性的交聯(lián)聚合物，并能夠對單體中活性基團進行選擇性保護和去保護;b.連接反應物到載體上的方法應便于在合成過程中分析反應過程且最后給出目標物時，可以選擇性地從載體上裂解下一部分或全部產物。1、聚合物載體68（2）可供選擇的載體類型a.微孔溶脹型

溶脹型樹脂機械強度高，不易破壞，功能基化反應速度快，負載容量高，但須在溶脹性能良好的溶劑(如氯仿、二氯甲烷、苯、二氯六環(huán)、四氫呋喃等)中使用。b.大孔非溶脹型

非溶脹型樹脂反應后易于過濾回收，活性基的可接近性好，對反應物的擴散阻力小，幾乎可在任何溶劑中使用。在大多數(shù)固相合成多肽中，溶脹型樹脂均優(yōu)于非溶脹型樹脂。例如，聚苯乙烯樹脂被廣泛用于固相多肽的合成，它很容易由單體制得，也容易功能基化。692、連接分子假如與樹脂相連的肽的C末端氨基酸為酰胺類型，可選用Wang法制備的對芐氧苯甲醇(HMP)樹脂。其優(yōu)點在于:①對常用反應介質如二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)等有一定的溶脹能力;②有足夠的機械強度，能經受住脹縮、酸堿、碰撞等苛酷的處理條件;③活性基團均勻地分布于較寬裕的支持體網(wǎng)格空間，這空間將允許延長了的肽鍵有較大的回旋余地;70因為樹脂鍵合的連接分子不僅存在于樹脂顆粒的表面，也存在于顆粒的孔道或孔穴中，所以固相接肽反應的速度要比液相法慢。固相接肽反應的速度為擴散速度等因素所控制，即決定于低分子量反應物和試劑向聚合物鍵合的連接分子部位的擴散速度。所以，固相合成中溶劑的性質也起重要作用。④具有規(guī)則的幾何形狀，較小的厚度，溶質分子可以迅速地從溶液中擴散到各個活性基團附近而不受阻斷。71（二）氨基的保護方法氨基是親核性很強的基團。氨基經?；?，親核性消失，因此對游離氨基實施酰化是保護氨基的基本方法。但是，考慮到肽鍵形成后，應能在溫和條件下將保護基除去，因此對氨基保護基有特殊要求。

氨基保護基：9-芴甲氧羰基(Fmoc)；叔丁氧羰基(tert-butoxycarbonylgroup,簡稱t-Boc)；芐氧羰基(carbobenzoxygroup,簡稱CBz)；對甲苯磺?；?p-toluenesulfonyl,簡稱Tosyl)；三苯甲基(triphenylmethyl,簡稱Trityl)

等72叔丁氧羰基（t-Boc基）是常用的氨基保護基。二叔丁基二碳酸酯(di-t-butyldicarbonate)與氨基酸作用形成t-Boc-氨基酸，可以有效地達到保護氨基的作用。t-Boc基可以在酸性條件下以氣態(tài)形式被除去，產物容易分離。73芐氧羰基（CBz）CBz也是一種常用的氨基保護基。CBz在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，但在催化氫解條件下容易被除去。產物也容易分離。9-芴甲氧羰基（Fmoc）特點是對酸穩(wěn)定，可被堿脫除。Fmoc基團有特征性紫外吸收，易于監(jiān)測反應的進行，給自動化合成多肽帶來方便。74（三）接肽反應方法在固相合成中，將肽鏈連接在高分子載體上的最大優(yōu)點是合成中所有的純化步驟都被省略，而以簡單的沖洗和過濾肽樹脂代之。并且所有反應及操作均在一個反應器中進行，克服了液相法合成長肽分子時在溶液中難以溶解的問題。但為了保證固相多肽合成能得到單一的肽，要求每一步的縮合反應都趨于完全，因此它對合成反應的要求也就比在液相反應時更高。75要求：1、反應快2、側鏈保護基和肽與樹脂的連接在整個接肽反應過程中保持穩(wěn)定。3、為了便于固相反應時進行攪拌或振蕩，一般是用10ml溶劑對1g樹脂的比例。這就限制了反應物的濃度，而不能象液相合成那樣選用很高的反應物濃度，因而反應速度也受到影響。適合于固相上的接肽反應的方法較少，如縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等。761、原位法(DCC法)直接加N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和保護氨基酸到樹脂中進行反應的方法稱為原位法。該法操作簡便，反應速度快，產率高。DCC先與一分子氨基酸的羧基反應，生成類似酸酐的中間產物。這種不穩(wěn)定的中間物能夠進一步與第二分子氨基酸的氨基作用，形成肽鍵。反應中產生的DCU（1,3-二環(huán)己基脲）不溶于大多數(shù)有機溶劑，容易與產物分離。77但其主要缺點是：在反應中生成的副產物(DCU，1,3-二環(huán)己基脲

)在接肽溶劑(DCM)中的溶解度很小，要將其洗滌除去需花費大量的溶劑和時間，甚至雖經多次洗滌，仍會有少量吸附在樹脂內部的空隙中而影響以后的反應。而且活化和縮合在一起進行，前述副產物若不能預先除去，就會有連接在肽上的危險。782、對稱酸酐法在DCC法的固相合成中，如果是采用在加入羧基組分之前先加入DCC的反應步驟，則活化中間體一部分由保護的羧基組分先與DCC反應生成對稱酸酐。對稱酸酐法是一種非常好的接肽方法，操作簡單，產物純度很好，尤其適合小分子肽的合成。優(yōu)點：1、接肽反應后的產物中不存在用DCC法時所產生的、溶解度較小的DCU副產物;792、活性很高，接肽反應的速度很快，大多數(shù)保護氨基酸酐的接肽反應時間只需15～30s即可達到99%，少數(shù)空間阻礙較大的保護氨基酸酐的接肽反應也只要3～8min即可達到99%3、對稱酸酐可以被合成，并以結晶的形式存在，有利于保存。缺點：1、由于制備一分子的對稱酸酐需要兩分子的保護氨基酸，因此對稱酸酐法的保護氨基酸的用量大，比較浪費。2、需要注意的問題是保持樹脂的溶脹性非常重要。80在DCC縮合反應中，加入某些添加劑不僅可減少副反應，而且可提高產率。常用的添加劑有N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，1-羥基苯并三氮唑(HOBt)和3-羥基-4-氧-3,4-二氫-1,2,3-苯并三氮嗪(HOObt)。DCC-HOBt作用機制如圖2所示3、縮合劑法8182（四）未反應氨基的封閉由于在固相合成中，第一輪縮合循環(huán)所留下的未反應氨基將會在第二輪縮合循環(huán)中繼續(xù)和羧基組分反應，產生在肽鏈的內部少掉某一個氨基酸的內缺失肽。這些內缺失肽的理化性質很可能和所需要產物的性質非常相近，從而給最后產物的純化造成很大的困難。為了避免這種缺失肽的生成，一般可以選用主動封閉氨基的辦法。其方法有:83用醋酐或乙酰咪唑乙?；?

用甲酰異丙烯酯甲酰化;

用熒光胺反應;(4)用3-硝基鄰苯二甲酸酐反應;(5)用3-磺酸丙酸的內酸酐反應。最有效的方法：選用醋酐(1mol/L)在三乙胺(0.3mol/L)于DMF或DCM中對樹脂反應20min到2h，或者用醋酐-吡啶(1∶1)在25℃下反應2h，可使殘余氨基被乙酰化。84（五）脫去保護基和樹脂合成肽的最終脫保護基和從樹脂上裂解不僅決定合成的成敗，而且也決定了側鏈保護基的選擇等固相合成多肽的計劃的確立，因此是肽合成中極重要的環(huán)節(jié)。Na/液氨法是較早使用的方法，但因為強堿性反應會引起某些副反應，已不太常用。目前最常用的脫保護基系統(tǒng)是三氟乙酸(TFA)、HF、有機磺酸(TFMSA：三氟甲磺酸、MSA：甲基磺酸)和含硅試劑(TMSBr、TMSOTf：三氟甲磺酸三甲基硅酯

)。85TFA(三氟乙酸)法可以脫除一些不耐酸的保護基，如Boc、t-Bu、金剛烷氧羰基(Adoc)等。本法比較溫和，副反應少，越來越多地應用于固相合成法中。TFA法脫除保護基及裂解樹脂上肽鏈的操作比較簡單，只要在樣品中加入適量三氟乙酸振搖或攪拌至完全溶解，反應時間隨具體情況而定。86此法的基本過程是：將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用（用DCC作偶聯(lián)劑）形成肽鍵。不斷重復這一過程，即可以得到目標多肽產物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產物。Boc固相法合成多肽：即是用經典的Merrifield固相法合成多肽，主要是依據(jù)保護基對酸敏感度的明顯差異，進行選擇性脫除。8788多肽合成的成功與采用的活化、偶聯(lián)方法等有關，但更多的是取決于選擇性保護-脫保護策略。在“最小保護”策略下，醇性和酚性羥基、巰基、甚至羧基，都可以不加保護，但只限于使用中度活潑的?；瘎?，例如活潑酯。假如大量地使用酰化劑，或者當使用更活潑的中間體時，“最小保護”策略就不適用。89在固相載體上增長肽鏈，如果使用酸酐或DCC-HOBt方法，就需要更大的保護，在極端情況下就是“最大保護”。在中