分子生物學第章分子生物學研究方法下

6.1基因表達研究技術6.1.1基因表達系列分析技術6.1.2RNA的選擇性剪切技術6.1.3原位雜交技術6.1.4基因定點突變技術6.1基因表達研究技術目前一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點SAGE是以DNA序列測定為基礎定量分析全基因組表達模式的技術。任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個序列占總標簽數(shù)的比例可分析所對應基因的表達頻率。6.1.1基因表達系列分析技術（SAGE）常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）6.1基因表達研究技術目前二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程6.1基因表達研究技術目前三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點

—標簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。

—原理與ShortSAGE方法類似，只是用了不同的IIS類標簽酶（MmeI），并將程序做了相應修改。LongSAGE技術：6.1基因表達研究技術目前四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構體的過程。類型：平衡剪切、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個基因是否存在選擇性剪切。6.1.2RNA的選擇性剪接技術6.1基因表達研究技術目前五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點選擇性剪切的不同類型RT-PCR檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切6.1基因表達研究技術目前六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點果蠅Dscam基因可以通過可變剪接產(chǎn)生38000多種可能的mRNA異構體6.1基因表達研究技術目前七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點原位雜交（ISH）是用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。分為RNA和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析。6.1.3原位雜交技術6.1基因表達研究技術目前八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點mRNA的互補鏈，雜交信號集中于纖維細胞中。負對照，mRNA的同義鏈,無雜交信號正對照，UBQ10雜交信號遍布于整個胚珠6.1基因表達研究技術目前九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點熒光原位雜交（FISH）首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。6.1基因表達研究技術目前十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結構、催化活性以及結合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術和大引物誘變法，在基因序列中進行定點突變。6.1.4基因定點突變技術6.1基因表達研究技術目前十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點寡核苷酸介導的DNA突變技術6.1基因表達研究技術目前十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點重疊延伸介導的定點誘變6.1基因表達研究技術目前十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點大引物誘變法示意圖6.1基因表達研究技術目前十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.2.基因敲除技術（geneknock-out）通過一定的途徑使特定的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用同源片段替代靶基因片段，進行精確的定位修飾和基因改造，同染色體一起穩(wěn)定遺傳。6.2.1基本原理6.2.2高等動物基因敲出技術6.2.3植物基因敲出技術6.2基因敲除技術目前十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點經(jīng)典遺傳學（Forwardgenetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學（Reversegenetics，反向遺傳學）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進而推導出該基因的功能?；蚯贸╣eneknock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。6.2.1基本原理6.2基因敲除技術目前十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點基因敲除分兩種：

完全基因敲除、條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性。條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應用最為廣泛。6.2基因敲除技術目前十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點用取代型（a）或插入型（b）載體進行完全基因敲除實驗6.2基因敲除技術目前十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點正負篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細胞6.2基因敲除技術目前十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點真核生物基因敲除的技術路線主要包括構建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導入胚胎干細胞純系中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達。顯微注射命中率較高，技術難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術基礎。6.2.2高等動物基因敲出技術6.2基因敲除技術目前二十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點模式動物小鼠中完全基因敲除的主要技術策略與應用。6.2基因敲除技術21目前二十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點T-DNA插入失活技術是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導轉(zhuǎn)化，將一段帶有報告基因的DNA序列標簽整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達，從而使該基因“失活”。6.2.3植物基因敲出技術6.2基因敲除技術目前二十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點植物基因敲除突變體植株篩選a.引物設計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物，目的基因片段(設為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。

b.PCR產(chǎn)物電泳結果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。6.2基因敲除技術目前二十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)6.3.3體外蛋白質(zhì)相互作用技術6.3.4細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究6.3.5RNAi技術及其應用6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前二十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點酵母單雜交系統(tǒng)是20世紀90年代中期發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術。特點：可識別穩(wěn)定結合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。

該體系也是分析鑒定細胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前二十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點①將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子（Pmin）的上游，把報告基因連接到Pmin下游。②將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結構域（AD）融合表達載體導入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結合，就能激活Pmin啟動子，使報告基因得到表達。酵母單雜交的基本原理：6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前二十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點

酵母單雜交的基本原理示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前二十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前二十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結構（modular）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中DNA結合結構域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結構域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨的BD能與特定基因啟動區(qū)結合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄；而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前二十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點

酵母雙雜交的基本原理示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株b.研究的獵物(或稱靶蛋白)蛋白的基因與編碼AD的序列結合c.誘餌(bait)蛋白的基因與編碼BD的序列結合,形成兩段融合基因d.將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于選擇培養(yǎng)基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白（激活報告基因表達）的陽性菌落。酵母雙雜交主要實驗過程：6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點酵母雙雜交系統(tǒng)的應用：發(fā)現(xiàn)新蛋白和蛋白的新功能研究抗原和抗體的作用（細胞內(nèi)）篩選藥物的作用位點建立基因組蛋白連鎖圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.3.3體外蛋白質(zhì)相互作用技術FarWestern印跡技術GST融合蛋白沉降技術蛋白質(zhì)芯片技術等離子表面共振技術免疫共沉淀技術6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點FarWestern印跡技術用32P標記的體外表達蛋白作探針,直接檢測與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達該蛋白的cDNA。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。GST融合蛋白沉降技術6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點GST融合蛋白沉降技術目前三十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結合的蛋白后，可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點。蛋白質(zhì)芯片技術6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前三十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點蛋白質(zhì)芯片的制備目前三十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點將誘餌蛋白結合于葡聚糖表面并固定于納米級厚度的金屬膜上。當?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過時，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結合將使金屬膜表面的折射率上升，導致共振角度的改變。等離子表面共振技術6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術該技術不需要標志物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點是需要專門的儀器。目前三十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點等離子表面共振技術示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前四十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復合物沉淀到試管的底部或微膜上。免疫共沉淀技術6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前四十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點免疫共沉淀示意圖6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前四十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件：①給體與受體在合適的距離（1～10nm）；②給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定

的重疊（這是能量匹配的條件）；③給體與受體的偶極具有一定的空間取向

（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。6.3.4細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究——

熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前四十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點熒光共振能量轉(zhuǎn)移法6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術當?shù)鞍踪|(zhì)A與B不發(fā)生相互作用時，其相對距離較大，無FRET現(xiàn)象；而蛋白質(zhì)A與Ｂ發(fā)生相互作用時，其相對距離較小，發(fā)生FRET。目前四十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點RNAi技術利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名來源于安德魯·法爾1998年在《自然》雜志上的論文。研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經(jīng)過Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，細胞中較長的外源雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效定位目標mRNA。6.3.5RNAi（RNA干涉）技術及其應用6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前四十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介。siRNA具有特殊的結構特征，即5’端磷酸基團和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導合成一種被稱為RNA誘導的沉默復合體（RISC）的核糖體，再由RISC介導切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術目前四十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點RNAi作用機制示意圖目前四十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析6.4.1基因芯片技術原理6.4.2基因芯片的點制過程6.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前四十八頁\總數(shù)六十三頁\編于三點基因芯片（DNAchip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術是能同時監(jiān)測大量靶基因表達的實驗手段，從而迅速準確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。6.4.1基因芯片技術原理6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前四十九頁\總數(shù)六十三頁\編于三點基因芯片技術流程圖6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.4.2基因芯片的點制過程簡易基因芯片

大規(guī)?；蛐酒?/p>

微珠芯片技術6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十一頁\總數(shù)六十三頁\編于三點簡易基因芯片使用機械臂把DNA片段點在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過物理吸附作用達到固定化。也可以直接在玻璃板表面進行化學合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達模式。6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十二頁\總數(shù)六十三頁\編于三點基因芯片可用于進行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖，用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，確定哪些基因的表達受抑制或激活。6.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)可靠性分析

生物學意義分析——差異表達的生物學意義6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析目前五十三頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.5利用酵母鑒定靶基因的功能6.5.1酵母的遺傳學和分子生物學簡介6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與形狀互補6.5.3外援基因在酵母中的功能鑒定6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十四頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.5.1酵母的遺傳學和分子生物學簡介具有和動植物細胞相似的結構特征和細胞生長

發(fā)育過程；很多基因在酵母和動植物細胞中高度保守；容易進行生物化學與分子生物學操作；具有快速生長、無性繁殖、簡便的平板影印能力；酵母是最早完成基因組DNA全序列測定的單細胞

真核生物，有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細胞；酵母單倍體和二倍體細胞在形態(tài)上有相似性，但

存在重大差異：

①二倍體細胞的直徑大約是單倍體的1.3倍；②二倍體細胞呈長形或卵圓形，單倍體接近圓形；③二倍體細胞和單倍體細胞的出芽方式不同。6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十五頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與形狀互補利用整合型質(zhì)?？梢詫湍富蚪M中的任意

基因進行精確的敲除（置換），并通過孢子

繁殖中的四分體分析技術進行觀測和研究?；蛑脫Q一般在二倍體中進行；基因置換方法有兩種：

一步置換法

二步置換法6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十六頁\總數(shù)六十三頁\編于三點6.5.3外援基因在酵母中的功能鑒定將外源基因克隆于酵母表達載體上，轉(zhuǎn)化

野生型或突變酵母菌株，通過觀察酵母的

表型變化或分析細胞中化學成分的變化，

推測該基因的生物學功能。因為酵母細胞中有與動植物細胞比較接近

的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，許多在大腸桿

菌中不產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)的動植物基因在酵

母中表達后往往具有生物學功能。6.5利用酵母鑒定靶基因的功能目前五十七頁\總數(shù)六十三頁\編于三點目前五十八頁\總數(shù)六十三頁\編