細菌一般染色方法

細菌一般染色方法目的要求初步掌握細菌涂片制作，單染色法及革蘭染色法等染色技術。實驗內(nèi)容1．細菌染色一般程序涂片干燥固定初染(媒染)脫色復染(1)涂片臨床標本或液體培養(yǎng)物可直接涂抹于潔凈的載玻片上，固體培養(yǎng)的細菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水，然后取菌少許在鹽水中磨勻，呈輕度混濁。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。(2)干燥涂片最好在室溫下自然干燥，或?qū)吮久嫦蛏希糜诰凭珶艋鹧娓咛幝娓?，切不可在火焰上燒干?3)固定細菌的固定常用火焰加熱法，即將上述已干的涂片在火焰中迅速通過3～5次，溫度以手能摸時熱而不燙為度。目的在于殺死細菌，凝固細胞質(zhì)，改變細菌對染料的通透性。(4)初染不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。(5)媒染通過媒染可增加染料和被染物質(zhì)的親和力。媒染劑還可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。(6)脫色此步驟主要目的是觀察細菌與染料間結合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。(7)復染細菌初染色被脫色后常以復染液復染，便于觀察。復染液的顏色與初染液有明顯不同。2．常用染料原液配制一般制備100ml純酒精飽和溶液所需染料量：美蘭2g～5g；結晶紫7g～14g；堿性復紅3g～7g。3．常用的染色方法(1)單染色法即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸復紅染液。1)染液①呂氏美蘭液美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。②稀釋石炭酸復紅液堿性復紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml，然后用蒸餾水作10倍稀釋即成。2)菌種大腸埃希菌普通斜面培養(yǎng)物。3)染色方法于已做好的涂片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸復紅染液，染色1min，以水沖洗至無顏色流下為止，自然干燥或以遠火烘干后鏡檢。4)結果以美蘭染色者菌體呈現(xiàn)蘭色；以稀釋石炭酸復紅染色的菌體呈現(xiàn)紅色。(2)革蘭染色法1)原理細菌被結晶紫著色后，再經(jīng)媒染劑處理，染成深紫色或紫黑色。如被酒精脫去顏色，經(jīng)復紅復染成紅色，稱為革蘭陰性菌；如不被酒精脫色，則仍為紫黑色，稱為革蘭陽性菌。革蘭染色的原理尚未完全明了，主要有三種學說：①等電點學說革蘭陽性菌的等電點低(pH2～3)，革蘭陰性菌等電點較高(pH4～5)，一般染色液pH值為7.0左右，故電離后陽性菌所帶陰電荷比陰性菌多，因此，攝取帶陽電荷的染料（如結晶紫）多且不易脫色。②通透性學說革蘭陽性菌細胞壁的通透性比陰性菌小，脫色劑較易通過革蘭陰性菌的細胞壁，將染料溶解洗出，故易脫色；陽性菌的細胞壁通透性低，故不易脫色。③化學學說革蘭陽性菌細胞內(nèi)含有某種特殊化學成分，一般認為是核糖核酸鎂鹽與多糖的復合物，它能和染料-媒染劑互相結合，使已著色的細菌不易脫色；革蘭陰性菌體含核糖核酸鎂鹽復合物較少，易被脫色。2)染液①結晶紫染液取結晶紫飽和溶液20ml+1%草酸銨水溶液80ml混合過濾。②盧戈碘液取碘化鉀2ml以10ml蒸餾水充分溶解，然后加碘1g待完全溶解后加蒸餾水至300ml。③脫色劑95%乙醇。④稀釋石炭酸復紅同單染色法。3)菌種大腸埃希菌和葡萄球菌混合菌液。4)方法①初染將結晶紫染液2～3滴加于制好的涂片上，染色1min，水洗；②媒染加盧氏碘液2～3滴染色1min，水洗；③脫色95%乙醇脫色0.5min(無紫色脫落為止)，水洗；④復染加稀釋石炭酸復紅數(shù)滴，染色1min，水洗干后鏡檢。5)結果革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌染成紅色。6)注意事項①涂片不宜過厚，否則脫色受影響，使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌，造成錯誤鑒定。②為防止染液蒸發(fā)而改變濃度，碘液的顏色變淡應棄去。③涂片積水過多會改變?nèi)疽簼舛?，影響染色效果，故每次水洗后應將玻片甩干。④注意細菌的菌齡，一般以18h～24h左右培養(yǎng)物效果最好，菌齡過長影響細菌染色性。(3)萋-納抗酸染色法(ziehl—neelsen)：主要用于結核桿菌和麻風桿菌檢查。1)染液①石炭酸復紅染液取堿性復紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸水溶液90ml混合。②脫色劑3%鹽酸酒精。③復染劑呂氏美蘭染液，同單染色法。2)菌種卡介苗和表皮葡萄球菌混合液。3)方法①初染在已固定的涂片上滴加石炭酸復紅染液，遠火徐徐加熱至有蒸汽冒出，但切不可沸騰，并隨時添加染色液，染色3min～5min，冷卻后水洗。②脫色滴加3%鹽酸酒精脫色至無紅色流下為止，一般為2min。③復染水洗后用呂氏美蘭復染0.5min～1min，水洗干后鏡檢。4)結果抗酸菌染成紅色，非抗酸菌染成藍色。5)注意事項①加熱時火切勿過大，防止染液沸騰。②每張玻片只允許放一份標本，以免陰陽結果混淆。③用過的玻片要徹底洗干凈，防止抗酸菌留在玻片上。④切勿使用染色缸，印干的濾紙只能一片一張，不得重復使用。⑤脫色時間寧長勿短，以免誤診。⑥為防止實驗室感染，標本要高壓滅菌后再制片。(4)潘本漢抗酸染色法(panpenhein)主要用于尿及糞便中抗酸菌檢查。當用萋-納抗酸染色檢出抗酸菌后，用該方法染色，結核分枝桿菌染成紅色，恥垢分枝桿菌染成藍色。1)染液①石炭酸復紅染液見萋-納抗酸染色法。②復染液取薔薇色酸1g先溶于100ml無水乙醇中，然后加美蘭2g(至飽和)，置室溫中4天，使其充分溶解，過濾后加甘油20ml混勻備用。2)標本懷疑腎結核患者的尿液。3)方法①初染于制好的涂片上滴加石炭酸復紅染液數(shù)滴加溫染色2min。②復染傾去染液勿水洗，滴加復染液，邊滴邊傾去，重復4～5次后，水洗、待干、鏡檢。3)結果結核分枝桿菌染成紅色，恥垢分枝桿菌及其他細菌染成藍色。(5)鞭毛鍍銀染色法1)染液①甲液鞭酸5g，三氯化鐵5g，36%甲醛1ml，1%NaOH1ml，蒸餾水100ml。②乙液取AgNO32g溶于100ml蒸餾水中，臨用前用15%氨水滴定，出現(xiàn)棕色沉淀后繼續(xù)滴加氨水直至呈現(xiàn)乳白色薄霧狀為止。2)方法①將奇異變形桿菌在1.4%的軟瓊脂上傳兩代，形成遷徙生長現(xiàn)象。取潔凈玻片一張，于玻片上滴加蒸餾水一滴，然后取上述遷徙生長邊緣的細菌少許，輕輕點于蒸餾水中，使其自然擴散、干燥，切勿火焰固定。②在制好的涂片上滴加甲液染3min～5min，用蒸餾水沖洗。③用乙液沖去殘水后，加乙液0.5min～1min，并在火焰上方稍加熱，用蒸餾水沖洗，干后鏡檢。3)結果菌體染成深褐色，鞭毛染成淺褐色。4)注意事項①細菌培養(yǎng)時傳代次數(shù)因菌種不同可適當增加。②制涂片時菌量不宜過多，動作要輕，切勿研磨，以免鞭毛脫落。③加乙液后加熱溫度不要太高。(6)魏曦氏鞭毛染色法1)

染液飽和鉀明礬液2ml，5%石炭酸液5ml，20%鞣酸液2ml相混合。臨用時加堿性復紅酒精飽和液1ml，混合后過夜，次日過濾后使用。此染液以3日內(nèi)使用效果最好。2)

方法將奇異變形桿菌在1.4%的軟瓊脂上傳兩代，形成遷徙生長現(xiàn)象。取高度潔凈玻片一張，于玻片上滴加蒸餾水一滴，然后取上述遷徙生長邊緣的細菌少許，輕輕點于蒸餾水中，使其自然擴散，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)讓其自干。無需火焰固定。滴加染液染0.5min～1min，水洗待干，鏡檢。3)

結果菌體與鞭毛均呈紅色。(7)芽胞染色法1)染液①石炭酸復紅染液見抗酸染色法。②脫色劑95%乙醇。③復染液呂氏美蘭染液，同單染色法。2)菌種炭疽芽胞桿菌普通斜面培養(yǎng)物。3)方法①初染于制好的涂片上滴加石炭酸復紅染液加熱染3min～5min，勿使染液沸騰。②脫色水洗后用95%乙醇脫色約1min，水洗。③復染加呂氏美蘭染液染1min，水洗干后鏡檢。4)結果芽胞染成紅色，菌體呈藍色。(8)黑斯(Hiss)莢膜染色法1)染液結晶紫染液：取結晶紫飽和液5ml加蒸餾水95ml混合；20%CuSO4水溶液。2)標本提前數(shù)日小白鼠腹腔注射肺炎鏈球菌菌液0.2ml，小鼠死亡后解剖取腹腔液印片。3)方法①

將印片在空氣中自然干燥，無需加熱固定。②

滴加結晶紫染液在火焰上加熱，使有蒸汽冒出為止，勿水洗。③

以20%CuSO4溶液沖洗染液，勿水洗，干后鏡檢。4)結果菌體呈紫色，莢膜呈淡紫色。(9)阿爾伯特(Albert)異染顆粒染色法1)

染液①甲液甲苯胺蘭0.15g，孔雀綠0.2g，溶于95%酒精2ml中再加入蒸餾水至100ml及冰醋酸1ml，放置24h后過濾備用。②乙液將碘化鉀3g溶于蒸餾水10ml～20ml中，再加碘2g等溶解后加蒸餾水至300ml備用。2)菌種白喉棒狀桿菌呂氏雞蛋斜面培養(yǎng)物。3)方法已固定的涂片上加甲液染3min～5min，水洗后，再加乙液染色1min，水洗待干，鏡檢。4)結果菌體呈藍綠色，異染顆粒呈藍黑色。(10)剛果紅染色法(負染色法)：背景著色而菌體不著色的染色方法。1)染液2%剛果紅水溶液，1%鹽酸酒精溶液。2)方法于載玻片上滴加2%剛果紅溶液1滴與少量培養(yǎng)菌混合，涂成均勻厚片待干，以1%鹽酸酒精溶液沖洗，待干后鏡檢。3)結果背景呈藍色，菌體無色。(11)金胺“O”染色法1)

染液①

金胺“O”染液金胺“O”0.1g溶于10ml95%酒精中，另取3ml石炭酸加在87ml的蒸餾水中。將此二液混勻，雖混濁但不必過濾，裝入褐色瓶中，放室溫保存。②0.5%鹽酸酒精。③0.5%高錳酸鉀溶液。2)菌種懷疑結核的痰標本。3)方法在已固定的涂片上加金胺“O”染液染15min，水洗后用0.5%鹽酸酒精脫色2min，水洗，再加0.5%高錳酸鉀液作用3min，水洗，待干，用熒光顯微鏡觀察。4)結果抗酸菌呈亮黃色熒光。（12）美蘭染色法美藍是常用的活體染色染料，當它處于氧化狀態(tài)是呈現(xiàn)出藍色，而還原態(tài)時為無色。用它進行活體染色時，由于活細胞代謝過程中的脫氫作用，美藍接受H后就由氧化轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原態(tài)，故表現(xiàn)出無色；而衰老的細胞由于代謝緩慢或停止，不能使美藍還原，所以呈藍色或者淡藍色。（13）蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色，又稱“蘇木素-伊紅染色”，或“H&E染色”（hematoxylinandeosinstain、HEstain），是組織學最常用的染色方法之一。這種染色方法的基礎是組織結構對不同染料的結合程度不同。染料蘇木精可以將嗜堿性結構染成藍紫色，而伊紅可以將嗜酸性結構染成粉紅色。嗜堿性結構通常包括含有核酸的部分，如核糖體、細胞核及細胞質(zhì)中富含核糖核酸（RNA）的區(qū)域等。嗜酸性結構則通常由細胞內(nèi)及細胞間的蛋白質(zhì)，如路易體（Lewybody）、酒精小體（Mallorybody）、細胞質(zhì)的大部分等。有時，黃褐色也會出現(xiàn)在染色樣本中，這是由于組織內(nèi)原有的色素，例如黑色素等造成的。（14）吉姆薩染液吉姆薩染液（英語：Giemsastain）是一種用于染色體的染色方法。它是羅曼諾夫斯基染色法的改進版本。以它的發(fā)明者，德國漢堡科學家古斯塔夫·吉姆沙命名。染色物質(zhì)Giemsa與DNA上的磷酸機團結合，可以用于產(chǎn)生G顯帶并制作染色體組型圖。通過后者，可以觀察到染色體變異，如缺失，易位等。Giemsa在A-T豐富的區(qū)段結合率高，通過顯微鏡可以觀察到該區(qū)段呈暗帶。（15）免疫組織化學免疫組織化學染色法是指在抗體上結合螢光或可呈色的化學物質(zhì)，利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結合反應，檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在，此方式不只可以用來測知抗原的表現(xiàn)量也可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。只要是能夠讓抗體結合的物質(zhì)，也就是具有抗原性的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、病原體等都可偵測。免疫組織化學的優(yōu)勢在于專一性、靈敏度、簡便快速以及成本低廉，所以廣為醫(yī)院采用，通常是借由特定的腫瘤標記來篩選癌癥。免疫組織化學染色法對基礎研究及預防和診療上都是相當重要的一個方法。（16）劉氏染色法劉氏染色法（Liu'sstain），一種將動物細胞染色以便用光學顯微鏡觀察的方法。改良自瑞氏染色法（RomanowskyStain），1953年由臺灣大學劉禎輝教授所研究發(fā)表。簡介相較于其他染色法，劉氏染色法的優(yōu)點是非常快速，染色過程只須2~3分鐘。劉氏染色法在臨床上的應用非常廣泛，主要用作血球染色形態(tài)分類，此外也可以當作組織學的簡易染色，在臨床細菌學上的使用更可以作為陰道分泌物、痰液、膿等檢體的簡單染色劑(SimpleStain)。成份劉氏染色法所用的染液分成LiuA和LiuB兩部份。LiuA含有EosinY，可將細胞質(zhì)和血紅素等染成紅色；LiuB