高效液相色譜使用與維護(hù)課件

高效液相色譜的

使用與維護(hù)浙江省疾病預(yù)防控制中心液相色譜儀器部件日常維護(hù)色譜圖相關(guān)術(shù)語實驗操作與應(yīng)用一些商品化儀器ｄｉoｎeｘHPLC的環(huán)境設(shè)置：良好的接地

專門房間

定制臺面

不間斷電源

HPLC的日常操作條件：

溫度：10～30℃,最好是恒溫；空調(diào)器

相對濕度<80％,最好是恒濕;除濕機

遠(yuǎn)離高電磁干擾、高振動設(shè)備;

有良好的通風(fēng)設(shè)施;通風(fēng)罩溶劑色譜泵自動進(jìn)樣器

HPLC色譜柱檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜流程圖HPLC色譜泵自動進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)溶劑液相色譜的流動相1.流動相特性

（1）流動相（淋洗液，洗脫劑）：組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。3.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。正相液-液分配分離：先選中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)高效液相色譜流動相溶劑的物化性質(zhì)（部分）合適選擇性溶劑液相色譜溶劑選擇范圍

液相色譜流動相溶劑的選擇步驟：●選擇具有合適物理性質(zhì)的溶劑，如沸點、粘度、紫外截止波長等●選擇合適洗脫強度的溶劑：簡單樣品，2≤k’≤5；復(fù)雜樣品，0.5≤k’≤20●改變?nèi)軇┑倪x擇性，使被分離組分具有較高的α值所有溶劑合適物理性質(zhì)溶劑合適保留值溶劑正相色譜：增加溶劑極性，保留時間增大或變?。糠聪嗌V：增加溶劑極性，保留時間又如何變化？洗脫強度與溶劑極性分子之間相互作用有色散力、偶極作用、氫鍵和介電作用。某一溶質(zhì)與其它分子相互作用大小的程度可以用極性大小表示。極性越大,它與其它分子的作用力越大。“極性”溶劑容易吸收和溶解“極性”物質(zhì)。溶劑洗脫強度指流動相中溶劑的洗脫能力,它不僅與流動相，而且與固定相的極性有關(guān)。在正相色譜中,“溶劑洗脫強度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大,洗脫能力越小。溶劑強度圖反相色譜THF/H2OACN/H2OMeOH/H2O020406080100正相色譜020406080100甲醇戊烷異丙基氯二氯甲烷乙醚乙腈050.60.75

溶劑選擇性分類一般地說,改變?nèi)軇┍壤烧{(diào)節(jié)流動相的極性,從而使得組分的容量因子落在合適的范圍內(nèi)。但由于分子間相互作用的類型相同,分離因子變化不大。因此專門研究了各種溶劑的選擇性,并將常用溶劑進(jìn)行分類。質(zhì)子給予體偶極相互作用質(zhì)子接受體溶劑選擇性分類三角形圖Xe

Xd

Xn12345678純質(zhì)子接受體強偶極中性化合物純質(zhì)子給予體1組：脂肪醚（純質(zhì)子接受體）2組：脂肪醇（質(zhì)子接受-給予體）3組：吡啶衍生物、四氫呋喃（質(zhì)子接受體，易極化）4組：乙二醇、芐醇、乙酸、甲酰胺（質(zhì)子給予體）5組：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶極距）6組：脂肪酮、酯、二氧六環(huán)、腈7組：芳烴、芳醚、硝基甲烷8組：氟代醇、氯仿、水（質(zhì)子給予體）質(zhì)子給予體偶極相互作用質(zhì)子接受體正相色譜中的溶劑選擇性醚1234二氯乙烷5乙腈678CHCl38主溶劑：己烷按溶劑分子的特殊作用類型分類,采用三個不同的常數(shù)表示：①Xe(接受質(zhì)子參數(shù))~易與含羥基的分子作用(如酸類、酚類)；②Xd(給質(zhì)子參數(shù))~易與堿性化合物作用(如胺、亞砜等)；③Xn(強偶極參數(shù))~易與偶極距較大的溶質(zhì)分子作用(如硝基化合物、腈、亞砜和胺類等)。通常把常用溶劑分成八組。同一組溶劑的三個選擇性參數(shù)相近，其選擇性相似。當(dāng)某一溶劑不能提供足夠的分離選擇性時,那么更換同組的其它溶劑亦不能提高選擇性。改變?nèi)軇r,只有從距離較遠(yuǎn)的溶劑組挑選,才可能使選擇性有較大變化。因為當(dāng)溶劑和樣品分子的各種相互作用的相對重要性發(fā)生明顯變化時,流動相的選擇性才會發(fā)生最大程度的改變。對溶劑的要求水：去離子水自動純水儀重蒸水重蒸水裝置

純凈水商品瓶裝水

有機溶劑:色譜純（國產(chǎn)、進(jìn)口、進(jìn)口分裝）重蒸旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物波長(nm)純化水去離子水吸光率水有機溶劑溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫甲醇乙睛正己烷分析純級和HPLC級溶劑的吸光度比較圖水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.鬼峰的出現(xiàn)流動相溶劑的處理

水將一般的蒸餾水，加入少許高錳酸鉀，在pH9—10的條件蒸餾，可用于常規(guī)洗脫。用于梯度洗脫的水，應(yīng)進(jìn)行二次蒸餾。

不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。有機溶劑的提純◆用蒸餾法可除掉大部分有紫外吸收的雜質(zhì)?！粞趸X或硅膠柱可除去溶劑中的極性化合物。◆氯仿中（少量甲醇）先水洗，再蒸餾?！羲臍溥秽寡鮿┒』妆椒樱┒鴱娏椅兆贤饩€，可蒸餾。為了防止爆炸，蒸餾終止時，在蒸餾瓶中必須剩余一定量的液體。過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動無在線脫氣應(yīng)注意：1）每天脫氣2）如使用氦脫氣，對混合溶劑脫氣時間不能過長過濾與脫氣

流動相過濾器

負(fù)壓抽吸流動相的保存

保存于聚乙烯瓶中的超純水

保存于棕色玻璃瓶中的超純水

選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（４）低粘度（粘度適中）若使用高粘度溶劑，勢必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離。（５）化學(xué)穩(wěn)定性好（６）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強烈吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量。對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達(dá)到最高靈敏度。色譜泵及液相色譜對泵的要求穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜更為關(guān)注滯后體積僅僅應(yīng)用于梯度實驗?zāi)康模涸谌魏吻闆r下保持最高精度常見液相色譜泵串聯(lián)式往復(fù)泵并聯(lián)式微體積往復(fù)泵單向閥結(jié)構(gòu)拋光面透明塑料墊片寶石球單向閥原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭被動式單向閥主動式單向閥(電磁閥）梯度洗脫技術(shù)●梯度洗脫的特點●梯度洗脫的主要條件●梯度洗脫的基本原理梯度洗脫（溶劑程序）：通過改變流動相的組成來調(diào)整組分的k’值，改變分離因子α值，以達(dá)到最短時間內(nèi)得到最佳分離的目的。為什么程序升溫在液相色譜中沒有受到青睞？在液相色譜中最低溫度和最高溫度受到流動相的黏度和沸點的限制；同時它的溫度效應(yīng)比較小。1．梯度洗脫的特點（1）改善分離,加快分析速度；（2）改善峰形,減少拖尾,有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強烈滯留的組分不容易殘留在柱上,保持柱性能長期良好；（5）下次分析時,流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異,可能會引起基線漂移。2．梯度洗脫的主要條件①A流動相/弱溶劑組成；②B流動相/強溶劑組成；③梯度時間；④梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強溶劑A%time125梯度洗脫的基本原理L.R.Snyder建立了線性梯度洗脫方程：lnk’=lnk’0－b(t/t0)這里,k’為梯度洗脫過程中任一時刻的容量因子；t為梯度時間；b為斜率----梯度連續(xù)變化的斜率；t0為死時間。而洗脫時k’和k’0與溶液組成間的關(guān)系為：lnk’=lnk’0－S式中為強溶劑在洗脫液所占的體積分?jǐn)?shù)；S是與強溶劑和試樣有關(guān)的參數(shù)。對RPLC分離小分子，S一般為3-5。k’0為=0時的P’值。結(jié)合上面二式,得

b=(St0)/tt0=V0/t在梯度完成時,t=tG。此時,為A和B兩溶液中強洗脫劑組成的差,即=,這時：

b=V0/(tGF)

/tG為梯度變化速率,S值可由前式求得?？梢?b值是可以求出的。求出b值后,可以初步確定一下各種物質(zhì)的k’值,為更好地選擇分離條件提供依據(jù)。③

選擇幾個梯度洗脫時間tG,確定S值；④

確定tG下的最佳值(小的tG,大的流速)；⑤可以進(jìn)行非線性梯度洗脫,使欲分離物與其它物質(zhì)盡可能分開；⑥若分離效果不好,可以調(diào)整pH值、鹽類型、有機溶劑組成等方法使分離物的峰與其它峰盡可能分開。①在全濃度范圍內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫,要確信欲分離物質(zhì)在梯度變化范圍內(nèi)可以被洗脫，初步觀察分離物的位置；②

確定梯度使用范圍,的大??；確定最佳化的梯度分離條件的實現(xiàn)步驟：

梯度操作注意事項：○兩個流動相溶劑要能互溶，即極性不要相差太大○吸附色譜只能是在小范圍內(nèi)變化，因此在吸附色譜中很少用梯度洗脫（為什么？）○折射檢測器不適應(yīng)于梯度洗脫（為什么？）梯度：高壓混合高壓梯度使用多臺色譜泵，在泵后混合配置靈活、簡單，脫氣簡單易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積梯度：低壓混合低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當(dāng)，梯度的

準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)

體積）設(shè)計合理梯度洗脫125梯度滯后：系統(tǒng)體積的影響死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意∶滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度阻尼器混合器梯度滯后大小的影響滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚2分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min實際梯度會比設(shè)置值晚20分鐘響應(yīng)，不能接受滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好普通分析型液相色譜的滯后體積為2~4ml滯后體積變化的影響設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)色譜柱的結(jié)構(gòu)

色譜柱由柱管、填料、密封圈、過濾板、柱頭等組成。應(yīng)特別注意柱頭規(guī)格及無死體積連接的特性。柱規(guī)格制備柱分析柱微徑柱液相色譜(MicroboreHPLC)毛細(xì)管液相色譜(CapillaryHPLC)快速柱：高效短柱，如4.6×30mm,3mODS柱分離模式的選擇樣品溶于有機溶劑溶于水溶于四氫呋喃非離子化離子化溶于有機溶劑溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅膠的正相模式用鍵合相的正相模式用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式低分子凝膠滲透色譜用鍵合相的反相模式抑制電離反相鍵合相色譜離子對鍵合相的反相模式用硅膠的正相模式離子交換模式凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜大孔填料的離子交換模式用大孔填料的反相模式分子量>2,000分子量<2,000

反相分配色譜極性:固定相<流動相 固定相-非極性 流動相(甲,乙醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-極性 非極性物質(zhì)后出峰正相吸附色譜 極性:固定相>流動相 固定相-極性 流動相(己烷,庚烷)-非極性 極性物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相&反相色譜

硅膠基質(zhì)-pH3~8Al2O3

.nH2O-pH1~14

聚合物基質(zhì)-pH1~14高或低pH下,硅膠會溶解化學(xué)修飾困難孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜,孔徑不均勻?qū)е轮Р粔蚋?有機溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損柱填料基質(zhì)C-18柱---性能影響因素鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑硅膠純度 ?填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸 ?填料床的長度和內(nèi)徑顆粒形狀 ?球型或不規(guī)則型粒徑 ?平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積 ?顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/gram表示孔徑 ?顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?色譜柱物理性質(zhì)C-18柱---性能影響因素鍵合類型 ?單體鍵合-鍵合相分子與基體單點相連 ?聚合體鍵合-鍵合相分子與基體多點相連碳覆蓋率 ?與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量封端

?鍵合步驟之后,用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來色譜柱化學(xué)性質(zhì)C-18柱---性能影響因素A類硅膠OriginalZORBAXSIL(1970s)由于帶負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高(硅羥基的pKa低),導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾B類硅膠(高純)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金屬含量低,硅羥基pKa高,堿性化合物不發(fā)生拖尾ZorbaxRx-SIL:11種金屬<35ppm(未檢出其他雜質(zhì),<1ppm);99.995%純度的二氧化硅C-18柱---性能影響因素色譜柱尺寸---對色譜分離的影響 ?短柱(15-100mm)-運行時間短,柱壓低 ?長柱(150-250mm)-分辨率高,運行時間長 ?窄徑柱(2.1mm)-檢測器靈敏度高 ?寬徑柱(3-21.2mm)-載樣量高C-18柱---性能影響因素顆粒形狀---對色譜分離的影響

當(dāng)使用黏度較大的流動相50:50=MeOH:H2O時,球型顆?？梢越档椭鶋?延長色譜柱壽命C-18柱---性能影響因素球形不規(guī)則形粒徑---對色譜分離的影響

較小的顆粒柱效較高,但會引起柱壓過高.3.5μm粒徑的常用于分離復(fù)雜的多組份樣品,而組份單一的樣品多采用5μm的粒徑1.8μm3.5μm 5μm 7μm 10μm表面積---對色譜分離的影響

高表面積對于多組份樣品的分離具有較強的保留能力,柱容量和分離度.表面積低的填料通常能迅速達(dá)到平衡狀態(tài),對于梯度淋洗尤為重要C-18柱---性能影響因素孔徑---對色譜分離的影響

大孔的填料顆?？梢匝娱L溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時間,達(dá)到充分分離,改善峰形樣品MW4,000,選擇80?的孔徑樣品MW>4,000,選擇300?的孔徑大孔徑填料適用于大分子分析大孔徑300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽分子量雖小但hydrodynamicvolume(水動力學(xué)體積)較大的分子Poroshell色譜柱高流速下,高柱效分析大分子的蛋白質(zhì)和多肽色譜柱填料孔徑必須適合待測物分子自由進(jìn)出填料孔,與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配300?孔徑可改善蛋白質(zhì)和多肽峰形0.2000.020.040.060.040.160.18300SB-C18(300?)SB-C18(80?)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管緊張素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔徑,分子量對峰寬的影響(梯度分離)選擇合適的填料孔徑分析大分子可獲得最佳峰形300?孔徑可改善大分子的峰形

色譜柱:4.6x150mm,5mm流動相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min溫度:RT 檢測器:UV282nm溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑窄的峰寬表明待測分子進(jìn)入填料孔沒有受到阻礙SB-C3(80?)300SB-C3(300?)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰樂菌素)MW.926分子量雖小但hydrodynamicvolume(水動力學(xué)體積)較大的分子鍵合類型---對色譜分離的影響

單齒鍵合：提高傳質(zhì)速率,加快色譜柱平衡雙齒鍵合：增加色譜柱穩(wěn)定性,增加色譜柱的載樣量C-18柱---性能影響因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO碳覆蓋率---對色譜分離的影響

高碳覆蓋率：提高分辨率,分析時間長低碳覆蓋率：縮短運行時間封端---對色譜分離的影響

封端：減輕待測組份與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象對于極性樣品,未封端與經(jīng)過封端處理的色譜柱在選擇性上有明顯差異C-18柱---性能影響因素固定相鍵合二甲基硅烷

封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)傳統(tǒng)鍵合及封端技術(shù)

取代基：五個旁側(cè)基團(tuán):異丙基ZorbaxStableBond空間位阻保護(hù)---抗水解能力鍵合相流失,保留減弱另一個裸露的硅羥基,潛在的拖尾因素普通硅膠柱低pH<2不穩(wěn)定,發(fā)生水解空間位阻保護(hù)

液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um部件號：880975-906流動相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6溫度：500C流速：1.0mL/min.12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5μm流動相:44%25mM磷酸,pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min溫度:25°C檢測:UV250nm可電離的組份的分離可能會隨pH變化發(fā)生顯著變化—甚至很小的0.05–0.25個pH變化單位.樣品:ketoprofen

ethylparaben

Hydrocortisonefenoprofen

propyl

paraben

Propranolol

ibuprofen液相柱---保留值與pH的關(guān)系0.25個pH液相柱---保留值與pH的關(guān)系pH變化：0.2個pH(7.0~7.2)保留時間改變：1.2分鐘(13.6~14.8分鐘)保留時間隨pH改變不明顯保留時間隨pH改變不明顯(酸性環(huán)境中)保留時間酸性組份中性組份堿性組份方法穩(wěn)定區(qū)方法波動區(qū)(pKa+1.5) 方法穩(wěn)定區(qū) 液相柱---保留值與pH的關(guān)系液相柱---保留值與pH的關(guān)系StableBondC18pH1~8

Bonus-RPpH2~9

ExtendC18pH2~11.5EclipseXDBC18pH2~9復(fù)雜組分的流動相pH選擇技巧色譜柱:ZORBAXExtend-C184.6x150mm,5mm流動相:30%緩沖液:70%MeOHpH7緩沖液20mMNa2HPO4pH11緩沖液20mMTEA流速:1.0mL/min

溫度:RT 檢測器:UV254nm0512,345Time(min)76Extend-C18pH71.Maleate馬來酸鹽2.Scopolamine東莨菪堿pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黃堿pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol內(nèi)徑ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0Extend-C18pH1105101234Time(min)657高pH下,堿性成分的保留增加待測物pKa+1.5以外的流動相pH可保證方法的穩(wěn)定性鍵合相-適用pH范圍StableBond,pH1-81.使用空間位阻大的硅烷2.未-封端EclipseXDB,pH2-91.致密鍵合的二甲基烷基硅烷2.專利技術(shù)雙-封端Bonus-RP,pH2-91.極性烷基固定相2.使用空間位阻大的硅烷3.三封端Extend-C18,pH2-11.51.獨特的雙齒鍵合結(jié)構(gòu)2.雙封端SiOSiOSilicaSupportC18C18SiONHOSilica-based色譜柱PackingwithAlkyl/am內(nèi)徑eStationaryPhaseORRSiOHSiOSiRRROOHRCHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1CH3R1R1R1CH3R111SiSiPGPGPGR1R1極性官能團(tuán)低pH下,分析酸性,堿性和中性組分,峰形優(yōu)異,柱壽命長中等pH下,分析酸性,堿性和中性組分,尤其堿性組分峰形優(yōu)異,柱壽命長中等pH下,分析酸性,堿性和中性組分,可用于100%全水相,尤其極性組分峰形優(yōu)異,柱壽命長中~高pH下,分析酸性,堿性和中性組分,,尤其堿性組分峰形優(yōu)異,柱壽命長柱性能測試:應(yīng)指定色譜條件和檢測物質(zhì)1．理論塔板高度2．峰不對稱因子：應(yīng)小于或等于1.23．相對保留值和分配比的重現(xiàn)性：精密度應(yīng)優(yōu)于5%和10%4．柱阻力因子：=0.1Pt0dp2÷(109L2)，多孔填料500-10005.折合塔板高度

1、對硅膠基鍵合相填科，水溶液流動相的pH值不得超出2—8.5的范圍，溫度不宜過高。

2、柱子在酸性或堿性條件下使用之后，應(yīng)依次用水、甲醇清洗.3、對暫時不用而需要較長時間保存的柱子，要用純甲醇清洗，柱子兩端用金屬螺帽封閉，保存于干凈的有機溶劑中。

使用與維護(hù)

5、要防止流動相逆向流動，否則將使固定相層位移，柱效下降。

4、要防止色譜柱被振動或撞擊，否則柱內(nèi)填料床層產(chǎn)生裂縫和空隙，會使色譜峰出現(xiàn)“駝峰”或“對峰”。

色譜柱的在線保護(hù)裝置保護(hù)柱

1、除去柱上端固定相變色部分(約3mm左右)，再補充新的固定相。

2、色譜柱吸附未被洗脫成分時，柱效將明顯下降，選合適的溶劑進(jìn)行洗凈。

可能提高柱效的方法

3、采用梯度洗脫時，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，以重新建立起始的平衡來得到再生。液相色譜的檢測器常規(guī)檢測器示差折光檢測器（RefractiveIndex）紫外/可見光吸收檢測器（UV-Vis）熒光檢測器（Fluorescence）蒸發(fā)光散射檢測器（EvaporativeLightScattering）其他檢測器（OtherDetectors）高端檢測器光電二極管矩陣檢測器（PhotodiodeArray）質(zhì)譜檢測器（MassSpectrometry）HPLC檢測器應(yīng)提供的功能對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象并不是所有的檢測器是線性的受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距用于HPLC的檢測器沒有任何一種單獨的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！HPLC檢測器可以分為：溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（Solutepropertydetectors）對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動相的變化（選擇型）整體性質(zhì)檢測器（Bulkpropertydetectors）不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）不同種類的檢測器的分類整體性質(zhì)示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器電導(dǎo)檢測器溶質(zhì)性質(zhì)熒光檢測器固定波長可變波長光電二極管矩陣電化學(xué)檢測器放射化學(xué)檢測器氮/硫檢測器質(zhì)譜檢測器紫外/可見光檢測器理想的HPLC檢測器高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性靈敏度：信噪比靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N=3定量限（LOQ）：S/N=10好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性 6:1NS方法開發(fā)的過程Adaptedfrom:Snyder,L.R.;Kirkland,J.J.;Glajch,J.L;PracticalHPLCMethodDevelopment2ndEd.,Wiley-Interscience,NewYork,1997,p.21.得到樣品信息，確定分離目標(biāo)2.確定特定HPLC過程、樣品預(yù)處理等的需求3.選擇檢測器及其條件4.選擇HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件5.優(yōu)化分離條件6.檢查特定過程的問題及需要7.定量校正8.日常使用的確認(rèn)選擇液相色譜的檢測器要考慮的因素：你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）梯度還是等度靈敏度需求是否有雙檢測的需求選擇液相色譜的檢測器通用檢測器 RIELSD MS靈敏度 mg ng pg 線性范圍 104 否 103流速敏感 是 否 是溫度敏感 是 否 否破壞性 否 是 是選擇性檢測器 ABS FL ECCond MS靈敏度 ng pg fg pg pg線性范圍 105 103 106 105 103流速敏感 否 否 是 是 是溫度敏感 否 否 是 是 是破壞性 否 否 是 否 是可供選擇的液相色譜檢測器Absorbance(UV/Vis)ChemiluminescenceCircularDichroism(Chiral)ConductivityElectrochemicalEvaporativeLightScatteringFluorescenceLaserInducedFlorescenceLaserInterferometerLaserPolarimeterMassSpectrometric(LC/MS)NitrogenSpecificDetectorNuclearMagneticResonanceOfflineMethodsOpticalRotationDetectorPhotoDiodeArrayRefractiveIndexRadiochemicalSulfurSpecificDetectorViscometryMultiAngleLightScattering示差折光（RefractiveIndex）檢測示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀(jì)六十年代末、七十年代初）通常被認(rèn)為是一種通用檢測器檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì)－非特異性任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值RS示差檢測器－基本原理檢測基于被分析物的折光指數(shù)的差異測量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別當(dāng)折光指數(shù)差異最大時靈敏度也達(dá)到最大并不測量絕對的折光指數(shù)而是測定折光指數(shù)的差別（DifferentialRI）典型的應(yīng)用領(lǐng)域沒有紫外吸收、熒光的化合物，例如：碳水化合物（Carbohydrates）、聚合物（Polymers）脂肪酸（FattyAcids）及油脂類（Lipids）示差檢測器的優(yōu)、缺點優(yōu)點通用檢測器容易使用；通常來說是比較耐用的檢測器維護(hù)成本低缺點靈敏度低、選擇性差對流速、溫度及粘度的變化敏感不能用于梯度方法色譜峰可能是正的，也可能是負(fù)的示差檢測器的優(yōu)點－通用性根據(jù)隨機統(tǒng)計；任何一對液體都會有大約0.07的折光率差異因此；除非正好被分析的樣品與溶液的折光指數(shù)完全相同，都會被檢測到SeparationofLactose-ReduceMilkMV-20-100102030405060708090100110Minutes4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.511.011.512.012.5葡萄糖乳糖半乳糖示差檢測器的缺點－靈敏度缺乏靈敏度－和其他檢測器相比，RI檢測器一般靈敏度較低UV@254nmS/N>15000:1MV-30.00-25.00-20.00-15.00-10.00-5.000.005.0010.0015.00Minutes2.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.5AU0.000.020.040.060.04RefractiveIndexS/N~125:1流動相： MeOH/H2O60:40流速： 1.0mL/min色譜柱： C18色譜柱溫：30oC檢測溫度：35oC樣品： ParabenMixture示差檢測器的缺點－不適宜作梯度流動相： A=CH3CN/H2O75:25 B=CH3CN流速： 1.4mL/min色譜柱： NH2色譜柱溫： 30oC檢測溫度： 35oCMV-2600-2400-2200-2000-1800-1600-1400-1200-1000-800-600-400-2000200400Minutes0246810121416182022242628300%B25%BChromatographyForum:IsRIwithaReversePhasegradientpossible?

ByXXXXXXXXX:Ihaveagoodseparationofamulti-substituted,cyclohexanethatfullyresolves~12differentoligomers.IcandetectthecomponentsbyMS,butIwouldliketouseastandardLCdetectorinstead.Thereisvirtuallynoadsorptionabove230nmandbelow230nmpicksupsolventinterference.I’mconsideringusingRIdetectionandafterwardsubtractingablankrun.IsthereanyhopeofthisworkingorwouldIbewastingmytime?示差檢測器的缺點－對溫度敏感流動相－甲醇@0.25mL/minute檢測器溫度－35?C；沒有使用柱溫箱Temp.(DegC)18.519.019.520.0MV-1.000.001.002.00Minutes51015202530354045505560657075室溫變化RI基線吸光度（AbsorbanceUV/Vis）檢測目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大吸光度檢測器（UV/Vis）－優(yōu)點這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabensat254nm吸光度檢測器（UV/Vis）－缺點由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少5～10nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響背景吸收的影響背景吸收降低了線性范圍多數(shù)流動相有紫外吸收實際濃度理想10吸光度210背景吸收背景吸收對紫外檢測器噪音的影響UVSpectrumofEluentswith0.1%TFAAgainstHPLCGradeH2OBlankAU0.0000.400.500.600.700.800.901.0001.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20with0.1%TFA50%ACNwith0.1%TFA溶劑混合的基線噪音色譜條件色譜柱： C18,

5μm,3.9x150mmat35oC.流動相： A:0.1%TFAinWater. B:0.1%TFAinAcetonitrile.梯度：5-40%Bin35min.流速：1.0mL/min.樣品：水（10μLinj.vol.）檢測：214nm圖1；好的梯度系統(tǒng)

圖2；一般的二元梯度系統(tǒng)圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)為何如此重要？五個小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中?；€噪音對積分的影響1.2241.1831.183Caffeine@271nm熒光（Fluorescence）檢測發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光基態(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動能（2）發(fā)射（3）1.分子在吸收UV或可見光后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，分子達(dá)到不穩(wěn)定的高能量狀態(tài)。2.電子失去過剩的能量成為振動能，并達(dá)到最低的激發(fā)單重態(tài)。3.電子失去能量達(dá)到基態(tài)時發(fā)出熒光共軛及芳香族化合物最容易有熒光現(xiàn)象熒光檢測器原理熒光檢測器的應(yīng)用環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等食品、飲料食品中的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類殺蟲劑黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）維生素?zé)晒鈾z測器的優(yōu)點選擇性提高靈敏度提高（在pg/fg范圍）低背景技術(shù)mV-0.100.0000.400.50Minutes5.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.006.8949.639MDA及MDMA柱上200pgExcitation=280Emission=360熒光檢測器的缺點不是所有化合物都有熒光，需要衍生檢測器對溶解氣體及其他淬滅物質(zhì)（如甲醇）敏感對Ex及Em的最佳，易受溫度、溶劑的極性和粘度、溶劑的pH值及樣品濃度影響多數(shù)儀器的批次間差異較大，同一型號的不同熒光檢測器會得到不同的結(jié)果。有的儀器信號及噪音大于另一臺2～3倍，光電倍增管的特征是導(dǎo)致這個現(xiàn)象的原因。溶劑中溶解的氣體對響應(yīng)值的影響MinutesColumn-PAHColumn@27oCEluentA:WaterEluentB:AcetonitrileGradient:60%Bto100%Busingcurve9in12minutesHold11minutesBacktoinitialconditionsFlowRate1.2ml/minInjection:20ulTimeprogrammedwavelengthchanges20.521.022.01000MV充分脫氣未充分脫氣FluorescenceDetector1231.Benzo(b)flouranthene-400ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200ppb3.Benzo(a)pyrene-200ppb濃度對芘（Pyrene）最大激發(fā)波長的影響EmissionExcitation~10–3M~10–5M在正己烷中From:Turro,N.J.,ModernMolecularPhotochemistryMenloParkCA,Benjamin/CummingsPublishing,1978蒸發(fā)光散射（EvaporativeLightScattering）用氮氣把流動相吹成細(xì)霧狀流動相的液滴通過一個預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集PMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比

例關(guān)系蒸發(fā)光散射檢測器原理EvaporativeLightScattering簡稱：ELSDELSD－優(yōu)點及應(yīng)用領(lǐng)域通用型－比流動相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測可以作梯度實驗；檢測下限可到納克級水平對環(huán)境條件不敏感；可以使用有強紫外吸收的溶劑作流動相應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物ELSD－缺點不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽）要求使用霧化氣源（典型的是氮氣）不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化破壞性技術(shù)蒸發(fā)出的溶劑要因到戶外或通風(fēng)櫥里對揮發(fā)性化合物的檢測不理想一般得到的是非線性校正曲線某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器光電二極管矩陣（PhotoDiodeArray）

PhotoDiodeArray簡稱：PDA或DADPDA檢測器－特點三維水平的吸光度檢測器二極管矩陣檢測器是在1982年首度出現(xiàn)的在整個UV-Vis帶寬上檢測吸光度都需要相應(yīng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析PDA檢測器的用途及要求光電二極管檢測器可以提供許多又用的功能光譜信息色譜峰純度譜庫擬合像其他所有的UV/Vis檢測器一樣，需要：高的信噪比；好的線性另外；還需要：光學(xué)分辨率光譜靈敏度及光譜分析軟件光學(xué)分辨率（帶寬）好的光譜分辨率可得到高質(zhì)量的光譜信息230.00250.00270.00nmBenzene3.0nmvs

1.0nm

損失分辨率，UV最大波長移動

1.0nm3.0nm190nm5.0nm分辨率與色譜性能高分辨率給出更多數(shù)據(jù)點（同樣波長范圍）高分辨率有更好的線性低分辨率的數(shù)據(jù)文件尺寸較小寬的光學(xué)帶寬可以得到更高的光通量（靈敏度）1.2nm14.4nmPDA的優(yōu)點及缺點優(yōu)點通用的UV/Vis檢測好的選擇性、線性提供色譜峰的UV/Vis光譜圖（峰確認(rèn)）可提供純度估計缺點低光學(xué)通量（較窄的帶寬通量）與普通UV/Vis相比更復(fù)雜，容易漂移燈輸出能量隨時間降低色譜圖：HPLC圖形結(jié)果（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強度，橫坐標(biāo)為保留時間。←色譜峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應(yīng)值液相色譜圖相關(guān)術(shù)語色譜峰－Peak色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號的微分曲線峰底－PeakBase峰的起點與終點之間連接的直線峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬－PeakWidth在峰兩側(cè)拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側(cè)相交兩點之間的距離液相色譜圖相關(guān)術(shù)語峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差；σ－StandardError0.607倍峰高處所對應(yīng)峰寬的一半拖尾峰－TailingPeak后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰－LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰－GhostPeak并非由試樣所產(chǎn)生的峰；亦稱假峰液相色譜圖相關(guān)術(shù)語基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲；N－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動譜帶擴展－BandBroadening由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象液相色譜圖相關(guān)術(shù)語死時間，t0－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間保留時間，tR－Retentiontime組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間死體積，V0－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積保留體積，VR－Retentionvolume組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積高效液相色譜儀器出現(xiàn)故障可以從多方面入手1、觀測：儀器運轉(zhuǎn)的參數(shù)；從部件的運轉(zhuǎn)情況推測，如壓力、流速的變化.色譜圖的形狀；如出峰時間、峰形從數(shù)據(jù)結(jié)果中分析各種流動相的量與質(zhì)；2、伶聽：儀器運轉(zhuǎn)的聲音、噪聲3、促摸：溫度、滲漏維護(hù)流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器手動進(jìn)樣器檢測器吸濾頭－－定期清洗，更換溶劑時單向閥－－定期清洗，壓力波動大時泵－－自動清洗在線過濾器－壓力大時清洗材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5％稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗吸濾頭故障：寶石球或塑料墊片受污導(dǎo)致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：打開排液閥，以異丙醇為流動相輸液拆下單向閥，放入異丙醇中，超聲波清洗單向閥故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力偏高措施：5％稀硝酸，超聲波清洗判斷依據(jù)：關(guān)閉排液閥，斷開出口管路，設(shè)定流速1mL/min，如壓力>3kgf/cm2，則堵塞。線路過濾器排液閥壓力傳感器線路過濾器流動相泵的保養(yǎng)：使用流動相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相交換時要防止沉淀；

避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染；柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗?；若分析柱長期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機溶劑保存并封閉；柱的保養(yǎng)：色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間單次樣品運行時間=分析時間+色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間=10倍柱內(nèi)體積÷流速

4.6x50 0.5mL 5min 4.6x30 0.3mL 3min 4.6x15 0.15mL 1.5min 4.6x150 1.54mL 15min

2.1x50 0.10mL 5min 60sec 2.1x30 0.06mL 3min 36sec 2.1x15 0.03mL 1.5min 18sec

色譜柱 柱內(nèi)平衡時間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色譜柱 柱內(nèi)平衡時間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)0.2mL/min1.0mL/min清洗液相色譜柱沖洗色譜柱---用比流動相更強的溶劑反相色譜柱用以下溶劑至少各25mL沖洗色譜柱(分析柱)不含緩沖鹽的流動相100%甲醇100%乙腈75%乙腈+25%異丙醇100%異丙醇100%二氯甲烷*100%己烷**若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱,則在重新使用反相流動相以前,必須用異丙醇沖洗色譜柱!!!正相色譜柱用以下溶劑至少各50mL沖洗色譜柱(分析柱)50%甲醇+50%三氯甲烷100%乙酸乙酯燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。樣品池要保養(yǎng)實驗操作樣品前處理流路檢查排氣、溶劑更換色譜柱的連接

各種錐箍和管路接頭長度示意圖:色譜柱的連接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積錐箍錐度不合適造成滲漏

色譜柱的連接啟動液相色譜儀器的流程樣品溶劑溶解強度樣品溶劑溶解能力強于流動相導(dǎo)致色譜峰峰形問題：裂分峰或?qū)挿迳V柱:ZORBAXStableBondSB-C8,4.6x150mm,5mm流動相:82%H2O:18%ACN進(jìn)樣體積:30mLA. 樣品溶劑 100%乙腈010Time(min)12B. 樣品溶劑 流動相010Time(min)12樣品:1.Caffeine(咖啡因)2.Salicylamide(水楊酰胺)161中性分析時為何要使用緩沖液？色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x75mm,3.5μm流動相:44%A:56%甲醇流速:1.0mL/min 溫度:25°C 檢測:UV250nm含緩沖液的流動相可改善保留,分離和色譜峰峰形.樣品:1.pranolol7.ibuprofenA=pH7.0水A=pH7.0水+25mM磷酸緩沖液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)02.55.07.5Time(min)12345602.55.0Time(min)123456增加緩沖液濃度減少拖尾色譜柱: ZORBAXEclipseXDB-C8 4.6x150mm,5mm流動相: 40%磷酸鹽緩沖液 60%ACN流速: 1.5mL/min.溫度: 40°CUSPTf1.621.651.631.771.831.1210mM磷酸鹽pH7.0USPTf1.411.501.331.391.361.0025mM磷酸鹽pH7.0在中等pH下,離子強度較高,能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾樣品: TricyclicAntidepressants（三環(huán)抗抑郁劑）1.Desipramine（脫甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）3.Doxepin（多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）TEA對堿性成分峰形的影響02.55.0Time(min)12345色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8,4.6x150mm,5mm流動相:85%25mMNa2HPO4:15%ACN流速:1.0mL/min.溫度:35°CUSPTF5%1.1.29 2.1.333.1.634.2.355.1.57NoTEA10mMTEAUSPTF5%..265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH7樣品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黃堿）2.Ephedrine（麻黃素）3.Amphetamine（苯丙胺）4.MethAmphetamine（脫氧麻黃堿）5.Phenteramine（苯丁胺）競爭酸對酸性組分的峰形的影響色譜柱: ZORBAXStableBondSB-C18 4.6x150mm,5mm流動相: 40%A:60%ACN流速: 1.0mL/min.溫度: 室溫樣品: Ibuprofen（異丁苯丙酸）pKa4.4pH35mMNaH2PO4Tf=1.8pH35mMNaH2PO41%乙酸pH2.50.1%三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作為競爭酸填加至流動相中三氟乙酸由于所需濃度較低,可作為首選色譜柱技術(shù)–5988-6467EN流動相對色譜的影響(TE40)液相色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色譜柱尺寸:4.6x50mm3.5μm部件號:935967-906UV:254nm流速:1mL/min.室溫UracilButylparabenNaphthaleneDipropylphthalateAcenaphthene尿嘧啶尼帕爾金丁酯萘二丙基鄰苯二甲酸酯苊刻度混合:Dial-a-MixA:水B:甲醇,用泵抽取50%B體積比混合:Vol/Vol250mL水+250mL甲醇,用泵抽取100%混合液定容混合:Mix-to-Mark250mL甲醇,用水定容至500mL,用泵抽取100%混合液預(yù)混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200g甲醇+200g水,用泵抽取100%混合液改變流動相配比方式,可增加柱效（提高靈敏度）液相分析-小訣竅提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱內(nèi)徑，可增加柱效（提高靈敏度）縮短檢測器響應(yīng)時間，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱外體積，可增加柱效（提高靈敏度）使用超純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度）使用高能量氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）使用中孔透光氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）改變流動相pH，可增加柱效（提高靈敏度）改變有機相%，可增加柱效（提高靈敏度）改變鍵合相

，可增加柱效（提高靈敏度）改變有機添加劑

，可增加柱效（提高靈敏度）改變流動相配比方式

，可增加柱效（提高靈敏度）生化–多肽-5988-6316EN升溫對于反相HPLC分離強疏水肽的影響(B27)Polypeptide流動相:A:含0.05%三氟乙酸的水B:含0.05%三氟乙酸的乙腈2%B/min進(jìn)樣量:100μL(50μg的6M脲/5%乙酸)UV:210nm流速:1mL/min室溫液相色譜柱:ZORBAXStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x250mm5μm部件號:880975-902 室溫300C400C500C600C700C提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）環(huán)保樣品: 除草劑 流動相: 52/480.1M乙酸鈉/甲醇,pH6 流速: 0.45mL/min 溫度: 40℃,90℃ 檢測: UV 除草劑:柱溫的影響Herbicides:EffectofColumnTemperature1.西瑪津2.敵草隆3.撲滅津4.撲滅凈5.異丙甲草胺1.Simazine2.Diuron3.Propazine4.Prometryn5.Metolachlor液相色譜柱:ZorbaxStableBond-C18色譜柱尺寸:4.6x150mm,5μm部件號:883975-902目錄P62540℃90℃ 提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）生物制藥液相色譜柱:Zorbax300StableBond-C3色譜柱尺寸:4.6x150mm,5μm部件號:883995-909 肽類/蛋白質(zhì):升溫對分離的影響Peptides/Proteins:EffectofElevatedTemperature樣品: 多肽 流動相: A=5:95,乙腈:水,0.10%三氟乙酸(V/V%) B=95:5,乙腈:水,0.085%三氟乙酸(V/V%)梯度: 在20min內(nèi)15-53%,后運行時間12min 流速: l.0mL/min 溫度: 室溫-60℃ 檢測: