基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與調(diào)控2課件

第三章生物信息學(xué)的傳遞-從DNA到RNA(2)原核生物3.5真核生物的轉(zhuǎn)錄真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點(diǎn)：(1)原核只有一種RNA聚合酶，而真核細(xì)胞有三種聚合酶；

(2)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，真核有三種不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件；

(3)真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。

3.5.1真核的RNA聚合酶表12-2真核生物的三種RNA聚合酶的特點(diǎn) RNAPol 位置 產(chǎn)物 相對(duì)活性對(duì)α-鵝膏蕈的敏 PolⅠ 核仁 28s,18s,5.8srRNAs50～70%不敏感 PolⅡ 核質(zhì) hnRNA,mRNA,某些SnRNA20～40% 高度敏感 PolⅢ 核質(zhì) tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs～10%片段特異，中等敏感

表12-3轉(zhuǎn)錄的抑制劑 抑制劑 靶酶 抑制作用 利福霉素 細(xì)菌全酶 和β亞基結(jié)合，抑制起始 鏈霉溶菌素 細(xì)菌核心酶 和β亞基結(jié)合，抑制起始 放射線素D 真核PolⅠ 和DNA結(jié)合，阻止延伸

α-鵝膏蕈 真核PolⅡ 和RNAPolⅡ結(jié)合

B220～240Kda—與模板結(jié)合，與鏈的起始，延伸有關(guān)，相當(dāng)于原核RNAPol的β′亞基C端含有羧基末端功能區(qū) 大亞基B140～150Kda—與DNA、底物和新生的RNA結(jié)合，相當(dāng)于原核RNAPolβ

B44.5—酶的連接，相當(dāng)于原核RNA的α亞基 RNAPolⅡ ABC27KDa磷酸化蛋白，

1類—三種RNAPol共有，如ABC25.5KDa與DNA結(jié)合有關(guān)

ABC23KDa B12.6

小亞基2類—PolⅡ特有B23 B14.5 B10 3類—在某些條件下可除去的亞基 B23 參與酶的基本結(jié)構(gòu)

B16.5 細(xì)胞器的RNAPol—和噬菌體的RNA相似，因有單一固定的功能，分子量較小 表12-3真核生物聚合酶的成分及功能 3.5.2.1真核生物的啟動(dòng)子II

啟動(dòng)子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核的啟動(dòng)子有很多不同：（1）有多種元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）結(jié)構(gòu)不恒定；（3）它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同；（4）有的有遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件存在，如增強(qiáng)子；（5）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作（6）不直接和RNApol結(jié)合；

(7)需多種轉(zhuǎn)錄因子介入。真核啟動(dòng)子含有不同的組件SV40早期啟動(dòng)子胸苷激酶組蛋白H2B-140-120-100-80-60-40-20+1OctCAATGCTATA(一)Ⅱ類基因的啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)

TATA框核心元件

啟始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5構(gòu)成，

位于-3～+5，可能提供RNApolⅡ識(shí)別。

CAATbox、Ⅱ類啟動(dòng)子上游元件組成GCboxOct．增強(qiáng)子（enhomcer）遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)減弱子（dehancer）靜息子（sisencer）

上游激活序列（upstreamactivatingseguencesUASs）

核心元件

TATA框合又稱Hogness框，Goldberg-Hogness

框，俚語(yǔ)稱為金磚（Goldbrick）其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50常在-25左右，相當(dāng)于原核的-10序列。其作用是：

(1)選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始，故也稱為選擇子（selector）。

(2)影響轉(zhuǎn)錄的速率。.上游啟動(dòng)子元件（UPE）

表12-4哺乳動(dòng)物RNAPolⅡ上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元 元件 保守序列 結(jié)合DNA的長(zhǎng)度蛋白質(zhì)因子TATAbox TATAAAA ～10bp TBP CAATbox GGCCAATCT ～22bp CTF/NF1GCbox GGGCGG ～20bp SP1 Octamer ATTTGCAT ～20bp Oct-1Octamer ATTTGCAT 23bp Oct-2KB GGGACTTTCC ～10bp NFKB ATF GTGACGT ～20bp ATF B.Lewin:《GENES》Ⅵ.1997,Table28.2增強(qiáng)子它是在1981年由Benerji,Rusconi小組和Chambom等發(fā)現(xiàn)的，又稱遠(yuǎn)上游序列（farupstreamseguence）。其特點(diǎn)是：①具有遠(yuǎn)距離效應(yīng)。②無(wú)方向性。③順式調(diào)節(jié)。④無(wú)物種和基因的特異性。⑤具有組織的特異性。⑥有相位性。其作用和DNA的構(gòu)象有關(guān)。⑦有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)。增強(qiáng)子為什么具有遠(yuǎn)距離作用呢？（1）拓樸效應(yīng)；拓樸效應(yīng)說(shuō)認(rèn)為增強(qiáng)子的作用是誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使核小體產(chǎn)生DNaseI敏感區(qū)。（2）滑動(dòng)模型；（3）成環(huán)模型。Enhancer

Promotor

轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄復(fù)合體TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始

表12-5人類Ⅱ型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子 因子 分子量 功能 RNAPolⅡ≥10K 依賴模板合成RNA TFⅡA 12,19,35K穩(wěn)定TFⅡD和DNA的結(jié)合，激活TBP亞基 TFⅡB 33K 結(jié)合模板鏈（-10～+10），起始PolⅡ結(jié)合，和TFⅡE/F

相互作用 TFⅡD (TBP,30K)TBP亞基識(shí)別TATA，將聚合酶組入復(fù)合體中，TAFs識(shí)別特殊啟動(dòng)子 TFⅡE 34K(β)結(jié)合在PolⅡ的前部，使復(fù)合體的保護(hù)區(qū)延伸到下游

57K(α)TFⅡF 38,74K 大亞基具解旋酶活性（RAP74）,小亞基和PolⅡ結(jié)合，介導(dǎo)其加入復(fù)合體 TFⅡH 具激酶活性，可以磷酸化PolⅡC端的CTD，使PolⅡ逸出，延伸 TFⅡI 120K 識(shí)別Inr，起始TFⅡF/D結(jié)合 TFⅡJ 在TFⅡF后加入復(fù)合體，不改變DNA的結(jié)合方式 TFⅡS RNA合成延伸 NOTE1II類啟動(dòng)子為一個(gè)上游啟動(dòng)子2需要很多的轉(zhuǎn)錄因子（TFIIH)3RNAPOLIICTD4TPB(TATAbox)3.5.2.2RNApolⅠ啟動(dòng)子核心啟動(dòng)子（corepromoter）或核心元件（coreelement），位于-45到+20，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始。上游控制元件（upstream,controlelementUCE），從-180延伸到-107，可增加核心元件的轉(zhuǎn)錄起始的效率。3.5.2.3RNA聚合酶Ⅲ的啟動(dòng)子

PolIII基因的產(chǎn)物為一些分子量較小的細(xì)胞質(zhì)RNA（cytoplasmicRNAscRNA）包括:tRNA5SrRNA

7SLRNA(參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移)U6RNA(轉(zhuǎn)錄后加工)RNApolymeraseIIIusesbothdownstreamandupstreampromotersPolⅢ的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)小結(jié)真核生物的轉(zhuǎn)錄

(1)真核細(xì)胞有三種聚合酶；

(2)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，真核有三種不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件；

(3)真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。真核生物的轉(zhuǎn)錄細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄電鏡圖3.6轉(zhuǎn)錄后加工3.6.1原核生物mRNA加工3.6.2真核mRNA前體的加工(一)核內(nèi)不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA）平均分子長(zhǎng)度為8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均長(zhǎng)度（1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA僅有總量的1/2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，其余的都在核內(nèi)被降解掉。hnRNA是mRNA的前體，證據(jù)是：

(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；

(2)hnRNA在體外能作為模板翻譯蛋白；

(3)兩者5′端都有帽子結(jié)構(gòu)；

(4)表明二者為相同的聚合酶所合成；

(5)兩者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。hnRNA的結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)(1)5′端有帽結(jié)構(gòu)；(2)3′端有poly（A）尾巴；(3)帽結(jié)構(gòu)后有3個(gè)寡聚U區(qū)，每個(gè)長(zhǎng)約30nt(4)有重復(fù)序列，位于寡聚U區(qū)后面；(5)有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可能分布于編碼區(qū)（非重復(fù)序列）的兩側(cè)；(6)非重復(fù)序列中有內(nèi)含子區(qū)。1．加帽(1)剪接前加帽如呼腸病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如皰疹病毒和口炎病毒帽子的類型在末端鳥(niǎo)苷的第7位上存在單個(gè)甲基化位點(diǎn)的稱O型帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-0位點(diǎn)上還有一個(gè)甲基位點(diǎn)的稱1型帽子(cap1)；此外，在第三個(gè)核苷酸的核糖上（2′-0）有甲基化位點(diǎn)的稱2型帽子（cap2）。這三種帽子都有特殊面對(duì)面核苷酸結(jié)構(gòu)（confrontdenucleotidestructure）。帽子結(jié)構(gòu)的功能(1)有助于mRNA越過(guò)核膜，進(jìn)入胞質(zhì)；(2)保護(hù)5′不被酶降解；(3)翻譯時(shí)供IFⅢ（起始因子）和核糖體識(shí)別。(2)加尾(1)特殊組分(CPSF:剪切和多聚腺苷酸化特異因子)識(shí)別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性(2)剪切因子(CF)在加尾位點(diǎn)AAUAAA下游11－30nt處剪切RNA；(3)PAP末端腺苷轉(zhuǎn)移酶[poly(A)聚合酶]合成poly(A)尾巴；(4)PBP與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。加Poly(A)的反應(yīng)第一步加一個(gè)短的寡聚A序列（10nt），此反應(yīng)依賴于AAUAAA序列；反應(yīng)由poly（A）聚合酶在特殊因子指導(dǎo)下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的長(zhǎng)度。此反應(yīng)并不需要AAUAAA序列，但需要一個(gè)識(shí)別寡聚A并指導(dǎo)poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。ＲＮＡprocessingmovie3.7表觀遺傳變異相關(guān)的內(nèi)容：

X染色體失活

DNA甲基化（methylation)

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化基因組印記（genomicimprinting)RNA編輯（RNAediting）3.7.1基因組印記20世紀(jì)80年代，McGrath和Solter提出：對(duì)小鼠進(jìn)行核移植：

孤雄生殖：胎盤(pán)發(fā)育良好，胚胎發(fā)育不良孤雌生殖：胚胎發(fā)育良好，胎盤(pán)發(fā)育不良}無(wú)法存活至分娩人類的兩種腫瘤：完全性葡萄胎（無(wú)核卵子受孕）卵巢畸胎瘤（卵細(xì)胞自活化）哺乳動(dòng)物父本和母本的遺傳信息對(duì)于胚胎的基因組的影響是不一樣的，父本母本的遺傳信息互補(bǔ)是胚胎發(fā)育必須的3.7.1基因組印記（genomicimprinting）

a.基因組印記與印記基因：

基因組印記：指來(lái)自雙親的某些等位基因在子代中由于親源（父源或母源）的不同而呈現(xiàn)差異性表達(dá)。

印記基因：來(lái)自父本的等位基因不表達(dá)，而母源的等位基因表達(dá)，稱為父系印記。反之，來(lái)自母源的等位基因不表達(dá)，而父源的等位基因表達(dá)，稱之為母系印記。b.印記基因的特點(diǎn)：①依據(jù)親本來(lái)源，進(jìn)行單等位基因表達(dá)，使兩個(gè)親本基因具有不同的功能；②富含CpG島，易于被高度甲基化修飾，說(shuō)明甲基化修飾對(duì)于印記狀態(tài)的保持有重要作用；③大多呈簇排列，很少單獨(dú)存在，說(shuō)明印記基因之間存在一種共線形的作用關(guān)系，印記區(qū)緊密聯(lián)系，相互依賴④具有一個(gè)或幾個(gè)印記控制域，又稱差異甲基化區(qū)；⑤修飾狀態(tài)在子代細(xì)胞中保持以保證基因的表達(dá)模式。印記發(fā)生于配子的形成過(guò)程中，可以消除和重建在胚胎的有絲分裂能穩(wěn)定的遺傳給體細(xì)胞在世代交替中，印記消失，在配子發(fā)生時(shí)重建基因印記控制區(qū)（ICR）基因印記控制區(qū)：基因的印記，表達(dá)，沉默受基因控制區(qū)的調(diào)控。ICR一般有幾千個(gè)堿基，并且富含CpG。

{甲基化非組蛋白Non-codingRNAICR調(diào)控P(paternal):ICR甲基化控制H19和Igf2基因的表達(dá)M(maternal)：ICR和CTCF控制基因的表達(dá)表1一些顯性基因突變的表現(xiàn)度或外顯率與親代印記效應(yīng)疾病致病基因所在染色體親源效應(yīng)Huntington舞蹈病4父源傳遞發(fā)作年齡提前脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)6父源傳遞發(fā)作年齡提前強(qiáng)直性肌萎縮19先天性強(qiáng)直性肌萎縮全部由母親傳遞多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤I17母源傳遞癥狀加重多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤II22母源傳遞發(fā)病年齡提前Wilms氏腫瘤11散發(fā)性腫瘤中母源等位基因缺失成骨肉瘤13散發(fā)性腫瘤中母源等位基因缺失視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤13多見(jiàn)父源等位基因缺失3.7.2RNA干擾

1995年，Cornell大學(xué)的研究人員Guo和Kemphues研究阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)中的par-1基以線蟲(chóng)為對(duì)象探討用反義RNA去阻斷基因的表達(dá)，反義RNA的確能夠阻斷基因的表達(dá)，但是奇怪的是，作為對(duì)照的正義鏈RNA也同樣阻斷了基因的表達(dá)。此后另一些科學(xué)家以同時(shí)包含正義鏈和反義鏈的雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）去阻斷基因的表達(dá)，結(jié)果表現(xiàn)出比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默現(xiàn)象。這種由RNA導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象被稱為RNA干涉（RNAinterference,簡(jiǎn)稱RNAi）大量研究表明，RNA干涉廣泛存在于從真菌到植物、從無(wú)脊椎動(dòng)物到晡乳動(dòng)物的各種生物中，甚至也存在于低等的原核生物中。從遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生化學(xué)角度進(jìn)行的研究也指出轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）和RNA干涉可能在生命進(jìn)化的早期就存在。RNAi干擾的特點(diǎn)1)放大作用:在使靶基因失活的效應(yīng)中,雙鏈RNA比單鏈RNA的效果更為強(qiáng)烈;2)傳遞效應(yīng)：可以在體細(xì)胞世代之間傳遞,表現(xiàn)出表觀遺傳效應(yīng).

siRNA

如

何

導(dǎo)

致

mRNA

降

解RNAi動(dòng)畫(huà)3.8轉(zhuǎn)基因的常用手段1.顯微注射2.基因槍轟擊3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生

最常用的手段是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的方法在大多數(shù)的雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物中已經(jīng)成熟

不需要特殊的儀器設(shè)備，任何實(shí)驗(yàn)室都能操作農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌是土壤中的一種細(xì)菌，能夠?qū)е轮参锂a(chǎn)生冠癭病農(nóng)桿菌中含有Ti質(zhì)粒(Tumor-inducingplasmid)Ti質(zhì)粒含有T-DNA序列，T-DNA可以注射進(jìn)入植物的核DNATiPlasmidT-DNAregionAuxinLeftborderCytokininOpineOpinecatabolismRightbordervirgenesori12-24kbpPlantcellAgrobacteriumNucleus農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因T-DNATiplasmidPlantcellAgrobacteriumwoundT-DNATiplasmidNucleus農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因CCH3OOHOCH3CH3OAcetosyringone乙酰丁香酮CCH2OHOOHOCH3CH3OHydroxyacetosyringone羥基乙酰丁香酮

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因PlantcellAgrobacteriumNucleusSingle-strandedcopyofT-DNA(protectedbyssDNAbindingprotein)woundChromatinT-DNAporeT-DNA

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法獲得了轉(zhuǎn)基因植株

T-DNA標(biāo)簽突變體所用載體轉(zhuǎn)基因流程圖胚性愈傷抗性愈傷再生植株

PCR檢測(cè)陽(yáng)性率70％轉(zhuǎn)基因植株108株SoilNutrientavailabilityAcidityandalkalinityClimateTemperature(heat;cold)Water(drought;flooding)Mechanicalstimulation(wind)AppliedchemicalsHerbicidesHeavymetalsPollutantsOzoneLightToomuchToolittleImprovingPlantTolerancetoAbioticStress10%ofglobalcropproductionlostthroughweeds$10billionspentonherbicidesannuallyManyherbicideswillalsokillcrop-oftenhavetobeappliedearlyasaprecautionManyherbicidespersistinsoilorleavetoxicresiduesTillage(ploughing)canbeusedforweedcontrolbut:-soilscanbecomepronetoerosionafterextensivetillaging-seriouslossofwatercontentHerbicidesandtheProblemofWeedsBtToxinsToxinsproducedbyBacillusthuringiensisthatkillonlyinsectsDifferentstrainsofBacillusthuringiensisproducedifferenttoxins,eachactiveagainstonlyoneorafewinsectspeciesToxinsproducedinsporesandformproteincrystals

ToxinsencodedbyCrygenesBacterialsporesorisolatedtoxinsarealreadyusedasanorganicinsecticideToxinsbindgutcellsofinsectlarvaeandmakethemleakysolarvaestarvetodeathBtCropsCropshavebeentransformedwithdifferentCrygenesthatproducetoxinsactiveagainstthatcrop’sparticularpestInsecticideusedrasticallyreducedonBtcrops

Geneshaveconferredveryeffectiveresistance-morethan40differentCrygeneshavebeenusedtodate-yieldhasincreased-diversityofnativeinsectpopulationshasincreasedpromoterRegulatorysequencesrecognisedbyplant(eitherfromplantgeneorplantvirusgene).Frequentlyuse35SCaMVpromoterpolyA+BtTransgenesIntrodu