基因工程綜合性教學實驗

基因工程綜合性教學實驗大腸桿菌堿性磷酸單酯酶基因克隆表達純化吳海珍王善利趙健俞建瑛張惠展華東理工大學應用生物學系二○○五年一月第一部分寫堿性磷酸單回酯酶基因的蒜定位、克隆飯與表達艱實驗流鏡程圖慨堿性磷酸單辣脂酶基因在括染色體DN瘡A上的雜交透定位愿――代South拖ernB享lotti承ng渾償綠堿性磷酸單配脂酶基因的向體外擴增嘗――圣PCR擴增餃生拜PCR體外座擴增片段的議克隆連接于邊T-載體菜――竿連接已閃址連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)江化大腸桿菌浮受體菌狹――寨轉(zhuǎn)化愿串牛轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒釘DNA的抽震提期――掏快速法制備的質(zhì)粒好便姨轉(zhuǎn)化子的鑒幸定兆――殘限制性內(nèi)切增酶酶切然隸望目的轉(zhuǎn)化子品DNA的大窗量制備賀――賣堿法抽提質(zhì)繪粒DNA救確億酶切回收克陪隆的目的基露因片段土――尊回收目的基隨因表篩雖重組表達型用質(zhì)粒的構建暮――治連接、轉(zhuǎn)化艦、鑒定婆剖似重組大腸桿感菌目的蛋白足的表達雕――耐蛋白電泳鵝仿實驗路背線刷1DN洞A的酶切執(zhí)摘要飛本單元刮主要介紹限瞞制性核酸內(nèi)歪切酶的各種倦特性、酶的例保存方法和臟使用注意點紋，多種酶聯(lián)聰合酶切的常助用策略等。牛1.1實驗吧原理別DNA重組糾技術中的第胃一步是從不辦同來源的D組NA（染色挽體DNA或臨質(zhì)粒DNA課）上將待克懷隆的DNA陷片段特異性私切下，同時鄙在載體DN極A分子（一槐般為質(zhì)粒D白NA）上打洞開相對應的深缺口，然后抓將兩者連接券成重組DN疲A分子。這聚一特異性的客切割過程常償由特定的限件制性核酸內(nèi)牌切酶來完成都。姓限制性核酸膊內(nèi)切酶幾乎澆存在于任何屯一種原核細趙菌中，它能擠在特定位置秧上催化雙鏈鋸DNA分子蘿的斷裂，產(chǎn)集生相應的限拖制性片段。售早在20世既紀50年代專初微生物體霜內(nèi)的限制核漠修飾作用就族已發(fā)現(xiàn)，1障0年后細菌馳的限制和修水飾作用的分幟子機制被闡慧明。以大腸墊桿菌為例，替在K株和B蠻株中都含有索各自不同的宵限制遮――吧修飾系統(tǒng)，釀兩種不同來緒源的－噬菌躍體（場K狼和者B頂）長期寄生牢于各自的宿炸主細胞中，雖宿主細胞內(nèi)細的甲基化酶材已將其染色功體DNA和宗噬菌體DN括A特異性的賴保護，封閉炒了自身所產(chǎn)清生的限制性挨核酸內(nèi)切酶救的識別位點勤，故它們在法感染相應的姨宿主細胞（換K株和B株視）時DNA販不被降解，懼因此感染頻吼率很高。當腔它們分別感繪染其他宿主嗽細胞時，由遣于沒有特異強性的保護作槽用，入侵的寫DNA分子伶被宿主細胞州的限制性內(nèi)鞏切酶切割降牢解，從而感暈染頻率急劇推下降，普遍屠能低一或幾劣個數(shù)量極。咸這一現(xiàn)象普棋遍存在與原南核細菌中。夠但由于宿主梢細胞內(nèi)的降桶解作用的不栗完全，入侵肥的DNA分勉子總有極少恰數(shù)能完整保敬留下來并得羽以在細胞體木內(nèi)復制，而開且在復制過痰程中被宿主串細胞的甲基賺化酶所修飾蠅。這修飾過萬的DNA分氏子再重新制弱備后導入該賽宿主細胞時批，感染頻率探又能恢復到晶原來的高位民，即限制畢――榮修飾作用被雅解除。掌碌限制性核酸災內(nèi)切酶的分麻類坑目前在細菌究中發(fā)現(xiàn)有6吧00多種限奴制性核酸內(nèi)構切酶，根據(jù)添其性質(zhì)不同胳可分為三大獎類（見表1獎-1）。其村中II類限量制性核酸內(nèi)嚇切酶與其所址對應的甲基押化酶是分離牧的，不屬同蒼一酶分子，翠而且由于這脹類酶的識別淺切割位點比號較專一，因譯此廣泛用于析DNA的重飾組實驗。I輩類和III捐類酶嚴格地卻說應該稱為異限制睜――省修飾酶，因嚷為它們的限務制性核酸內(nèi)撿切活性及甲竹基化活性都榨作為亞基的斑功能單位，錢包含在同一骨酶分子中。吐表1-1各享類限制性內(nèi)討切酶的特性膜I類酶昨II類酶爬III類酶輪酶分子孕三亞基雙功貢能酶準內(nèi)切酶和甲睡基化酶分開喊二亞基雙功危能酶殿識別位點快二分非對稱畝序列甘4～6bp夸短序列，晉大多數(shù)為回戒文結(jié)構調(diào)5～7bp鹿非對稱序列棍切割位點考距離識別位部點至少億1000貍bp，無特珠異性醫(yī)在識別位點搏中蘿或靠近識別賄位點懶在識別位點巧下游24～娘26bp處攔限制性反應甚與甲基化反粱應熱互斥匪分開的反應黃同時競爭運限制作用所霧需的輔因子眨ATP、M水g電2+銅、源S-腺苷甲遞硫氨酸膠Mg趴2+思ATP、M礙g厲2+鄰、S-腺苷絡甲硫氨酸（屢非必需）鍋DNA重組盞中的用途璃無婆有喪無誠齊II類限投制性核酸內(nèi)懲切酶的基本抗特性舉II類限制要性核酸內(nèi)切傻酶是Smi茫th等人于龍1968年題在流感嗜血嘩桿菌d型菌碰株中發(fā)現(xiàn)的落。該類酶是個一種分子量堂較小的單體挑蛋白，其雙還DNA的識估別與切割活瑞性僅需要M咽g2+，且催識別與切割濤位點的序列再大都具有嚴烈格的特異性邪，因而在D步NA重組實雷驗中廣泛使抗用。尚目前已分離敗出400余貧種II類限炕制性核酸內(nèi)散切酶，鑒定方識別及切割鐮位點的有3傭00多種，攤商品化的酶搬NEB（N凝ewEn肺gland蜻Biol瓜abs）公嬌司品種最多言，達220警余種，其中濱在DNA重宇組實驗中常乞用的有20老多種。這些行酶的統(tǒng)一命作名由酶來源據(jù)的生物體名許稱縮寫構成發(fā)（見圖1-饑1）德圖1-1寧限制性內(nèi)切近酶的命名原述則與示例襲泊.1識別位直點攪II類限制聲性內(nèi)切酶的毫識別位點具累有180憲°風旋轉(zhuǎn)對稱的吩回文結(jié)構，象常用的識別武序列往往為爹6個堿基對篇，例如Hi滴ndIII蟻的識別序列氣：為其中一部分攜的識別序列雷某一或某兩宵位堿基并非漆嚴格專一，史但都在兩種添堿基中具有棵可替代性，筐這種不專一意性并不影響忌內(nèi)切酶和甲硬基化酶的作構用位點，只分是增加了D誤NA分子上防的酶識別與巨作用頻率，慮例如Ava令I的識別序栽列就是典型綁的結(jié)構：概 月有的酶識別罷位點為4或摩5堿基對，盆如AluI縮、HaeI鬼II和Sa湊u3AI（寬見圖1-2回）等，在D至NA上的出鞭現(xiàn)頻率則較網(wǎng)高，而象S遠au3AI張切割DNA知后產(chǎn)生的是久粘性末端，梯且與Bam蔥HI切割后蓮的粘性末端畢相同，為大酒規(guī)?？寺√釅艄┝丝赡?。楊實際應用中寸利用Sau清3AI高頻測現(xiàn)象，結(jié)合突DNA的部蒼分酶切策略子進行研究也挖是常用的實拴驗手段?？紙D1-2孕限制性內(nèi)切偶酶的命名原稈則與示例殲另外一些不役常見的酶識邊別位點相對旺較長，在D對NA鏈上出扁現(xiàn)頻率也相捐對較低，如至FseI（嘗5或’使-GGCC戴GGCC-想3按’啞），出現(xiàn)頻巾率為1/4捕8占=1/6揮5kb。實愚際上由于不假同生物體的猾DNA堿基稅含量不同，漲酶的識別位被點的分布和約頻率也不同勒。大腸桿菌少基因組中A痰T含量較豐要富，所以富慢含AT的識岔別序列（如贊DraI：個5心’午-TTTA撤AA-3轉(zhuǎn)’竊；PshB策I：5嚼’-ATT豪ATT哲-3諸’蓄；SspI插：5廈’粉-AATT胸AA-3見’束）較為頻繁栗的出現(xiàn)，而什鏈霉菌基因便組因GC含國量高，相應識的富含GC陸堿基對的識書別序列（N雀aeI：5害’典-GCCG起GC-3右’兇；SmaI大：5村’禍-CCCG遞GG-3乎’匯；SacI斤I：5黑’襪-CCGC鑰GG-3稈’帥）較常見。揪瘋.2粘性末壟端丘限制性內(nèi)切吐酶切割DN要A產(chǎn)生的末宿端根據(jù)被切贏開的DNA曉末端性質(zhì)的塑不同（不考覆慮堿基序列同）可分兩大氧類：平端和絞粘端，而后察者又可分為敬3殃’圖-OH突出圾或5撫’慚-P突出兩摸種，分布情買況見圖1-匯3，故DN桂A分子的連踢接通常發(fā)生頓在同種限制尖性內(nèi)切酶酶揉切后的DN燒A間。核圖1-3祖DNA酶切突產(chǎn)生的三種驢末端氏實際上DN暖A重組應用首中，由于不如同限內(nèi)酶酶胸切能產(chǎn)生相堂同粘性末端旨，因此DN哲A分子的連燭接可發(fā)生在齊不同限內(nèi)酶革之間，常見鮮的DNA分假子連接情況鈔見圖1-4兆。而在重組錯工作中如沒冷有合適的酶怎切口產(chǎn)生相蛾同的粘性末樓端，則可對晴酶切后的突姑出粘性末端預進行補平，尚采用平頭連僑接策略。稀圖1-4匠DNA粘性昏末端的連接棕效果宵輩.3甲基化秋影響項大多數(shù)大腸蜜桿菌菌株中哭含有籃Dam害甲基化酶和簡Dcm騾甲基化酶，悅前者可以在麥GATC序砌列中腺嘌呤宏N-6位上方引入甲基，憶后者在CC強A/TGC擴序列的第一頑個胞嘧啶C跡-5位置上旗引入甲基。蟲部分限制性定內(nèi)切酶對甲范基化的DN獨A不能切割飛，如Fba句I和Mbo翅I等，一般造生物公司提拜供的內(nèi)切酶球說明中均有用說明。而要壘解除這種限衣制修飾作用勝通常有兩種仗方法：（1惠）選用上述球酶的同功酶添，如Sau啞3AI，D乞NA識別切往割位點與M帽boI相同饞；但不受甲色基化影響；踢（2）利用褲甲基化酶缺刮失的受體細族胞進行DN持A的制備，膛如及E.col禽i希JM11加0和鏈霉菌脫等，前者民Dam碎和式Dcm教甲基化酶已占敲出，而后鞠者細胞內(nèi)本氣就沒有甲基基化酶，從這喜些細胞中抽灣提的DNA伙就能被上述忍酶切割。投開.4近末端申切割習基因工程的群操作中經(jīng)常花要對和DNA輝片段進行精慨細切割，在毯PCR產(chǎn)物才中有些甚至穩(wěn)只切割一個京堿基對。不吼同的內(nèi)切酶可對裸露的酶北切位點不能種切斷，因此積必需在酶切槽位點外側(cè)加喚上一個或幾庸個保護堿基春，表1-2肯中列舉了常符用的十五種攻內(nèi)切酶在不內(nèi)同保護堿基餡下的切割效渣果，一般保倘護堿基大于嫌三個堿基對拜時能完全切挺割。但是在燙有些PCR瀉產(chǎn)物中即使裙保護堿基大墊于五時也不猾一定能被有角效切斷，這因可能是PC痛R產(chǎn)物純化畏中殘留的雜苗質(zhì)影響酶切脫或是PCR蛇產(chǎn)物末端聚膏合不完整。活表1-2傲DNA末端騎酶切位點的疼切斷情況蛾Enzym帖e役末端堿基數(shù)撕0貸1館2蠟3憑BamHI竄-鵝+選+資+腹BglII碑-柱-丙±繪+叼ClaI斥-燃±永+的+賊EcoRI松-倒±智+樣+列EcoRV臥-錘+庭+袍+叔HindI懲II逃-蘋-拼-灰+恰KpnI斷-脖-養(yǎng)+高+循NcoI葬-細-蹄+租+腫PstI看-小-得±堡+搭SacI勞-霜±猶+貌+幸SalI掘+吐+惠+少+囑SmaI宋-猾±御+宣+呼SphI芝-艙-弦+祖+齒XbaI釘-格±粒+棉+結(jié)XhoI池-滑-嘴±惕+到-：不能切賄斷；拆±檢不能完全切鈔斷；攻+嚴：完全切斷易1.1.攻3限制性核寸酸內(nèi)切酶的霜使用厚限制性核酸裝內(nèi)切酶在基功因工程屬常堵用工具酶，挎主要用于基館因物理圖譜弓的繪制、基礎因片段的鑒側(cè)定或獲得、滲用于雜交的蔥DNA探針洽的制備等，跪而酶切的條睡件控制則是致非常重要的牢。收1.1.臣3.1作用待條件場在DNA的康酶切反應中憑酶切條件是她酶切成功的倡關鍵，主要配影響因素有業(yè)：師反應溫度順常規(guī)酶切店反應均屑在37提℃軌進行，但有銷些酶的最佳搬反應溫度并強不是此溫度劣，如段SmaI，翁最適反應溫鋤度為30聯(lián)℃順，故最好根瘡據(jù)所選用的聲酶確定反應朋溫度。當采腰用聯(lián)合酶切殲進行實驗時季尤其要注意非選擇的反應順溫度是否都異滿足兩者的誤要求，如果繭有一個酶的惑最適溫度不嗽符，建議分沿步酶切（見滾1面.1.3.密3喊）。染緩沖體系界廠商提供數(shù)的私限制性核酸稿內(nèi)切酶有其形相對應的緩三沖液，一般喝的緩沖液種暗類堆為4兼-臺10險種左右，按戶鹽離子濃度者可分為三大估類：高鹽、企中鹽和低鹽坦。緩沖液配蝴制為10路×捷的母液，酶店切時稀羽釋10倍。江常規(guī)酶切中蝴均選用最佳頸緩沖液進行丟酶切反應，膛但聯(lián)合酶切臟時，根據(jù)廠疤商提供的聯(lián)芳合酶切的緩海沖液選擇表智（寶生物工錢程公司）選著擇緩沖液或碧采用萬能緩蹲沖液（Pr激omega注）。揭反應時間蓬常規(guī)酶切鴿反應時間為完1輔.5跌小時，但可趣根據(jù)酶切對膝象和酶的用羨量將保溫時羞間延長2～扁3小時，有小時甚至可以萍過夜。一般火來說，在D皺NA量固定速的前提下，章長時間酶切等所需的酶量代可適當減少并，所以在大候劑量酶切D銀NA時，可凍以考慮酶切素過夜。另對飄特殊實驗，隙如對基因組印DNA進行菜部分酶切，慶則在酶量投感入一定的前訓提下，減少挨反應時間降老低對DNA掘切割的程度誓。細加入酶量凳在底物（房DNA）一窗定的條件下宴，酶量投入曲越多則酶切診效果越好。漁但實驗中常擾常出現(xiàn)酶量內(nèi)加入過多酶厘切效果反差瓦的現(xiàn)象，這臺主要是酶的瓣儲存液中含藍有50％的濱甘油，但酶微量加入過多延，超過酶反拴應體系的1鑒0％時，過云多的甘油抑彼制了限制性生內(nèi)切酶活性緊。因此，在矛酶切反應時梅，酶量的加含入原則：不棟超過反應總敗體積的10當％，在能切飾開的條件下予加入越少越粒好（可減少渡酶的Sta宇r活性）。罷DNA純度銷在滿足捎上述條件下低影響酶切效餓果的主要因指素是DNA傲的純度，D萄NA樣品中施蛋白含量過能高、有機溶撤劑（苯酚或當氯仿）的殘決留、高濃度迎的RNA等日。另外DN執(zhí)A濃度過高延也會導致酶倘切失敗，一裹般DNA的昌質(zhì)量濃度在緊1躍g/偶l訪體系中能取嘉得好的酶切蹤效果。當發(fā)灣生不明原因協(xié)的酶切失敗每時，常用的僚解決方法是嗽采用稀釋酶校切，即將酶剪切體系放大分（如從15姓l-->縱30屈l柴），將雜質(zhì)妥相對濃度稀拾釋，這樣不碼需多增加酶慣量就能取得輪較好的酶切轉(zhuǎn)效果禽1.1.拿3證.2宗酶切方式口酶切方式可剃分為部分酶躲切與完全和酶切：屋部分酶切繭指的是同炸一肝DNA片段猾上的位點有戴些被切開而豪另一些未被闊切開，此法恒主鑼要用于基因分的克隆。在患某些基因內(nèi)出部可能有此偏酶的切點，妥用完全酶切盾進行克隆時李難以得到完雄整基因。部晶分酶切實施附方書法：閉a汁）在摔不同的時間臭從同一個酶燒反應管中取勢樣終止反應魚，利用時間武控制酶切程珠度，該方法沫比較繁瑣，噸不易掌握得癥恰到好處監(jiān)；b）固定礙酶切的反應朱溫度和反應言時間，局控制酶的投珍入量，一般燒是在反應管貿(mào)中加入不等蹈量稀釋的酶先，利用不同唐酶濃度控制脆酶切程度，否該方法因易切控制而被廣柿泛應用。薯完全酶切濃適用于除笨目的基因克笑隆以外的絕受大多數(shù)DN夸A操作，例筍如壩載體的切割拘，酶切圖譜艘的制作，基熱因的鑒定與辮DNA片段梳的分離等。扒1.1.料3填.形3雙酶切的鍬解決方法蠶在DNA重奔組實驗中，苗經(jīng)常會用雙叢酶切（甚至脫是3個酶切核鑒定）鑒定酒重組子或獲溝得不同粘性墻末端的DN猴A片段，而均在廠商提供現(xiàn)的圖聯(lián)合酶切緩逢沖液表中并酒不包括所有貪類型的酶，虎即使提供了脾“或萬柏能緩沖液賤”不，有些酶的閣聯(lián)合酶切也奸不一定能取僚得比較好的貼效果，這里早介紹兩種通愁用的解決方裁法：惡分步酶切法要對將進交行的兩種酶碗的酶切采用濕分步的方法蛋，即先選擇壘一個酶，采村用此酶的最炭佳反應條件乒進行酶切，艇酶切完全的戀DNA進行騰沉淀后再溶綁解，然后選枕用第二個酶籌進行最佳反蘋應。在酶切身時，一般選結(jié)擇便宜的酶噴進行酶切沉伍淀，而后在獵進行第二個識酶的酶切反政應。此方法迫通用性較強勸，聯(lián)合酶切扶也比較完全淺，但較耗時蠶，而且DN敢A在沉淀時歡后有部分損劉失，要求開協(xié)始時DNA盒的投入量要塞比較高。普同步酶切法合取兩種暫酶的最佳緩秋沖液各50柔％加入到酶稱切反應體系貪中，并同時窗加入兩種酶告進行反應。喬特別是對不芹同廠商提供叫的酶進行聯(lián)愛合酶切時，嶼即可節(jié)約時瓶間也可取得戒比較好的酶癢切效果。港1.1.奮3芬.柱4酶切反應三設計因在進行酶切游反應時，首你先要確定需勉切割的DN芬A量，根據(jù)茶DNA的疏量確定總反莖應體系和酶狂量（最多占從1/10）明，一般體系貸如下：溪total兩(杏l)您 碰ddH寸2翅O(超l)率 算10穿×毒Buffe紫r(脊l)炒 出Enzym蛙e(匙l)發(fā) 聚DNA(5根0ng/承l(wèi))英20廳 晨14.5所 慘2昆 汁0.5溝 崇3哭一般較好的宮酶切體系D剖NA的投入塊量不高于1禁.5歸g/50較l，當DN態(tài)A的投入量追為1.5愿g/20瞇l時酶切將盡發(fā)生困難。譜加樣順序：對水-->緩悔沖液-->訴DNA--笨>酶。各組釘分加完后要買混合均勻，世并用離心機泳低轉(zhuǎn)速將溶葛液離心至管托底。轉(zhuǎn)1.1.及3途.照4酶切失敗閣的原因及處摧理辦法爽酶切失敗主餡要表現(xiàn)為兩月方面：喉不完全酶切窗甚至是DN張A基本未發(fā)偉生酶切；主勺要原因有：鴨a）緩沖體牧系不合適，巾可進行重新野酶切；b）證酶量加入過矛多而導致甘勸油抑制酶活起，可將反應沒體系適當稀杯釋；c）D泰NA樣品雜談質(zhì)含量高，獎可采用稀釋替酶切或?qū)責NA樣品重樹新抽提后酶犧切特DNA被降聰解（不成帶晨狀）；主要頌原因是DN披A樣品中含襖有痕量的D促NA酶，建爭議重新抽提莫除去DNA勒酶。助1.2試劑貧與器材羨1.試劑旋 罷（1）常用呆的限制性內(nèi)橋切酶精 類（2）酶切饒緩沖液，購舞酶時附貼 雖（3）無菌丙雙蒸水雷 集（4）DN值A樣品始2.器材腿 構（1）ep泥pendo估rf管鋒 蒜（2）槍頭翅 庸（3）恒溫插水浴醫(yī) 擴（4）移液也器 株1.3實驗距步驟湊2草DNA倦的凝膠電泳碑摘要青本單元確主要介紹D桿NA電泳的產(chǎn)基本原理及楚各種影響因綢素，學習制維膠，電泳等扣基本分析技勻術。包2.1實倚驗原理言DNA電泳喝是基因工程稅中最基本的吸技術，DN雹A制備及濃啞度測定、目散的DNA片肺段的分離，影重組子的酶做切鑒定等均乘需要電泳完災成。根據(jù)分和離的DNA柿大小及類型脫的不同，D鑼NA電泳主基要分兩類：衰（1）聚丙網(wǎng)烯酰胺凝膠蜜電泳適憲合分離1唐kb宴以下的片段乒，最高分辨誦率可達1復bp它，也用于分梯離寡核苷酸素，在引物的密純化中也常尤用此中凝膠巷進行純化，些也稱PAG儲E純化。男（2）瓊脂楊糖凝膠電泳拍可分離滑的DNA片裙段大小因膠青濃度的不同認而異，膠濃故度為混0.5暗～0.賢6%牙的凝膠可以青分離的DN竭A片段范圍可為20會bp餃～50段kb獄。電泳結(jié)果艱用溴化乙錠物（EB）染梨色后可直接痰在紫外下觀沈察，并且可奔觀察的DN扇A條帶濃度欺為納克級，麻而且整個過久程一般1小完時即可完成構。由于該方葛法操作的簡府便和快速，奪在基因工程滔中較常用。保2沫.1.1難瓊脂糖凝膠怕瓊脂糖是從踏瓊脂中分離期得到，由1臉，3連接的榮吡喃型尸-D-門半乳糖和1木，4連接的萄3，6脫水殘吡喃型阿悅-L-毅半乳糖組成脈，形成相對舒分子量為1要0預4架～10祖5厘的長鏈。瓊承脂糖加熱溶販解后分子呈循隨機線團狀膛分布，當溫耗度降低時鏈擦間糖分子上限的羥基通過今氫鍵作用相樸連接，形成桿孔徑結(jié)構，確而隨著瓊脂渴糖濃度不同晌形成不同大堡小的孔徑?；⒈?溪-1膨給出了不同初濃度凝膠對垮DNA片段允的線性分離罵范圍。然表2扇-1撇不同類型瓊條脂糖分離D濟NA片段大球小的范圍緣瓊脂糖/％跨標準喇高強度緩低熔點吉低粘度低熔為點姿0.3巴0.5鵝700bp度～25kb瑞0.8察500bp柴～15kb預800bp看～10kb醋800bp炮～10kb造1.0崗250bp駐～12kb賴400bp何～8kb壯400bp惡～8kb牽1.2畜150bp獄～6kb鐘300bp園～7kb搏3劃00bp~刮7kb傘1.5羊80bp~岡4kb重200bp由~4kb搭200bp贈~4kb該2.0甘100bp慨~3kb秘100bp讓~3kb梢3.0紐500bp謊~1kb末500bp甩~1kb亂4.0鄭100bp換~500b錢p偏6.0霜10bp～選100bp牧由于瓊脂糖譜凝膠是通過騙氫鍵的作用裕，因此過酸旦或過堿等破亮壞氫鍵形成倒的方法常用辭于凝膠的再餅溶化，象N刃aC布l長O攜4冶能用于凝膠誼的裂解，一析般的凝膠回泊收試劑盒利喊用的也是這江一原理。善隨著實驗技米術的發(fā)展，尚也針對不同挪用途開發(fā)了條各種類型的錘瓊脂糖凝膠且：（1）低貫熔點瓊脂糖堪凝膠，用于可DNA片段倡的回收，且捕由于該種凝突膠中無抑制蘋酶，可在膠掏中進行酶切滋、連接等；林（2）高熔項點凝膠，可傳分離小于1謝kb滴的DNA片耀段，專用于漏PCR產(chǎn)物藏的分析；（溉3）快速凝并膠，電泳速辮度比普通凝膠膠中快一倍市，可節(jié)省實扎驗時間；（卵4）瑞？？？腰，適用于D衰NA大片段守的分離。（躲5）其它類掠型。各生產(chǎn)沾商還開發(fā)很川多類型的凝確膠，可根據(jù)每實驗要求選融擇不同類型屯的，選擇原孕則是考慮合馳適的機械強句度和熔點。助2趨.1.2翻DNA電泳罪影響因素貍DNA為堿服性物質(zhì)，在墻電泳（緩沖寫液pH眉=袍8）時帶負體電荷，在一歡定的電場力桿作用下向正拍極泳動。而他DNA鏈上蒜的負電荷伴買隨著DNA緩分子量的增厲加而增加，捕荷質(zhì)比是一貍常數(shù)，故電性泳中DNA日的分離類似岡分子篩效應爭。電泳中影投響DNA分但子泳動的因并素很多，主醉要分兩方面拋：DNA分斷子特性和電斗泳條件。綱DNA分子典大小D征NA分子越牽大在膠中的甩摩擦阻力就應越大，泳動孫也越慢，遷脅移速率與線騙狀DNA分孔子質(zhì)量的對全數(shù)值成反比謊。督DNA分子條構型對疏于質(zhì)粒DN課A分子即使滅具有相同分晶子質(zhì)量，因什構型不同也渾會造成電泳劇時受到的阻廚力不同，最薯終造成泳動糕速率的不同律。常規(guī)電泳佩中質(zhì)粒DN睜A分子的3吹種構型泳動襪速率：超螺鬧旋最快、線猛狀分子次之糧，開環(huán)分子刻最慢。豐不同的膠濃咬度對于偉同種DNA肆分子膠濃度劉越高，電泳狂速率越慢。異不同膠濃度攪對于DNA亞片段呈線性亡關系有所區(qū)巡別，濃度較搞稀的膠線性簡范圍較寬，役而濃的膠對首小分子DN忍A片段呈現(xiàn)曾較好的線性夕關系。所以痕常規(guī)實驗中思對于小片段商DNA分子密的分離采用輝高濃度的膠使分離（有時吳甚至用2％絞的凝膠），器而對于分離碗大片段則用詳?shù)蜐舛鹊哪耗z。度電場強度孝電泳時為晨了盡快得到爛實驗結(jié)果，的所用的電場艱強度約為5盟V/cm，嫂這樣的場強椒下雖能得到富結(jié)果，但分諸辨率不高。曾在精確測定鄉(xiāng)DNA分子埋大小時，應煩降低電壓至播1V/cm演。電場強度癢偏高時電泳紗分離的線性攻范圍會變窄兔，電壓過高念時也會由于常電泳中產(chǎn)生展的大量熱量益導致DNA威片段的降解蒜。實驗中要扒根據(jù)需要選燥擇合適電壓棒，如對于D短NA大片段妥的分離可適癢當選擇較低懸電壓進行（家在Sout方her選n縣雜交中的D懼NA電泳）桂，避免托尾苗現(xiàn)象的產(chǎn)生千；而對于小蘭分子DNA孤，由于其在槐凝膠中的快星速擴散會導程致條帶模糊持，可選用相叼對較高的電灑泳以縮短電踐泳時間。延溴化乙錠報簡稱EB咐，電泳中的偉染色劑，具隱有扁平結(jié)構杠，能嵌入到打DNA堿基幼對間，對線盼狀分子與開寸環(huán)分子影響誼較小而對超燥螺旋態(tài)的分腦子影響較大泄。當DNA蜻分子中嵌入帝的EB分子叢逐漸增多時掌，原來為負里超螺旋狀態(tài)碑的分子開始炭向共價閉合毅環(huán)狀轉(zhuǎn)變，糾電泳遷移速央度由快變慢姑；當嵌入的設EB分子進師一步增加時籍，DNA分潛子由共價閉啊合環(huán)狀向正滾超螺旋狀態(tài)掏轉(zhuǎn)變，這時禾電泳遷移速爐率又由慢變冠快。這個臨阻界點的游離衛(wèi)EB質(zhì)量濃條度為0.1孕借g/ml~袋0.5得論g/ml，童即電泳時所非加的濃度。惡因此一般電女泳可以忽略室此因素，而子對于特殊電技泳，消除此抄因素影響可居采用電泳后團染色。擱電泳緩沖液夾目前有斧3種緩沖液復適用于天然次雙鏈DNA者的電泳：T版AE、TB魂E和TPE辰，其組成及聲特點見表嶄2.2徹。一般常用丟的DNA電魯泳選用TA刻E較多，其刃電泳時間較吳快，而且成造本比較低，姿但是其緩沖威容量較低，參需經(jīng)常更換篩電泳液。滿表2.2常弓用DNA電犯泳緩沖液證緩沖液受存儲液組成候成份/L突特點及用途趴TAE捎50飲×辟雙鏈DNA陜分子的泳動嚷速率比另兩誼者快10吸%殊242gT忍ris亡超螺旋在其謙中電泳時更籃符合實際分中子質(zhì)量安57.1m怖l冰乙酸崖回收DNA罵片段時首選顏，大片段分隨離效果好統(tǒng)100ml維0.5m材ol/L產(chǎn)EDTA退(pH8.防0)竊緩沖容量小甚，過夜電泳茶不可選用收TBE歇5雁×凳小片段（<扭1kb）分原離效果好貸54gTr統(tǒng)is桶回收效率差縮而不宜用于囑回收電泳沾27.5硼抬酸墳緩沖容量大豎，過夜電泳硬適合蒼20ml局0.5mo驅(qū)l/LE股DTA(餡pH8.0胳)坡TPE廁1屑0邪×肢磷酸鹽在乙喪醇作用下析甩出，也不適僚合回收電泳襖108g寫Tris記緩沖容量大帖，過夜電泳贊適合古15.5m倍l磷酸念(85%，件1.679鑄g/ml)斧40ml棵0.5mo天l/LE跑DTA(萍pH8.0編)撇2膏.1.3緣DNA電泳西上樣緩沖液誼電泳中DN銹A點樣前必騰須加入一定鴿量的上樣緩免沖液，主要紹作用如下：爐螯合Mg滋2＋鎖，防止電泳小過程中DN塞A被降解，庫一般上樣緩咬沖液中含1角0mmol森/l的ED玻TA。兔增加樣品密卸度以保證D叫NA沉入加備樣孔內(nèi)，一思般上樣緩沖臭液中加入一掙定濃度的甘英油或蔗糖，仆這樣可以增井加樣品的比褲重。而在大賴片段電泳中贊采用Fic毒oll（聚鵲蔗糖），可扯減少DNA罩條帶的彎曲困和托尾現(xiàn)象牢。厭指示劑監(jiān)測虹電泳的行進貢過程，一般梳加入泳動速氏率較快的溴辱酚藍指示電怪泳的前沿，盞它的速率約房與300b奧p的線狀雙覺鏈DNA相錦同。遞目前廠商提板供的限制性漢內(nèi)切酶中都脂有贈送的上惠樣緩沖液，月一般為10蓬×補上樣緩沖液躁，DNA樣文品中僅需加悠入1/10慰的量即可，矮加入過多的賄上樣緩沖液犧會造成電泳伶輕微的托尾顏現(xiàn)象。宗2亮.1.4傍DNA電泳舅上樣量的控大制塑在分析性電推泳中，一般壇樣品投入量尸達50～1鈴00ng/棍帶即可觀察酸到清晰結(jié)果漲，而對于珍文貴DNA樣而品則上樣量淡達電泳的最忍低分辨率5費～10ng透/帶也可。悅而對于一定其量的DNA萄，當電泳時凈采用較薄的財梳子制膠，綱則電泳時D漂NA條帶相膠對較窄，觀插察較清晰；描而隨著電泳索時間的延長變，由于DN珍A分子本身制有一定的擴隸散，電泳條頓帶也會變淺己。對于染色渡體DNA的可酶切片段包龍含各種大小微的條帶，上販樣量即使超煩過10冷g條帶也不肥會托尾，而谷單一條帶（遺>10k紐b）當上樣道量超過20盼0ng就有樓可能產(chǎn)生托霉尾現(xiàn)象。沿2漿.1.5皇DNA電泳止的標準分子姻量琴目前各廠商閣開發(fā)了各種島類型的標準野分子量，有押廣泛用于P速CR產(chǎn)物鑒糠定的小分子尸Marke缸r，也有常僑規(guī)用的大分婦子Mark輛er，圖2闖-1為TA制KARA公夫司提供的D甲NA標準分茶子量電泳（面示意）圖。款圖2-1穿常用的DN鑼A標準分子付量電泳圖酒2.2試按劑與器材采1.試劑痕 四（1）50臨×捉TAE電泳棚緩沖液綠242.0慣gTr言is堿煉100ml活0.5m麥ol/ED賴TA（pH間=8.0）織57.1m統(tǒng)l冰醋寨酸博 參（2）EB辛母液（1m摸g/ml）臭稱取一定量邀的EB溶于騰無菌水中，限室溫避光保傾存潑凝膠中濃度岔為0.5屯g/ml大EB為強誘爽變劑，實驗感中要防止污宿染甜 掌（3）DN麗A標準分子始量（自制）保片段大小依南次為：0.阻5，1.1芽，1.6，住2.7，3找.1，4.覆1，5.4牽，9.4和秘17送單次電泳電臘樣量3～4顫l即可，回粗收電泳加倍壺 蟲（4）10全×鍵Loadi女ngbu咳ffer（萌pH7.0甚）巾EDTA些 遼50記mM襯甘油久 畫60%腫Xylen集eCya編nolF團F（牢W/V穴）歡 似0.25%錘Bromo思pheno玻lBlu托e（狗W/V食）赤 懷0.25%簡 掙（5）無菌水雙蒸水抄 爭（6）瓊脂阿糖奪2.器材烤 古（1）ep祖pendo瞧rf管旺 很（2）槍頭蜻 巡（3）移液唐器沉 舅（4）電泳貢槽堂 衰（5）電泳初儀腦 能（6）微波預爐喝 那（7）電泳阿板和梳子專 期（8）紫外貨投射分析儀繪 青（9）數(shù)碼克相機（帶紫臟外濾色鏡和至近射鏡）晚2.3實驗故步驟茄(1)噸用1并×因TAE更–B色uffer株按照被分離久DNA分子燒的大小配制切一定濃度紐(0.7%甜)保的瓊脂糖凝護膠絨50ml攻，在微波爐橫中加熱至瓊時脂糖溶解。羞(2)拉待溶液冷卻擴至50盟℃瓣左右，加入徐溴化乙錠（啟貯存液爺:州用水配制為豐1mg/m鑒l）至終濃屑為0.5扶g/ml充堤分混勻。雁(3)眠用透明膠封悲固玻璃板兩暫頭，在距底襖板0.5龜~揀1.0mm箱的位置上放亦置梳子，將品溫熱的瓊脂卡糖凝膠倒入且膠模中，凝杰膠厚度在3閱~脈5mm之間戰(zhàn)。封(4)悠在凝膠完全盟凝固后，撕魄去透明膠，脅小心地將玻巨璃板移至裝膀有1委×日TAE緩沖里液的電泳槽紫中，輕輕地燃拔去梳子，避且使緩沖液拼沒過膠面約鐮1mm。征(5)店DNA樣品星與鴨10旺×困L唇oadin填g-buf傘fer漢(含有溴酚毯藍和甘油等唇物質(zhì))混合袍后，用微量孕取樣器慢慢購將混合物加拘至樣品槽中縫。星(6)把蓋上電泳槽填并通電，使碼DNA向陽畢極（紅線）妹移動，采用土電壓為80灣～100V夢。置(7)縣溴酚藍在凝陳膠中移出適除當距離后切控斷電流，取月出玻璃板，沿在紫外燈下條觀查凝膠。媽（注：對于樸DNA片段等回收的電泳雨一般建議采闖用0.6%階低濃度的凝膏膠，而且采難用的電泳液承需第一次使抖用，電泳槽帖要洗凈）捧3DN壤A的制備腰摘要貿(mào)本單元辨主要介紹質(zhì)超粒DNA和及細菌染色體笛DNA的常氣規(guī)制備方法極，要求學會凡根據(jù)不同實高驗需求選擇南不同實驗方插法。抹3.1實驗許原理咬戶質(zhì)粒DNA鬧的基本特性按質(zhì)粒（Pl篩asmid府）是一種染賓色體外的穩(wěn)蒙定遺傳因子替，大小從1挎-200k算b不等，為塑雙鏈、閉環(huán)券的DNA分削子，并以超純螺旋狀態(tài)存扇在于宿主細戲胞中。質(zhì)粒洞主要發(fā)現(xiàn)于紀細菌、放線鞭菌和真菌細慕胞中，具有就自主復制和其轉(zhuǎn)錄能力，沙能在子代細棋胞中保持恒錫定的拷貝數(shù)粒，并表達所惠攜帶的遺傳誓信息。質(zhì)粒呈的復制和轉(zhuǎn)轎錄要依賴于碌宿主細胞編前碼的某些酶近和蛋白質(zhì)，擔如離開宿主難細胞則不能治存活，而宿震主即使沒有追它們也可以最正常存活。芳質(zhì)粒的存在澇使宿主具有抄一些額外的披特性，如對叼抗生素的抗奧性等。F質(zhì)脊粒（又稱F繩因子或性質(zhì)虛粒）、R質(zhì)慰粒（抗藥性財因子）和C勵ol質(zhì)粒(映產(chǎn)大腸桿菌大素因子)等汽都是常見的遲天然質(zhì)粒。隔質(zhì)粒在細胞伍內(nèi)的復制一而般有兩種類項型：緊密控數(shù)制型（St檢ringe謠ntco鋤ntrol承）和松馳控圾制型(Re迫laxed趙cont芒rol)。蓬前者只在細拳胞周期的一巷定階段進行飾復制，當染鐵色體不復制安時，它也不愈能復制，通曬常每個細胞餃內(nèi)只含有1醬個或幾個質(zhì)強粒分子，如施F因子。后競者的質(zhì)粒在林整個細胞周扒期中隨時可奔以復制，在擴每個細胞中鳳有許多拷貝貴，一般在2丟0個以上，譜如ColE臟1質(zhì)粒。在槐使用蛋白質(zhì)絮合成抑制劑垂-氯霉素時婆，細胞內(nèi)蛋慣白質(zhì)合成、慰染色體DN翅A復制和細醫(yī)胞分裂均受竟到抑制，緊朋密型質(zhì)粒復籍制停止，而跑松馳型質(zhì)粒午繼續(xù)復制，逮質(zhì)?？截悢?shù)王可由原來2模0多個擴增尺至1000及-3000部個，此時質(zhì)賄粒DNA占貴總DNA的井含量可由原澡來的2%增鍋加至40-旁50%。攪利用同一復晃制系統(tǒng)的不哨同質(zhì)粒不能浪在同一宿主鬧細胞中共同竭存在，當兩祥種質(zhì)粒同時康導入同一細崇胞時，它們田在復制及隨淡后分配到子疼細胞的過程殼中彼此競爭津，在一些細聾胞中，一種鼻質(zhì)粒占優(yōu)勢務，而在另一圈些細胞中另答一種質(zhì)粒卻喜占上風。當抓細胞生長幾劑代后，占少器數(shù)的質(zhì)粒將邪會丟失，因給而在細胞后葉代中只有兩燥種質(zhì)粒的一銜種，這種現(xiàn)謝象稱質(zhì)粒的宮不相容性（畏Incom偉patib雀ility基）。但利用難不同復制系紫統(tǒng)的質(zhì)粒則上可以穩(wěn)定地活共存于同一卸宿主細胞中朗。寨質(zhì)粒通常含竟有編碼某些面酶的基因，屠其表型包括而對抗生素的綠抗性，產(chǎn)生傲某些抗生素虛，降解復雜應有機物，產(chǎn)渡生大腸桿菌摩素和腸毒素燕及某些限制乓性內(nèi)切酶與踩修飾酶等。佩質(zhì)粒載體是黎在天然質(zhì)粒叔的基礎上為貴適應實驗室估操作而進行危人工構建的忘。與天然質(zhì)跡粒相比，質(zhì)博粒載體通常繁帶有一個或礙一個以上的么選擇性標記堆基因（如抗計生素抗性基劈因）和一個砍人工合成的環(huán)含有多個限搬制性內(nèi)切酶揉識別位點的誕多克隆位點綁序列，并去小掉了大部分誠非必需序列甩，使分子量駕盡可能減少傘，以便于基屯因工程操作與。大多質(zhì)粒砌載體帶有一捧些多用途的召輔助序列，仙這些用途包拋括通過組織蘆化學方法肉只眼鑒定重組績克隆、產(chǎn)生料用于序列測肌定的單鏈D萬NA、體外捆轉(zhuǎn)錄外源D給NA序列、叢鑒定片段的怎插入方向、漿外源基因的勝大量表達等美。一個理想坊的克隆載體息大致應有下叫列一些特性夏：（1）分暑子量小、多蹄拷貝、松馳傾控制型；（糠2）具有多律種常用的限柿制性內(nèi)切酶偏的單切點；嚼（3）能插烘入較大的外身源DNA片淘段；（4）謠具有容易操租作的檢測表伯型。常用的息質(zhì)粒載體大偵小一般在1渾kb至10福kb之間，理如計p憶BR322議、普p飽UC系列、注p刊GEM系列牽和pBlu軌escri斥pt（簡稱舊pBS）等經(jīng)。表3-1惹列舉了不同緩復制子類型北的質(zhì)粒。蒸表3-1首常見質(zhì)粒特喜性及復制子飯類型紫質(zhì)粒緒復制子類型患拷貝數(shù)夕用途港pBR32厭2末pMB1至15～20懂早期克隆載呈體歪pUC系列磁pMB1（庸改良）已500～7罪00休常規(guī)克隆載皆體埋pET系列慌pMB1剛15～20爪常規(guī)表達載虜體（T7）襪pGEM系繼列曠pMB1（以改良）拔300～7永00始克隆與表達鈴載體（T7柳）阻pSP系列快pMB1（果改良）舟300～7孩00針克隆與表達披載體（T7膚）原葉質(zhì)粒DNA芒抽提的基本邊原理創(chuàng)在細菌細胞殺內(nèi)，共價閉候環(huán)質(zhì)粒以超必螺旋形式存?zhèn)稍?。在提取畢質(zhì)粒過程中壁，除了超螺灶旋DNA外揪，還會產(chǎn)生蕩其它形式的榨質(zhì)粒DNA逢。如果質(zhì)粒砌DNA兩條遙鏈中有一條槍鏈發(fā)生一處如或多處斷裂蹲，分子就能郵旋轉(zhuǎn)而消除燒鏈的張力，悶形成松馳型膠的環(huán)狀分子柄，稱開環(huán)D漸NA(Op飄enci截rcula藍rDNA銜，簡稱o撒cDNA)墻；如果質(zhì)粒地DNA的兩聲條鏈在同一弄處斷裂，則祖形成線狀D犬NA(Li雄near問DNA)。塘當提取的質(zhì)歲粒DNA電踐泳時，同一師質(zhì)粒DNA染其超螺旋形峽式的泳動速抓度要比開環(huán)治和線狀分子甩的泳動速度勻快。章陸.1絞堿裂解法質(zhì)猜粒DNA的轉(zhuǎn)抽提尖主要包括3軌個基本步驟癢：裂解細胞明、分離和純充化質(zhì)粒DN纖A。緒（1）裂解誰細胞餡基本上先加線入溶菌酶作久用一段時間棚，破壁后再揉加入非離子種型去污劑或獵直接加入堿濁性偉SDS爆等以及作煮兵沸處理，以凳便破壁與膜另，處理的同姨時也能去除忘細胞碎片、汪染色體熱DNA英等雜質(zhì)。非賠離子去污劑炭法較溫和，真適用于抽提篇10般kb尚左右的質(zhì)粒揪；而煮沸法憂與堿性摔SDS耗法相對較劇濾烈，只能抽屢提小于10漲kb喬的質(zhì)粒。本陡實驗采用堿香性吼SDS塌法。（2）分離僻細菌基因組伍均比較大，咽如大腸桿菌彈的染色體約漆有4700誠kb暗長，在處理沸細胞過程中筐斷裂成不同望長度的雙鏈侮DNA尸片段。當溶釘液的乖pH瑞值調(diào)節(jié)到大賓于12時，竭雙鏈杠DNA迅中的氫鍵被礦破壞，于是霜染色體彎DNA詢雙鏈分離成溫單鏈；而超知螺旋狀態(tài)的著質(zhì)粒宴D煤NA鉆僅僅部分氫淚鍵被破壞，救只是部分雙鹽鏈解離成單映鏈。再將溶儀液的剩pH枝值調(diào)回中性串時，單鏈期DNA搶互相纏繞并恥且與蛋白質(zhì)采結(jié)合生成網(wǎng)濁絡狀大分子刪，而超螺旋箏的質(zhì)粒發(fā)生椒復性反應后龜仍然是小分拆子，通過離僵心很容易將醋兩者分開。禽達到分離的兼目的。（3）純化尤細胞裂解液索中的雜質(zhì)除柿了染色體萍DNA喂外，還有各運種細胞壁、湯膜的碎片、苗各種酶與其恨他蛋白質(zhì)、笑脂質(zhì)類雜質(zhì)聞以及軟RNA貢等。純化步僑驟應有針對據(jù)性地將它們此去除。離心曲去除各種細裂胞碎片；用公酚處理去除材蛋白質(zhì)，包我括各種酶；壽用存RNA柴酶處理去除證RNA錘等。酚是一丑種作用非?；娏业牡鞍琢曎|(zhì)變性劑，瓶能非常有效軋地是蛋白質(zhì)廚變性進而去軋除。氯仿有攤強烈的溶脂帝性，可去除陪脂質(zhì)類雜質(zhì)痰。酚/氯仿榜可節(jié)約重蒸蔬酚。氯仿能少將微量的溶灣于概DNA斗水溶液中的賣酚抽提掉，退否則微量的尼酚對于以后俯的酶切、轉(zhuǎn)正化等過程都晶會產(chǎn)生不利擠影響。抽提夢完成后的水陽溶液中仍有柜痕量的酚、銹氯仿等，可宏用乙醇沉淀陡的方法將它傭們除去。乙腎醇沉淀的特氧點是能在濃慘縮里DNA天的同時更換孫整個緩沖系轎統(tǒng)，但囑DNA左會有一定的樹損失。由于溉雜質(zhì)不易在赴乙醇中沉下哪，沉淀過程索可在0富℃蹈進行。乙醇受較異丙醇易長揮發(fā)，沉淀祝得到的蛋DNA夜比較干凈。蕉鹽等雜質(zhì)易譽在異丙醇中皺沉下。沉淀張DNA憶時加入鹽類抄的目的是中步和鏈上的電少荷，使墓DNA濟易于形成沉械淀。遠該方法抽提醋質(zhì)粒主要的牌試劑為溶液率I乞、琴II妹和氏III托，其在抽提誦質(zhì)粒DNA湊中的作用如經(jīng)下：扭溶液株I得：萄由葡萄糖、沾EDTA趕、濁Tris胃?知Cl蜘組成。葡萄甜糖的作用是匆增加溶液的課粘度，減少侮抽提過程中俘的機械剪切懲作用，防止慶破壞質(zhì)粒祝DNA列；晌EDTA葉的作用是絡嫂和掉屬Mg控2+它等二價金屬柿離子，防止皂DNA領酶對質(zhì)粒分資子的降解作同用；瞧Tris寄?揪Cl件能使溶菌液霞維持溶菌作恩用的最適氧PH絮范圍。鈔溶液半II殖：誼由窄SDS筋與貢NaOH悔組成。延SDS釀的作用是解粘聚核蛋白并熊與蛋白質(zhì)分宰子結(jié)合使之判變性；萬NaOH(賞pH>12錦)晃的作用是破晚壞氫鍵，使嗽DNA資分子變性。均溶液洽III悄：期由炮KAc特與辱HAc稀組成，是脂pH蘭值為5津.課5的高鹽溶吵液。能中和因溶液竟II罵的堿性，使膏染色體夫DNA漸復性而發(fā)生謊纏繞并使質(zhì)規(guī)粒焦DNA麥復性。丈K醒+先離子會與與SDS抄形成溶解度重很低的鹽并不與蛋白質(zhì)形補成沉淀而除趣去。溶液中線的染色體繼DNA項也會與蛋白艦質(zhì)-伯SDS艘形成相互纏性繞的大分子文物質(zhì)，很容械易與小分子尋的質(zhì)粒偽DNA蔥分離，此外幻，高鹽溶液氣也有利于各陷種沉淀的形秒成。維憑.2笛煮沸法質(zhì)粒貧DNA的抽渾提窄煮沸裂解法魄是將細菌懸延浮在含有能虛消化細胞壁膠的溶菌酶的屆緩沖液中，辟然后加熱到獻100漸℃庫使其裂解。捕加熱除了能犯破壞細菌外深壁，還有助濾于解開DN崇A鏈的堿基碰配對，并使糧蛋白質(zhì)和染瓜色體DNA益變性。但是鍛閉環(huán)質(zhì)粒D敗NA鏈彼此閉不會分離，雞這是因為它臭們的磷酸二討酯骨架具有魄互相纏繞的益拓撲結(jié)構。嗓當溫度下降淋后閉環(huán)DN成A的堿基又忌各就各位，浙形成超螺旋瘦分子。離心間除去變性的剃染色體DN雖A和蛋白質(zhì)哭，就可以從象上清中回收寬質(zhì)粒DNA面。煮沸裂解鄙法對于小于傘15kb的益小質(zhì)粒抽提歷非常有效。和但對于那些蔥經(jīng)變性劑，曬溶菌酶及加屑熱處理后能壟釋放大量碳階水化合物的徐大腸桿菌菌享株，則不推艦薦使用該法堆。這是因為郊碳水化合物農(nóng)很難除去，泊會抑制限制維酶和聚合酶線的活性。大宋腸桿菌菌株傻HB101蔥及其衍生菌互株（其中包忽括TG1）雞能產(chǎn)生大量演的碳水化合跟物，不適用歐于煮沸法裂埋解。該方法引的優(yōu)點是可擊以快速省時疫獲得一定量鋼的質(zhì)粒DN狂A，用于酶鐵切鑒定。他餐基因組DN惜A抽提的基邊本原理皮基因組DN耍A的提取通作常用于構建潑基因組文庫要、Sout敢hern雜差交（包括R擁FLP）及屆PCR分離素基因等。利當用基因組D搜NA較長的嬌特性，可以縮將其與細胞刺器或質(zhì)粒等燦小分子DN含A分離。加侄入一定量的喘異丙醇或乙復醇，基因組捆的大分子D斥NA即沉淀甘形成纖維狀腿絮團飄浮其誓中，可用玻壺棒將其取出牙，而小分子延DNA則只弦形成顆粒狀霧沉淀附于壁示上及底部，圓從而達到提囑取的目的。計在提取過程應中，染色體柔會發(fā)生機械舒斷裂，產(chǎn)生弦大小不同的卡片段，因此盟分離基因組里DNA時應治盡量在溫和注的條件下操干作，如盡量陶減少酚/氯壯仿抽提、混吹勻過程要輕疤緩，以保證爬得到較長的磚DNA。一爐般來說，構診建基因組文扭庫，初始D顛NA長度必鑼須在100飼kb以上,元否則酶切后電兩邊都帶合滋適末端的有洲效片段很少膠。而進行R超F(xiàn)LP和P庸CR分析，湖DNA長度頑可短至50堡kb，在該撞長度以上，鏈可保證酶切耐后產(chǎn)生RF停LP片段（婆20kb以陵下），并可剝保證包含P木CR所擴增鴉的片段（一南般2kb以貼下）。錦不同生物（標植物、動物老、微生物）郵的基因組D痕NA的提取至方法有所不并同，不同種罵類或同一種婆類的不同組磨織因其細胞喚結(jié)構及所含狼的成分不同信，分離方法糾也有差異。迎在提取某種高特殊組織的立DNA時必擠須參照文獻修和經(jīng)驗建立歪相應的提取池方法，以獲信得可用的D枝NA大分子攻。尤其是組洲織中的多糖喬和酶類物質(zhì)雀對隨后的酶厲切、PCR惜反應等有較慨強的抑制作規(guī)用，因此用敲富含這類物葵質(zhì)的材料提身取基因組D弱NA時，應卸考慮除去多均糖和酚類物手質(zhì)。目前針洽對不同類型杏的細胞均開倚發(fā)除了相應門的抽提試劑猴盒?；虺Ｒ?guī)實驗中槐從細菌基因冬組上PCR球擴增目的基傾因時，一般置所用的DN叢A量較少，懷可以采用較錄簡單的沸水絡浴裂解法制躲備少量的D谷NA。在短白時間的熱脈構沖下，細胞撥膜表面會出嶼現(xiàn)一些孔洞綿，此時就會怒有少量的染扯色體DNA檔從中滲透出歉來，然后離丘心去除菌體庸碎片，上清偉中所含的基裝因組DNA垃即可用于P葡CR模板。串而對于大量船的基因組D禿NA制備（隆如Sout推hern斯Blott咬ing，需寫大量基因組槳），可采用帖試劑盒抽提膽。蒙3.2試傾劑與器材居1.試劑婦 果（1）溶液縫I園 典堿溶法抽提礎質(zhì)粒DNA紛 羞葡萄糖淺 犬50浴mM找 漸Tris-招HCl盯 恰50mM食 忽EDTA提 妨10mM晚 源溶菌酶竹 紹5渴mg/mg陣 最使用前加入銜 拔（2）溶液惜II睛 心堿溶法抽提吊質(zhì)粒DNA醒 旱NaOH跡 陣0.2射M雕 散SDS偉 蒙1.0%秧 冤使用前用母死液配制晶 尚（3）溶液芽III（p鹽H5勇.5簽3M竭KAc）宏 癥堿溶法抽提嬌質(zhì)粒DNA籠 尾5如mol啞/L乙酸鉀泥 份60ml鐮 數(shù)冰乙酸測 劈11.5m盆l過 倒（4）苯酚傅飽和溶液標苯酚溶解后尺用什10mM瘦Tris痰（pH銜8.0膠）平衡至上直清中的水相薄pH升至芽8.0低 曉（5）氯仿朵 拒（6）異丙寶醇岡 裝（7）ST乖ET溶液儀 慶沸水浴抽提武質(zhì)粒DNA憤 摟蔗糖越 訓8%藏 罩Trito射nX-10腰0它 震5%慢 塊Tris-摔HCl(躍PH8.0價)叉 率50mM孝 跑EDTA評(PH8.尾0)氣 曉50mM刃 腎使用前加入扣溶菌酶至終楚濃度0.5樹待mg/ml結(jié) 約（8）Bu絲ffer用A紫 按大腸桿菌染溜色體DNA袋的制備覽 莊Tris-襯HCl(僅pH8.0廈)堤 掌10mM摔 僻EDTA縫(pH8.索0)勵 仙20mM兵 律使用前加入針溶菌酶至終時濃度5蒙mg/ml踐 旨（9）SD情S（10％禍）炎 儀（10）N程aOH（2消M）花 宋（11）N只aCl（5份M）儲 弱（12）R康N曲aseA（諸10蛇mg/ml翅）撲 朽固體粉末溶室于無菌水后雄煮沸10分兇鐘，后冷卻晶并分裝于小率管中墾-20爭℃匙保存臺 爆（13）冰肢乙醇（70柄％）幟 充可用95％童乙醇配制，恰-20環(huán)℃品保存?zhèn)溆幂d2.器材肢 弓（1）ep義pendo飄rf管，槍鏡頭慕 池（2）移液己器白 陜（3）水浴退鍋吐 豆（4）離心攝機蓮 運（5）搖床照3幕.辜菌種企 華（1）件E.col勒i碎JM83梳F倒’回，床ara別,劫lac-p簽ro盲AB)，慣rps博L，(掩Str飲r屋)，王80賊士lac經(jīng)Z婦M15陸 研（2）pM服D雀-phoA覆/JM83薯3.3實驗堆步驟狹3警.3.1橡沸水浴法快秀抽大腸桿菌椒質(zhì)粒DNA誕（1）在E疤ppe況n恨dorf管李中加入11察0吊l的STE訴T（使用前職加入溶菌酶改至終濃度為借5焦g/ml）債溶液，挑入莖米粒大小的旋菌團，充分卷懸浮并混勻瞎。淡（2）上述坑菌體懸浮液近沸水煮20牛秒。某（3）迅速勁放置于常溫窮下150捐00rpm怠離心15分嚇鐘。梢（4）用牙池簽挑去菌體柔碎片（白色偽沉淀），在齒上清液中加祖入100饞l橡的異丙醇（面注意不同樣粗品管中的溶議液平衡），傳充分混勻后招1爆5擋000r聚pm離心1笨5分鐘。自（5）棄上謠清液，沿管鵝壁四周加入綢70%冰乙援醇400接l洗滌上述均所得DNA凱樣品，完畢草后棄上清，淺管子倒扣1綢0S左右，蒼然后將DN按A沉淀涼干姻。棍（6）沉淀御涼干后用5局0呀l無菌重蒸朋水溶解，樣溜品可取5刮l酶切電泳紗分析或待用仆。牲3逐.3.撈2堿溶法筑制備大腸桿遺菌質(zhì)粒DN地A棚（1）取1廚.5ml過候夜細菌培養(yǎng)疑液于1.5奮ml離心管貪中，于臺式離高速離心機散中以15帥000rp磚m，常溫離駁心30秒，掏棄去上清液且并將離心管屬倒扣在濾紙習上。想（蝴4興管尺/聚組)汁（2）在離案心管中加入痕100變l溶液I懸察浮菌體，渦傘旋振蕩，以你充分懸浮菌澡體成均勻懸醫(yī)浮液。異（3）加入蟲200燃l溶液II肆，扣上離心哲管蓋，立即移輕輕混勻（援來回顛倒數(shù)臉次），至溶揪液幾乎澄清鍵，成淡黃色破透明粘液狀僻。鋒（4）打開葵離心管蓋，諷加入150雷l落溶液III育，輕輕混勻產(chǎn)（來回顛倒養(yǎng)數(shù)次），看會到淡黃色消鍬失，有大量夏白色沉淀生推成，然后離勞心。袋（5）常溫偏1500默0rpm離妄心10分鐘燦，小心吸取戰(zhàn)上清液于另衛(wèi)一離心管中飛。注意，不最要把白色絮豪狀物混入上釘清液中。放（6）清液甩中加入等體抵積的苯酚飽位和溶液：氯娃仿混合溶液霧（1:1）攪（各2呀00展l譯），充分混山勻，常溫1配5000站rpm離心疼10分鐘，且小心將上清喜液轉(zhuǎn)移至另諒一離心管。碗注意不要將氏下層有機相勁混入上清液莫中。蓬（7）在上奇清液中加入鄙-20箭℃針冷凍的異丙義醇60蓄0怨l滑，盈充分混勻，磁常溫15寒000顯僵rpm離心立10分鐘。坦（8）小心航傾去上清液消，注意避免釀把離心管底餡的白色DN眠A沉淀也隨助同上清倒掉煮。加入40圾0戀l75%足的冰乙醇，孝再1500邪0rpm離姥心1min裂，傾去上清個，倒扣離心猛管于濾紙上驢，稍許涼干昨。溪（9）加入踐100柜l無菌重蒸窯水溶解質(zhì)粒逝DNA，可葵在37耳℃里保溫5批~慚10分鐘。太(100撿l奔/管，4管虹)礎（10）合棉并于一管，晶加入2巡lRNa芽se，37渠℃篇保溫30分屬鐘，取5妙l電泳檢查玩消化徹底否濁。旱（以電泳前飼端無RNA摔條帶為準）齡（11）R拉Nase消君化完全后加香入等體積的旁苯酚飽和溶易液：氯仿混姐合溶液（1祖:1）（各晶3糕00燦l濫），充分混將勻，4碎℃姥，150析00rpm晌離心15分甩鐘，將上清權液轉(zhuǎn)移至另摘一離心管。影（12）在種上清液中加郊入0.1倍日溶液體積的呆3M,p霸H5.5網(wǎng)KAc（約螞40酒l拒），400消l姓的醉–艇20輪℃曉冷凍的異丙餅醇，充分混啞勻，4拖℃述，150肢00看馳rpm離心取20分鐘。疼（13）用距400低l75%聚的冰乙醇洗省滌一次，再嫁15000麻rpm離心主1min，罷傾去上清，房倒扣離心管嬸于濾紙上，度稍許涼干，陡待用。響（14）如摔需定量或檢笑測制備的質(zhì)侮粒DNA的墻質(zhì)量，可取認適量質(zhì)粒D繪NA進行適循當稀釋，測滑定OD活260nm圈和OD敲280nm滋值，計算O申D靈260nm臥/OD偽280nm野的比值。質(zhì)抄粒雙鏈DN解A量可以1牧OD犬260nm厚＝50陡g/ml計模算。OD些260nm目/OD己280nm你應為1.8累左右。插3亡.3.很3沸水浴兔制備染色體蝕DNA漠（1）在E戲ppe碑n帆dorf管閣中加入10適0嫩l的ddH罵2掉O，挑入米自粒大小的菌繳團，充分懸遙浮并混勻。昏（2）上述鉛菌體懸浮液備沸水煮20熄秒。政（3）迅速盟放置于常溫漢下150爆00rpm取離心10分舊鐘。端（4）用牙房簽挑去菌體撓碎片（白色元沉淀），上胡清待用。菊3患.3.鬼4大腸桿塌菌中染色體襖DNA的抽屋提縫（1）大腸脈桿菌一級瓶予培養(yǎng)過夜，幫以他10%附的接種量接志二級瓶培養(yǎng)駱4～5小時夕后，培養(yǎng)物擺以50械ml懇/管離心收紙獲（80仇00博rpm巷，先5min榴，青4帶℃飽）。凱（2）菌體社沉淀中加入衡10ml嫩山Buffe末rA，旋渦盯振蕩混勻，此37炸℃挪保溫30分煎鐘。絞（3）取出幻后加入10劫%SDS嗓至最終濃度賺為1%，輕顯輕混勻，3良7蜜℃客保溫30分巡鐘澄清即可牲。工（4）取出倆后加入20棵mg/ml好的ProK撓至最終濃度誠為5蕩g/ml，曠60圈℃攜保溫1小時參。（染色體合DNA結(jié)合績蛋白的消化插）辛（5）取出飛后加入預冷鋪的5MN羅aCl至最取終濃度為1憑M，混勻后茄冰浴30分鳥鐘（溶液要繩混合成為均肢相，并且冰截浴要充分，期時間可適當惠延長）。救（6）取出補后4遠℃稀，顛1堤5繡000茄rpm強離心30分間鐘。（離心妄前樣品管要狠進行平衡，倘以免離心機及受損）僵（7）在上砍清液中加入香6丸ml票苯酚和6膽ml演氯仿混合液分，混勻，室錄溫下宋12,00蠅0rpm蜂離心30分美鐘。福（8）在上溫清液中加入李10線ml溉氯仿，混勻艦，室溫下鏈1200線0rpm夜離心30分蘆鐘。河（9）取上段清液，加一短倍量異丙醇卷沉淀殃DNA冰，冰浴放置包30幅分鐘，衛(wèi)1抱5仿000r漫pm榨離心30分但鐘。棗（10）薯75%采冰乙醇洗左滌5分鐘。供（11）晾池干后，用全300杰l忘無菌雙蒸水頭溶解染色體錦DN儲A職，在37俘℃弊水浴中放置俊30分鐘。矩（12）用透2～2.5辭體積的無水咳乙醇沉淀(侄加入請p餐H5.5的萌KAc0厚.1體積)賴。呈（13）沉麻淀洗滌，抽專干后用dd源H詳2給O溶解，分嚷裝并保存于現(xiàn)-20摧℃意。禾4DN感A的連接蚊摘要鑄本單元摘主要介紹載高體和供體D繼NA連接的化影響因素，孔連接中兩種計DNA投入外量的確定原鹽則和，學會爐根據(jù)不同克摘隆要求設計貓連接反應。幼4.1實漫驗原理戚添DNA的施連接策略籍質(zhì)粒具有穩(wěn)但定可靠和操稅作簡便的優(yōu)捆點。如果要魯克隆較小的姐DNA片段飯(＜10k斥b)且結(jié)構捕簡單，質(zhì)粒惹要比其它任麻何載體都要聯(lián)好。在質(zhì)粒逃載體上進行撕克隆，從原駝理上說是很環(huán)簡單的，先采用限制性內(nèi)推切酶切割質(zhì)拖粒DNA和艇目的DNA例片段，然后栗體外使兩者木相連接，再廣用所得到重脖組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化四細菌，即可漠完成。的外源DNA忌片段和質(zhì)粒躬載體的連接夜反應策略有獨以下幾種：賣（1）互補中性粘性末端序的連接消單一限制性顫內(nèi)切酶或兩午種限制性內(nèi)瑞切酶（為同板尾酶，如B報amHI和托BglII亭）分別處理形載體和外源將DNA，得睛到的粘性末乘端為互補性膠突出末端，刷在連接反應箱中外源片段衫和質(zhì)粒載體趕DNA均可拒能發(fā)生自身車環(huán)化或幾個尺分子串連形按成寡聚物，蔽且正反兩種甚連接方向都萍可能有。為魔了降低載體新的自身環(huán)化宿，使正確的微連接產(chǎn)物數(shù)己量達到最高學水平，一般脫載體DNA哨和外源DN放A的分子數(shù)止比（濃度比上）為1：3舍～1：10副之間。同時孤，為了最大獻限度地抑制唇質(zhì)粒DNA堪的自身環(huán)化好，還可將載先體DNA的住5'磷酸基削團用堿性磷屆酸酯酶去掉遞，防止其自震身環(huán)化。而臥帶5'端磷約酸的外源D猴NA片段可君有效地與去遵磷酸化的載戲體相連，產(chǎn)凱生一個帶有悔兩個缺口的佩開環(huán)分子，康在轉(zhuǎn)入凍E.col階i箏受體菌后該傻種缺口可在做DNA復制呢過程種自動董修復。購（2）非互幅補粘性末端茂的連接乎用兩種不同江的限制性內(nèi)暗切酶進行消扭化可以產(chǎn)生獅帶有非互補芳的粘性末端延，這DNA剖重組中最容諸易克隆的D告NA片段。臺一般情況下低，常用質(zhì)粒胡載體均帶有浪多個不同限吃制酶的識別怠序列組成的逆多克隆位點趁，因而幾乎?？偰苷业脚c麥外源DNA擾片段末端匹猛配的限制酶廈切位點的載單體，從而將框外源片段定視向地克隆到應載體上。也搬可在PCR燒擴增時，在驕DNA片段略兩端人為加宿上不同酶切殲位點以便與筑載體相連。葛該種粘性末承端的連接載謎體DNA和婦外源DNA草的分子數(shù)比宅（濃度比）泳通常為為1趕：1。潛（3）平頭雀末端的連接崇是由產(chǎn)生平課末端的限制啦酶或核酸外尿切酶消化產(chǎn)描生，或由D堤NA聚合酶稻補平所致。亞由于平端的翼連接效率比碼粘性末端要薄低得多，故碧在其連接反桑應中，T4陡DNA連饞接酶的濃度濃和外源DN踩A及載體D悶NA濃度均友要高得多。來通常還需加忙入低濃度的軍聚乙二醇（蛾PEG8滿000）以肉促進DNA輸分子凝聚成槐聚集體的物尚質(zhì)以提高轉(zhuǎn)廊化效率。特還殊情況下，勉外源DNA座分子的末端晌與所用的載前體末端無法典相互匹配，縫則可以在線勻狀質(zhì)粒載體梅末端或外源口DNA片段糧末端接上合榮適的接頭（準linke邀r）或銜接固頭（ada考pter）凍使其匹配，階也可以有控屑制的使用掀E.co菌li歡DNA聚昂合酶漿Ⅰ弓的klen貌ow大片段本部分填平3換'凹端，使隨不相匹配的爆末端轉(zhuǎn)變?yōu)閾?jù)互補末端或諸轉(zhuǎn)為平末端怕后再進行連琴接。登4.1.嚷2憐DNA連鄭接酶類型校能用于連接諷DNA駱的酶有蝴2粱種：大腸桿液菌連接酶和繼大腸桿菌約T4想噬菌體所編情碼的棉T4-軟DNA連接清酶。前者的段反應需要荷NAD鐮+奏參與催化，比而猴T4逼連接酶的反螞應則需要撫ATP論參與催化。肆最初的研究守表明，大腸令桿菌連接酶飽只能催化粘鉗端的連接，男現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在行PEG讀或聚蔗糖存菌在的條件下騙，也能進行鍋平端的連接電。相比較而饒言，旋T4-DN銜A礙連接酶并不扯需要某PEG惠等的存在就品能進行平端志的連接，所地以現(xiàn)在實驗撥中絕大多數(shù)短情況下使用若T4-DN踏A僻連接酶。到4符.1捷.直3銜DNA連陡接的影響因塞素泛連接反應的渴影響因素包肥括溫度，時窄間，酶量，努緩沖體系，肝DNA末端牙的性質(zhì)（見角邪）及濃度，犁DNA片段熔的大小等。遮（1）溫度漁與時間汪連接反應的降一項重要參餡數(shù)是溫度瓶，比理論上連接壁反應的最佳縫溫度是37聞℃，此時連快接酶的活性建最高。但3陷7℃時粘性征末端分子形宜成的傲氫鍵風配對結(jié)構極慨不穩(wěn)定，因露此人們找到但了一個既可傅最大限度地剝發(fā)揮連接酶扔的活性，又易有助于短暫衛(wèi)配對結(jié)構穩(wěn)滿定的最適溫套度即12~做16℃。獄一般粘性末扶端的連接在犬此溫度下，壘反應30桿min言即可取得較宿好的效果，戚如時間充裕蘭的話連接6束0逝min艦則更完全些霸，為了實驗憂方便有時也蘇在4論℃益條件下連接魄過夜。而對幣于平頭末端阿的連接，建模議在37障℃信條件下連接未，并且時間核適當延長。（2）酶量礙酶單位的定繁義在寶生物灑工程公司提嬸供的T4腿-DNA碑連接酶中是伐指在20塌l霸的連接發(fā)應旱體系中，6瓣g鄉(xiāng)的牢勉DNA-轉(zhuǎn)HindI凈II虧的分解物在脈16爛℃課下發(fā)應30搶min肅時，有90嬸%以上的D喉NA片段進薄行連接的酶怠量為1U。頃由以上的定達義可知，日敲常連接實驗左中的DNA辱的濃度比酶全量定義的狀播態(tài)下低很多培10～總20張倍，所以實須際酶量是過谷量的。平頭鵝末端的連接哨酶的用量要側(cè)比粘性末端棄連接所需酶沙量大10州~100盜倍，因此廠艙商提供的連蓋接酶濃度往哄往是高濃度繞的（寶生物擴的T4沉-DNA摧連接酶濃度當350崖U/陰l享）。故從這完個意義上分午析，常規(guī)的太粘性末端的虛連接反應體戰(zhàn)系中酶量的活加入往往是奪過量的。綢（3）緩沖貿(mào)體系記不同公司的貪連接酶緩沖鍬液大部分含壽有Tris棉-HCl忙（險pH7.塞5野）提供連接嬌所需的合適揪pH肚值。另外在拒緩沖液中還扇有兩種主要罵成份非常重籃要：DTT舊和ATP。右前者提供一軟定的還原能朵力，而后者管能促進連接變反應的有效習進行。但是霉在實驗中緩寫沖液使用時余的反復凍融尾會引起AT厲P的分解，晚從而影響連刊接效率。為賴了保證實驗孤的順利進行腐，一般大劑消量的緩沖液閉可以分裝成揚小管保存并刷使用，另外論可考慮使用赤一段時間的者緩沖液定期籃更新一下。雙（4）DN垂A濃度畜DNA連接擠反應中建議皮的DNA連光接濃度為薄0.1~1鋪pmol/滋l絲，，而為了隙降低載體分中子間的環(huán)化承，載體DN秒A的濃度不礎宜過高，外掌源DNA的荒投入量則依暫據(jù)連接類型而不同投入1筋～10倍?？?.2試哀劑與器材幅1.試劑明 綱（1）外源浴DNA和載宰體DNA濫 咱（2）T4奴-DNA瘋連接酶洗2.器材永 結(jié)（1）ep判pendo槳rf管、槍尤頭養(yǎng) 沃（2）移液滴器布4.3實驗探步驟索4.3距.章1常規(guī)D屢NA分子的偷連接套（1）用適粘當限制酶消蝦化載體質(zhì)粒他和外源DN資A，必要時壩用瓊脂糖凝梁膠電泳分離扔片段。蠻（2）載體約DNA取A封梢l，外源D言NA取B溫l，充分混找勻后于42萬℃美保溫10分凡鐘后，迅速蟻冷卻到0島℃煙（可省略，駐熱脈沖是為魯了提高兩種傷DNA分子盲碰撞的概率管）。費（3）再按鋒設計的反應竄體系依次加塑入：煮10康×喜T蚊4歌-集緩沖液，T您4挺-踏DNA連接顆酶。使（4）置于嶄16留℃菜連接1h以廉上，待用。轎建議連接體怖系（可根據(jù)歇樣品濃度進塌行適當調(diào)整邊）：南ddH符2眾O（真l）侵 暮外源DNA宰（護l）助 晉載體DNA弄（帆l）椅 賀Buffe近r（幫l）惹 文Enzym悲e（宿l）重 餡Total拖（累l）江13-A-倆B凡 嫂B竊 乏A融 仙1.5巧 繳0旅.5塵 擔15突4.3沫.動2償PCR翠產(chǎn)物與T衛(wèi)-讓載體連接墨（1）回收軍的PCR擴騰增產(chǎn)物直接機與p臣MD18孤-T載體連宮接，連接反民應按如下：攀異 改5連×胖Buffe究r態(tài) 崖pMD18去-T吃 造PCR產(chǎn)物壯 系T4-DN啊Alig恨ase廣 撇∑熄 塌2扮l鴨 形0.5要l各 斑7研l(wèi)椅 薄0.5粉l圣 認10央l渡（2）16留℃禾連接1h以棋上，用于轉(zhuǎn)防化。墻5目的觸基因的PC削R克隆從摘要勞本單元步主要介紹細齡菌基因組中罰的目的基因吩的PCR克隊隆，要求學泡會PCR實濤驗中引物的量設計及后續(xù)泄克隆方案的疑確定。聯(lián)5.1實驗厲原理艱斯聚合酶鏈式晝反應（亞PCR蹈）的基本構扁成繁PCR指在呼引物指導下板由酶催化的贈對特定模板蜘（克隆或基眼因組方DNA在）的擴增反冰應，是模擬連體內(nèi)米DNA曲復制過程，論在體外特異悉性擴增牽DNA錢片段的一種詳技術，在分獅子生物學中同有廣泛的應攪用，包括用走于DNA作膀圖、DNA久測序、分子潛系統(tǒng)遺傳學筋等。觸PCR基本噴原理是以單摟鏈炒DNA備為模板，4翅種區(qū)dNTP刺為底物，在痰模板薄3’繭末端有引物柏存在的情況末下，用酶進繞行互補鏈的膜延伸，多次拆反復的循環(huán)凍能使微量的歸模板DNA詞得到極大程促度的擴增。要在微量離心刮管中，加入照與待擴增的擴DNA昨片段兩端已殊知序列分別伙互補的兩個混引物、適量殘的緩沖液、興微量的悉DNA友膜板、四種賺dNTP漁溶液、耐熱苦Taq我影DNA航聚合酶、硬Mg狡2+宋等。反應時敲先將上述溶尊液加熱，使漆模板題DNA咬在高溫下變校性，雙鏈解左開為單鏈狀嘉態(tài)；然后降并低溶液溫度輝，使合成引衫物在低溫下梯與其靶序列紙配對，形成謙部分雙鏈，護稱為退火；勻再將溫度升豬至合適溫度尤，在產(chǎn)TaqD主NA押聚合酶的催條化下，以盒dNTP碧為原料，引泄物沿蜜5’煙→狼3’寒方向延伸，逃形成新的古D貸NA蹲片段，該片鵝段又可作為附下一輪反應破的模板，如籮此重復改變塌溫度，由高很溫變性、低握溫復性和適皂溫延伸組成末一個周期，蓋反復循環(huán)，誓使目的基因漿得以迅速擴春增。因此感PCR夜循環(huán)過程為箱三部分構成甩：模板變性研、引物退火檢、熱穩(wěn)定燦DNA敘聚合酶在適市當溫度下催醫(yī)化隸DNA概鏈延伸合成銳。被（1）模板朋DNA冬的變性逐模板綱DNA慢加熱到90付~95裳℃誠時，雙螺旋老結(jié)構的氫鍵臨斷裂，雙鏈邁解開成為單火鏈，稱為掉DNA貨的變性。變豆性溫度與雹DNA駛中璃G-C倦含量有關，薦G-C左間由三個氫澇鍵連接，而綿A-T唉間只有兩個弱氫鍵相連，膚所以臟G-C出含量較高的呢模板，其解胃鏈溫度相對目要高些。故肯PCR中右DNA媽變性需要的損溫度和時間第與模板掃DNA評的二級結(jié)構宿的復雜性、挨G-C殘含量高低等域均有關。對揭于高拌G-C餓含量的模板輪DNA在實唱驗中需添加批一定量二甲紫基亞砜（D嘗MSO），威并且在PC雙R循環(huán)中起糞始階段熱變千性溫度可以覆采用97縫℃后，時間適當做延長，即所唉謂的熱啟動菠。端（2）模板雅DNA林與引物的退甚火質(zhì)將反應混合典物溫度降低敞至嬌37嬸~65按℃鼻時，寡核苷貞酸引物與單餅鏈模板雜交辛，形成規(guī)DNA玩模板-引物及復合物。退帖火所需要的指溫度和時間室取決于引物安與靶序列的凳同源性程度具及寡核苷酸犧的堿基組成撫。一般要求習引物的濃度跡大大高于模收板咽DNA我的濃度，并楚由于引物的裙長度顯著短踏于模板的長已度，因此在鉛退火時，引絲物與模板中統(tǒng)的互補序列尤的配對速度難比模板之間抱重新配對成桂雙鏈的速度描要快得多，司退火時間一戴般為1～2激min螞。辟（3）引物尼的延伸咐DNA譜模板-引物濱復合物在揀Taq臭譽DNA奇聚合酶的作廢用下，以剃dNTP皺為反應原料馳，靶序列為牙模板，按堿療基配對與半祥保留復制原企理，合成一飯條與模板奶DNA減鏈互補的新幣鏈。延伸所裙需要的時間切取決于模板決DNA拔的長度。在爐72罵℃羽條件下，漲TaqD瓜NA示聚合酶催化思的合成速度驚大約為40末～60個堿烈基/秒。經(jīng)集過一輪怒“鄙變性-退火黨-延伸億”交循環(huán)，模板態(tài)拷貝數(shù)增加弱了一倍。在暮以后的循環(huán)斬中，新合成沿的燦DNA匠都可以起模叔板作用，因睜此每一輪循務環(huán)以后，資DNA延拷貝數(shù)就增爐加一倍。每穩(wěn)完成一個循復環(huán)需2～4怪min蔑，一次答PCR信經(jīng)過30～坡40次循環(huán)喂，約員2女～奉3h嗓。擴增初期化，擴增的量矩呈直線上升行，但是當引胳物、模板、供聚合酶達到含一定比值時榴，酶的催化猶反應趨于飽列和，便出現(xiàn)遵所謂的杰“挖平臺效應匆”在，即靶DN福A產(chǎn)物的濃短度不再增加下。浩蒸PCR滾反應的五個桌元素羨參與鍵PCR全反應的物質(zhì)們主要為五種錯：引物、酶涂、因dNTP乏、模板和口Mg熱2+描。煎拼.1陸引物倡引物是華PCR票特異性反應細的關鍵，旦PCR決產(chǎn)物的特異蜜性取決于引奏物與模板艇DNA佩互補的程度鬼。理論上，仰只要知道任莫何一段模板寄DNA滲序列，就能袖按其設計互增補的寡核苷幼酸鏈做引物藍，利用駱PCR恒就可將模板像DNA匙在體外大量拘擴增。垃引物設計應迫遵循以下原西則：幟（1）引物憲長度垂長度要求在托15傻～按30bp歐，常用為移20bp征左右，引物怎過短時會造撈成評Tm體值過低，在撇酶反應溫度湊時不能與模洽板很好的配土對；引物過喪長時又會造孔成嘗Tm否值過高，超恥過酶反應的錄最適溫度，爭且合成長引晃物還會使費彎用大大增加餅。艙（2）引物面堿基構成絞引物的拉G+C慎含量以廚40襲～冠60%劉為宜，因為蚊G+C貨含量過高或到過低都會直死接造成蜘Tm粒值的過高或沫過低，都不肉利PCR反村應的進行。豈ATGC格最好隨機分換布，避免洗5燈個以上的嘌沾呤或嘧啶核妥苷酸的成串室排列。趟（3）引物簡二級結(jié)構南應盡量避免悼引物內(nèi)部出仿現(xiàn)二級結(jié)構塵，并且兩條五引物間不能嬸形成互補結(jié)團構，特別是墨3’戰(zhàn)端的互補，丟否則形成引涉物二聚體，買PCR擴增梯中產(chǎn)生非特醉異的條帶。踩引物自身也銹應無回文對蝦稱結(jié)構（限爹制性酶切位功點除外），也防止形成莖蠻環(huán)結(jié)構?？桑?）引物壤3’壺端序列撈3’惜端堿基要求索與模板嚴格靈配對，連續(xù)謝配對的堿基翠數(shù)超過15病bp慌，以避免因替末端堿基不臘配對而導致凳PCR汪失敗。陷（5）引物峰中酶切位點史的引入育引物中一般闖會引入一至跟兩個酶切位犬點，便于后院期的克隆實格驗，特別是患在用于表達揮研究的目的斜基因的克隆團工作中，P城CR克隆基劈因時已將后棵續(xù)方案設計慮完畢。選（6）引物奪的特異性伯引物應與核巴酸序列數(shù)據(jù)圣庫的其它序論列無明顯同戴源性，特別派是與待擴增刺的模板DN壤A之間要沒王有明顯的相員似序列。攜（7）引物短量績反應體系中鵝引物的常用壞濃度為勵0.1李～惰1pmol頃/編l達，以最低引炭物量產(chǎn)生所熟需要的結(jié)果班為好，引物背濃度偏高會詳在反應過程難中形成二聚恥體，過低則扶擴增效率會鑼降低。仿括.2嬸酶及其濃度既TaqD敵NA碎多聚酶是耐惰熱績DNA封聚合酶，是貨從水生棲熱脹菌（失Therm鐮usaq缺uatic父us阿）中分離的柳。辰TaqD想NA淺聚合酶是一曠個單亞基，織分子量為躺94謊，胸000D側(cè)a醋。具有其5’-->傳3逗的聚合酶活牙力，唯5’惠-->3’萄的外切核酸販酶活力，無信3’-->君5’妙的外切核酸辯酶活力，會液在遲3’盾末端不依賴煩模板加入肌1奴個脫氧核苷山酸（通常為爺A渴，故PCR犁產(chǎn)物克隆中棟有與之匹配些的T載體）蹄，在體外實僑驗中，童TaqD套NA暮聚合酶的出簡錯率為斧10攜-4破～秧10邪-5身。此酶的發(fā)生現(xiàn)使誤PCR儉廣泛的被應甩用。貧此酶具有以只下特點：帆（1）耐高流溫，在拘70票℃爽下反應謎2標小時后其殘蹲留活性在隔90%添以上，在矮93糧℃體下反應攻2麥小時后其殘易留活性是仍欣能保持量60%錘，而在膚95尿℃綿下反應熊2諸小時后為原仇來的滔40%屋。恥（2）在熱懇變性時不會目被鈍化，故維不必在擴增叫反應的每輪怎循環(huán)完成后府再加新酶。害（3）一般寸擴增的PC梅R產(chǎn)物長度證可達階2.0k羅b奔，且特異性錦也較高。廉PCR譽的廣泛應用積得益于此酶沒，目前各試事劑公司中開碼發(fā)了多種類媽型的Taq暑