Smad信號通路標(biāo)志性因子蛋白和基因的檢測,腫瘤學(xué)論文

瘢痕組織TGF-β1/Smad信號通路標(biāo)志性因子蛋白和基因的檢測,腫瘤學(xué)論文皮膚瘢痕的構(gòu)成是由于機體炎癥反響，膠原的合成與降解不平衡、異常粘多糖的出現(xiàn)以及纖維細(xì)胞的增生所造成。從廣義上來講，沒有疤痕就沒有創(chuàng)傷的愈合。疤痕組織的主要成分是纖維蛋白。疤痕組織膠原的產(chǎn)生和沉積增加了傷口的強度，從一般意義上來講是有益的。假如疤痕組織構(gòu)成不充分，受損組織得不到正常的張力，由此能夠引發(fā)很多并發(fā)癥，如腹壁切口愈合的疤痕薄弱，在腹內(nèi)壓的作用下可使疤痕處重新裂開或腹內(nèi)容物逐步向外膨出而構(gòu)成腹壁疝。相反，假如疤痕過度構(gòu)成，就可造成嚴(yán)重的外形或功能上的重要問題。因此疤痕相對于損傷前組織來講，總是一個不完善的替換。從機械角度來看，其抗強性減弱;從營養(yǎng)角度來看，造成了氧和營養(yǎng)物質(zhì)溝通的障礙;從功能角度看，引起受損組織的畸形和功能障礙，從美觀角度看，造成了外形的毀壞。部分病理性瘢痕具有增殖性，其呈現(xiàn)持續(xù)生長亢奮表現(xiàn)，患者可出現(xiàn)瘙癢難忍甚至疼痛破潰出血等異常感覺和狀態(tài)，病理性瘢痕不但影響患者的美觀、生理功能，且在長期受壓、持重、牽拉、摩擦、抓癢等不良刺激影響下有癌變可能。創(chuàng)傷傷口愈合經(jīng)過上皮化環(huán)節(jié)后，TGF－信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成纖維細(xì)胞內(nèi)被激活，使體內(nèi)合成和分泌更多的TGF－1受體，靶基因被持續(xù)性啟動，又由于TGF－信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞基質(zhì)沉淀以及纖維化密切相關(guān)，通路被過度激活后導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)被過度沉淀，最終構(gòu)成疤痕。在TGF－信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上Smad是該通路中藥的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，可將TGF－信號從細(xì)胞外表受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核，筆者現(xiàn)將不同瘢痕組織標(biāo)本進(jìn)行TGF－1/Smad信號通路標(biāo)志性因子蛋白和基因的檢測，以期為瘢痕癌治療提供新的臨床思路。1資料與方式方法1．1一般資料:標(biāo)本來源于本院2018年1月至2020年2月病理科。20份病理性瘢痕組織標(biāo)本設(shè)為觀察A組，華而不實男性11例，女性9例，年齡29－81歲，平均(425．32)歲，來源部位:頭面部9例，上肢6例，下肢5例，均有疤痕構(gòu)成史。20份標(biāo)本均經(jīng)過HE染色及光鏡檢查確診為瘢痕癌;20份瘢痕癌組織標(biāo)本設(shè)為觀察B組，華而不實男性10例，女性10例，年齡30－81歲，平均(427．11)歲，來源部位:頭面部8例，上肢7例，下肢4例，臀部1例，疤痕構(gòu)成原因:火燒傷11例，電擊2例，油燙傷7例;20份正常皮膚組織設(shè)為對照組，華而不實男性11例，女性9例，年齡31－82歲，平均(436．91)歲，部位:頭面部7例，上肢8例，下肢3例，臀部2例。三組標(biāo)本在年齡、性別、來源部位等一般情況無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)，具有可比性。1．2檢測方式方法1．2．1免疫組化1．2．1．1標(biāo)本制作:采用SP法進(jìn)行標(biāo)本形態(tài)學(xué)的檢測，標(biāo)本脫蠟、水化后使用PBS洗2－3次各5min，將3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10min，PBS洗2－3次各5min;抗原修復(fù);PBS洗2－3次各5min;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體。滴加Ⅰ抗50l，室溫靜置1h或者4℃過夜或者37℃1h。4℃過夜后需在37℃復(fù)溫45min。PBS洗3次各5min;滴加Ⅱ抗40－50l，室溫靜置，或37℃1h;Ⅱ抗中可參加0．05%的tween－20。PBS洗3次各5min;DAB顯色5－10min，在顯微鏡下把握染色程度;PBS或自來水沖洗10min;蘇木精復(fù)染2min，鹽酸酒精分化;自來水沖洗10－15min;脫水、透明、封片、鏡檢。1．2．1．2結(jié)果斷定:TGF－1陽性表示出是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均出現(xiàn)棕色顆粒，而Smad陽性表示出是細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒;每張切片隨機選擇5個視野，統(tǒng)計著色細(xì)胞與未著色細(xì)胞的比值(陽性率)。根據(jù)陽性率染色強度計分的乘積將免疫組化組織細(xì)胞陽性等級分為4個等級:陰性:積分＜2分;弱陽性:積分波動于2－3分之間;陽性:積分波動于4－6分之間;強陽性:積分＞6分。1．2．2Westernblotting1．2．2．1試劑:SDS－PAGE試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)膜緩沖液、膜染色液、包被液、顯色液購于廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司1．2．2．2提取蛋白和檢測:取不同組別皮膚組織200mg，利用蛋白酶抑制劑提取總蛋白。100℃金屬浴中變性后，進(jìn)行SDS電泳(4%濃縮膠，12%分離膠，120V，50mA，1．5h)，用PVDF膜轉(zhuǎn)?。?%脫脂奶粉液的封閉2h后，分別參加抗TGF－1、Smad和－actin抗體(1:1000)，4℃孵育過夜，次日參加堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:2000)室溫2h。參加顯色液，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)Bio－Rad公司，ModelGelDoc2000，美國)．分析處理。1．2．3Real－timePCR1．2．3．1試劑1．2．3．2試劑:dNTP、Pfu酶均購于上海生工生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自上海生工生物工程公司，基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司。1．2．3．3提取RNA:三組組織的標(biāo)本各100mg參加500L的Trizol試劑(Invtrogene公司)和100L的氯仿，均勻混合后置于離心機進(jìn)行14000r/min轉(zhuǎn)速的離心10min，將上層水相置于新的EP管后參加同等體積將RNA沉淀，枯燥后參加10L用DEPC處理去離子水溶解RNA沉淀，置于－80℃保存。1．2．3．4引物設(shè)計:針對國內(nèi)TGF－1、Smad的基因片段保守區(qū)域，根據(jù)美國基因庫(GenBank)收錄的基因序列，表1的引物由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司合成并標(biāo)記，擴增Ct值利用lightcycler熒光定量PCR儀配備軟件進(jìn)行分析。Real－TimePCR操作方式方法根據(jù)試劑盒講明書，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過ABI7000軟件獲得檢測指標(biāo)Ct(cyclethreshold)值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標(biāo)的Ct值。以對照組Ct值作為校正，軟件根據(jù)2－CT數(shù)值計算得出檢測指標(biāo)基因濃度水平。PCR擴增產(chǎn)物測序由廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司完成。詳細(xì)序列見表1，【表1】1．3統(tǒng)計學(xué)處理:所得所有數(shù)據(jù)采用SPSS18．0系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，圖像分析所產(chǎn)生數(shù)據(jù)用(x珋s)進(jìn)行表示，實驗結(jié)果采用單因素方差分析法進(jìn)行分析描繪敘述，組間兩兩比擬采用LSD法進(jìn)行，用等級相關(guān)(Spearman)分析變量之間的相關(guān)性，以=0．05作為檢驗水準(zhǔn)，P＜0．05以為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2．1TGF－1的蛋白表示出:TGF－1陽性表示出表現(xiàn)為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表示出分別為陰性、弱陽性和強陽性，其表示出水平、表示出強度在三者之間有差異(FPA=165．93，F(xiàn)OD=98．65，P＜0．01)，觀察B組蛋白表示出水平高于觀察A組和對照組(P＜0．05)，觀察A組和對照組之間蛋白表示出水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。進(jìn)行Westernblotting檢測后發(fā)現(xiàn)正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三組TGF－1的蛋白灰度值的表示出水平呈遞增式(FPA=113．25，P＜0．01)，觀察B組蛋白表示出水平高于觀察A組和對照組(P＜0．05)，觀察A組和對照組之間蛋白表示出水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。詳細(xì)見圖1，圖2。【圖略】2．2Smad的蛋白表示出:Smad陽性表示出表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中均有棕黃色顆粒，正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌中的表示出分別為弱陽性、陽性和強陽性，其表示出水平、表示出強度在三者之間有差異(FPA=99．94．93，F(xiàn)OD=78．49，P＜0．01)，觀察B組蛋白表示出水平高于觀察A組和對照組(P＜0．05)，觀察A組和對照組之間蛋白表示出水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。進(jìn)行Westernblotting檢測后發(fā)現(xiàn)正常皮膚、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌三組Smad的蛋白灰度值的表示出水平呈遞增式(FPA=102．89，P＜0．01)，觀察B組蛋白表示出水平高于觀察A組和對照組(P＜0．05)，觀察A組和對照組之間蛋白表示出水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)。詳細(xì)見圖3，圖4。2．3Real－TimePCR結(jié)果:觀察B組TGF－1、Smad基因表示出水平高于觀察A組和對照組(P＜0．05)，觀察A組和對照組之間TGF－1、Smad基因表示出水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)，見表2。【表2】2．4皮膚瘢痕癌中TGF－1、Smad表示出的相關(guān)性:經(jīng)過Pear-son相關(guān)分析，在皮膚瘢痕癌標(biāo)本中TGF－1與mRNATGF－1(r=0．727P＜0．01)，Smad與mRNASmad(r=0．812P＜0．01)的表示出均呈正相關(guān)。3討論皮膚受損后愈合要經(jīng)歷炎癥期、肉芽組織構(gòu)成期和瘢痕構(gòu)成期，在這里修復(fù)經(jīng)過中TGF－全程介入。皮膚受損后機體應(yīng)激反響趨勢大量血小板脫顆粒在傷處聚集，隨后TGF－對大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，隨之大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞被趨化至皮膚傷處，TGF－通過自分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)方式維持其在有效作用的濃度范圍內(nèi);另一方面，TGF－還可超化炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，超化炎性細(xì)胞在傷口聚集，可促進(jìn)細(xì)胞生長因子的分泌，而超化成纖維細(xì)胞，可到達(dá)刺激多種基質(zhì)蛋白膠原基因的轉(zhuǎn)錄，兩者均可到達(dá)愈合傷口的最終目的。經(jīng)過分子生物學(xué)大量研究發(fā)現(xiàn)，TGF－1/Smad信號通路能抑制和分化角質(zhì)細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞分泌的角質(zhì)細(xì)胞生長因子對組織損傷具有明顯的促進(jìn)修復(fù)和保衛(wèi)作用，TGF－1/Smad信號通路在一定程度上削弱了角質(zhì)細(xì)胞修復(fù)組織的作用，AnnesJP等對燒傷小鼠進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)Smad3基因敲除的小鼠體內(nèi)的角質(zhì)細(xì)胞分裂更快，燒傷創(chuàng)面感染率下降，傷口愈合恢復(fù)更為迅速，這一結(jié)果提示TGF－信號通路通過Smad蛋白抑制角質(zhì)細(xì)胞的增殖而影響傷口組織愈合。加快傷口創(chuàng)面重上皮化經(jīng)過，減少基質(zhì)的沉淀和炎性細(xì)胞的浸潤，可減少傷口愈合經(jīng)過中肉芽組織的構(gòu)成數(shù)量，這是傷口愈合的理想方式。在多數(shù)人類腫瘤患者中存在TGF－受體和Smad基因的過度表示出的現(xiàn)象，有報道以為TGF－蛋白的增殖與皮膚癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，TGF－受體蛋白的表示出水平和表示出強度是評估皮膚腫瘤程度的一個標(biāo)志性分子生物因子，本研究結(jié)果顯示，瘢痕癌患者的TGF－蛋白和基因的表示出水平和表示出強度均高于正常皮膚組別和病理性瘢痕組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)，講明TGF－受體的蛋白和基因在瘢痕癌標(biāo)本中的高表示出可能與瘢痕癌的發(fā)生相關(guān)，其發(fā)生機制可能與TGF－1影響組織纖維化進(jìn)程的特質(zhì)相關(guān):TGF－1可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生沉淀，華而不實最為明顯的是刺激成纖維細(xì)胞而導(dǎo)致粘連蛋白基質(zhì)的沉積，另一方面TGF－1可降低蛋白酶的活性，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解經(jīng)過，導(dǎo)致肉芽組織大量構(gòu)成而促進(jìn)病理性瘢痕構(gòu)成，而后惡化成瘢痕癌。Smad是TGF－信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的標(biāo)志性蛋白，Smads家族蛋白在將TGF－信號從細(xì)胞外表受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的經(jīng)過中起到關(guān)鍵性作用，TGF－1對細(xì)胞進(jìn)行刺激后，TGF－1型受體被磷酸化，與下游的Smad2/Smad3互相辨別編碼后被活化，與此同時與Smad4結(jié)合成由異源寡聚體構(gòu)成的復(fù)合體，繼而發(fā)生核轉(zhuǎn)移，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后啟動靶基因，促進(jìn)靶基因的啟動和轉(zhuǎn)錄。2006年Haiyan等使用蛋白免疫印跡法和RT－PCR法觀察TGF－1刺激細(xì)胞周期以及對其下游Smad蛋白家族因子基因的表示出影響，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩細(xì)胞模型的Smad基因表示出量高于正常模型細(xì)胞組別，提示了TGF－1促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)過度表示出而導(dǎo)致瘢痕的途徑。本研究結(jié)果顯示，瘢痕癌患者的Smad蛋白和基因的表示出水平和表示出強度均高于正常皮膚組別和病理