藥物分析甾體激素類藥物的分析專家講座

藥品分析第十五章:甾體激素類藥品分析藥物分析甾體激素類藥物的分析第1頁甾體激素類藥品分析甾體激素類藥品環(huán)戊烷并多氫菲母核激素類藥品發(fā)覺史SteriodHormonesCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第2頁甾體激素類藥品分析1.甾體激素是在研究哺乳動物內(nèi)分泌系統(tǒng)時(shí)發(fā)覺內(nèi)源性物質(zhì)發(fā)覺史2.1932年至1939年間，從腺體中取得雌酮(1932)、雌二醇(1932)、睪酮(1935年)及皮質(zhì)酮(1939)等純品結(jié)晶。

3.隨即，創(chuàng)造用薯蕷皂甙(Diosgenin)為原料進(jìn)行半合成生產(chǎn)甾體藥品，使生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大，成本降低4.發(fā)覺腎上腺皮質(zhì)激素治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及其在免疫調(diào)整上主要價(jià)值，使甾體藥品成為醫(yī)院中不可缺乏藥品

5.甾體口服避孕藥研究成功，使人類生育控制到達(dá)了新水平

CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第3頁甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素分類CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第4頁Contents結(jié)構(gòu)與分類1鑒別2檢查3含量測定4CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第5頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)母體結(jié)構(gòu)（環(huán)戊烷并多氫菲）CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第6頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)母體衍生結(jié)構(gòu)CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第7頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、腎上腺皮質(zhì)激素311172021氫化可松(hydrocortisone)醋酸地塞米松(dexamethasoneacetate)16α-甲基21-酯化17α-羥基9α-氟3-酮1,2-雙鍵11β-羥基20-酮CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第8頁CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第9頁本類藥品結(jié)構(gòu)特征A環(huán)Δ4-3-酮基,為共軛體系,在波長240nm附近有紫外吸收,部分藥品在C1-C2之間有雙鍵,也有紫外吸收CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第10頁本類藥品結(jié)構(gòu)特征C17位上為α-醇酮基,含有還原性.多數(shù)藥品有C17-α-羥基,部分藥品α-醇羥基與酸成酯.CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第11頁本類藥品結(jié)構(gòu)特征部分藥品C6或C9位由鹵素取代,呈對應(yīng)鹵化物反應(yīng)CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第12頁本類藥品結(jié)構(gòu)特征部分藥品C11位上有羥基或酮基取代CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第13頁二、雄性激素及蛋白同化激素第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)甲睪酮(methyltestosterone)丙酸睪酮(testosteronepropionate)苯丙酸諾龍(nandrolonephenylpropionate)17β-羥基CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第14頁甲睪酮(methyltestosterone)A環(huán)Δ4-3-酮基C17位上為羥基,部分藥品羥基被酯化雄性激素上母核為19個(gè)碳原子,蛋白同化激素在C10位上普通無角甲基,母核只有18個(gè)碳原子CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第15頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)三、孕激素黃體酮(progesterone)醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)米非司酮(mifepristone)CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第16頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)四、孕激素炔諾酮(norethisterone)左炔諾孕酮CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第17頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)三、孕激素黃體酮(progesterone)A環(huán)Δ4-3-酮基C17位上有甲酮基或乙炔基.多數(shù)在C17位上羥基部分藥品羥基被酯化CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第18頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)四、雌性激素CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第19頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)四、雌性激素有些藥品在C17位上有乙炔基,組成19-去甲孕甾烷母核A環(huán)為苯環(huán),C3位上有酚羥基,有藥品C3位上酚羥基成酯C17位上有羥基有些藥品C17位羥基成酯.CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第20頁第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)總結(jié)以下CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第21頁第二節(jié)Identification

物理常數(shù)測定化學(xué)判別法制備衍生物測定熔點(diǎn)UVIRTLCHPLC理化性質(zhì)與判別試驗(yàn)CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第22頁第二節(jié)Identification一、物理常數(shù)測定1.熔點(diǎn)炔雌醇m.p.201℃黃體酮雙肟m.p.238℃CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第23頁苯丙酸諾龍縮氨基脲m.p.178~185℃分解丙酸睪丸素m.p.150~156℃第二節(jié)IdentificationCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第24頁第二節(jié)Identification二、化學(xué)判別法2.比旋度3.吸收系數(shù)與強(qiáng)酸呈色反應(yīng)官能團(tuán)反應(yīng)1.與強(qiáng)酸呈色反應(yīng)甾體激素類藥品硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸呈色CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第25頁第二節(jié)Identification2.官能團(tuán)反應(yīng)①C17-α-醇酮基——還原性A.呈色反應(yīng)C17-α-醇酮基四氮唑鹽OH-呈色B.沉淀反應(yīng)C17-α-醇酮基氨制硝酸銀銀鏡反應(yīng)C17-α-醇酮基堿性酒石酸銅Cu2O↓CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第26頁第二節(jié)Identification②C3–酮基和C20–酮基甾酮類2,4-二硝基苯肼呈色異煙肼、硫酸苯肼異煙腙（黃色）睪酮異煙雙腙（黃色）黃體酮CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第27頁③甲酮基或活潑亞甲基第二節(jié)Identification亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚/芳香醛呈色藍(lán)紫色黃體酮④鹵素⑤酚羥基雌激素類重氮苯磺酸紅色偶氮染料CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第28頁⑥乙炔基第二節(jié)Identification↓炔雌醇白⑦酯基CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第29頁黃體酮三、UV四、IR第二節(jié)Identification酚羥基醇羥基炔鍵羰基苯環(huán)骨架振動CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第30頁第二節(jié)Identification五、TLC制劑分析對照品法炔諾酮六、HPLCCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第31頁第三節(jié)PurityTest一、TLC地塞米松磷酸鈉中雜質(zhì)檢驗(yàn)CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第32頁第三節(jié)PurityTest氫化可松中其它甾體檢驗(yàn)對照品60μg/ml供試品3.0mg/mlCHCl3-MeOH(9:1)溶劑硅膠GF254二氯甲烷-乙醚-甲醇-水385:60:15:2展開后晾干105℃干燥10min堿性四氮唑藍(lán)顯色CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第33頁對照溶液——0.02mg/ml供試液——1mg/ml二、HPLC第三節(jié)PurityTest黃體酮中相關(guān)物質(zhì)檢驗(yàn)供試品溶液雜質(zhì)峰數(shù)不得超出1個(gè)，其面積不得大于對照液主峰面積3/4CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第34頁第三節(jié)PurityTest三、硒檢驗(yàn)起源

合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫四、溶劑殘留甲醇和丙酮(GC)0.3%0.5%CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第35頁第三節(jié)PurityTest五、游離磷酸鹽檢驗(yàn)鉬酸銨磷鉬酸740nm，UVCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第36頁第四節(jié)Assay

HPLC

UV比色法非水溶液滴定法四氮唑比色法異煙肼比色法柯柏反應(yīng)比色法CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第37頁第四節(jié)Assay一、HPLC對照液供試液己烯雌酚黃體酮CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第38頁第四節(jié)Assay二、UV醋酸地塞米松CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第39頁第四節(jié)Assay三、比色法

比色法是指供試品在紫外-可見光區(qū)沒有強(qiáng)吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收，但為了防止干擾或提升靈敏度，可加入適當(dāng)顯色劑顯色測定方法。因?yàn)轱@色時(shí)影響原因較多，應(yīng)取供試品和對照品平行操作，采取對照品比較法測定，比色時(shí)采取試劑空白。CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第40頁第四節(jié)Assay比色法

腎上腺皮質(zhì)激素類OH-[還原]2,3,5-TriphenyltatrazoliumchlorideTTC(RedtatrazolineRT)甲潛(Formazan)深紅色λmax480~490nmCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第41頁第四節(jié)AssayBluetetrazolineBTBT-單甲潛BT-雙甲潛藍(lán)色

λmax525nmCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第42頁氫化可松軟膏含量測定第四節(jié)Assay精密量取對照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液1ml，搖勻，各再精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40min～45min，在485nm波優(yōu)點(diǎn)罰別測定吸收度，計(jì)算，即得影響原因基團(tuán)溶劑與水分堿空氣中氧與光線溫度與時(shí)間CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第43頁第四節(jié)Assay（1）基團(tuán)對反應(yīng)速度影響C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯C16不論何種取代基ν↓（2）溶劑、水分影響含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→幾無反應(yīng)—無水乙醇(無醛)CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第44頁第四節(jié)Assay（3）O2與光線影響（4）堿種類及加入次序反應(yīng)應(yīng)在強(qiáng)堿性（pH13.75）條件下進(jìn)行以氫氧化四甲基銨結(jié)果最正確（5）溫度與時(shí)間t℃↑→ν↑→甲瓚分解↑→%↓CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第45頁(二)異煙肼法(Isonicotinicacidhydrazide)第四節(jié)AssayINH△4-3-酮IsonicotinicacidHydrazideCompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第46頁第四節(jié)Assay影響原因（1）反應(yīng)速度C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反應(yīng)專屬性強(qiáng)（2）溶劑選擇異煙肼鹽酸鹽→甲醇、乙醇無水（3）水分、O2與光線影響含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時(shí)→O2與光線無影響CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第47頁第四節(jié)Assay(4)酸、異煙肼量鹽酸:異煙肼=2:1酸度↑→異煙肼鹽↓酸度↓→A↓樣品:異煙肼=1:8→ν↑

(5)溫度t℃↑→ν↑CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第48頁第四節(jié)Assay(三)Kober反應(yīng)比色法CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第49頁第二步反應(yīng)515465450500550nmAKober反應(yīng)吸收光譜第一步反應(yīng)第四節(jié)Assay采取本法測定炔雌醇片及復(fù)方炔諾酮片、復(fù)方炔諾孕酮滴丸、復(fù)方左炔諾孕酮片中炔雌醇含量CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第50頁第四節(jié)Assay四、非水滴定——米非司酮五、生物樣品中甾體激素分析Dopingcontrol濫用藥品檢測刺激劑麻醉劑β-阻斷劑利尿劑遮蔽劑合成類固醇及β2激動劑肽類激素外源性內(nèi)源性CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第51頁興奮劑檢測特點(diǎn)色譜方法是理想檢測伎倆。1976年使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用伎倆檢測甾體，1980年開始用毛細(xì)管氣相色譜法檢測，至1984年大致基本定型。藥品及其代謝物種類多，改變大，禁用百余種藥品以原體或一個(gè)或多個(gè)代謝產(chǎn)物形式存在與人體體液中，所以，需要檢測和確證化合物多達(dá)幾百種。除此以外，用藥后不一樣時(shí)間，這些化合物濃度不停發(fā)生改變，直到排出體外。藥品在人體體液中濃度很低，藥品在人體體液中濃度經(jīng)常是ng級或更低水平，所以對檢測靈敏度要求很高。要求準(zhǔn)確定性和定量，不能有絲毫疏漏和差錯(cuò)。檢測者要對每一個(gè)藥藥品代謝動力學(xué)及光譜分析有全方面嫻熟了解及足夠分析參考資料CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第52頁檢測基質(zhì)1.尿液尿樣檢測是興奮劑檢測理想樣本。其優(yōu)點(diǎn)在于：取樣方便；對人無損害；尿液中藥品濃度高于血液中藥品濃度；尿液中其它干擾少。2.血樣補(bǔ)充尿樣分析方法不足，當(dāng)前尚處于研究探索階段，當(dāng)前僅用于血液回輸，紅細(xì)胞生成素，生長激素，絨毛膜促性腺激素，睪酮等測量。CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第53頁3.頭發(fā)在法醫(yī)，毒性分析中已經(jīng)有較長歷史，但在興奮劑研究中是才興起研究方向。有采樣輕易，無損傷，不易作弊特點(diǎn)，備受關(guān)注。皮質(zhì)類固醇在體內(nèi)消除很快，假如賽前停藥，尿液分析就檢測不到，而發(fā)樣分析仍可檢出。4.體液CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第54頁檢測步驟一、篩選方法（1）揮發(fā)性含氮化合物組：主要檢測刺激劑。這類藥品多以游離形式排出。（2）難揮發(fā)含氮化合物組：主要檢測麻醉陣痛劑和β-阻斷劑。這兩類藥品多以結(jié)合形式排出，所以需先水解，使之游離，再進(jìn)行衍生化后檢測。（3）利尿劑組：藥品經(jīng)提取后用高效液相色譜法分析檢測，此組同時(shí)檢測2種興奮劑、咖啡因和匹莫林。（4）甾體同化激素組：這類藥品有以游離形式，有以結(jié)合形式排出，我們所用方法為同時(shí)檢測。CompanyLogo藥物分析甾體激素類藥物的分析第55頁二、確證方法經(jīng)篩選判為陽性尿樣，需深入加以確證，依據(jù)要求，確證結(jié)果須給出藥品或其代謝物質(zhì)譜圖，所以在確證方法中均使用氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用儀，確證時(shí)分組同篩選方法中所述。（1）揮發(fā)性含氮化合物組方法同篩選，最終之提取物濃縮后進(jìn)樣于GC/MSD。（2）難揮發(fā)含氮化合物組方法同篩選，最終之衍