研究方法課件

第二章細胞生物學項榮

PreparatoryobserveputforwardtheoriesDesigncontroltestsCollectdataExplainresultsDeviseconclusion

Refertoknowledge

第一節(jié)顯微成像技術第二節(jié)細胞工程技術第三節(jié)細胞組分的分離技術第四節(jié)細胞組分的分析方法內(nèi)容提要分辨率(resolution，R)：R=0.61λ/(nsinα/2)R=0.61x0.5/1.5=0.2μmn介質(zhì)折射率空氣：1油：1.5μm(micrometer)=10-6mnm(nanometer)=10-9m?(?ngstr?munit)=10-10ma.普通光學顯微鏡取材－固定－脫水－包埋－切片－脫蠟－復水－染色－脫水－透明－封片－觀察b.熒光顯微鏡Fluorescentdyesc.激光共聚焦掃描顯微鏡Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.d.相差顯微鏡TwowaystoobtaincontrastinlightmicroscopyE.ElectronicimageprocessingLimitofresolutionoftheelectronmicroscope.Electronmicrographofathinlayerofgoldshowingtheindividualfilesofatomsinthecrystalasbrightspots.Thedistancebetweenadjacentfilesofgoldatomsisabout0.2nm(2?).二、電子顯微鏡電鏡技術的基本特點1）電子束照明系統(tǒng)，包括電子槍、聚光鏡。電子束比可見光的波長短得多，提高了分辨力。2）電磁透鏡成像系統(tǒng)聚焦成像。3）真空系統(tǒng)：電子運行中如遇到氣體分子將會被散射，所以電鏡鏡筒中要求高真空。4）記錄系統(tǒng)：電子像是人眼看不到的，因此要用熒光屏來顯示或感光膠片作記錄。電鏡種類1.透射電子顯微鏡2.掃描電子顯微鏡Immunogoldelectronmicroscopy.1.超薄切片（40～50nm）。2.固定→包埋→切片→染色等過程要求高。3.重金屬鹽染色或噴鍍，以形成不同程度的反差，提高分辨力。4.負染技術5.冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術電鏡技術的基本要求：

Diagramofthecoppergridusedtosupportthethinsectionsofaspecimeninthetransmissionelectronmicroscope.ElectronmicrographsofindividualmyosinproteinmoleculesMetalShadowingAllowsSurfaceFeaturestoBeExaminedElectronmicrographofnegativelystainedactinfilaments.Freeze-fractureelectronmicrographofthethylakoidmembranesfromthechloroplastofaplantcell.Freeze-FractureandFreeze-EtchElectronMicroscopy

Regulararrayofproteinfilamentsinaninsectmuscle.Scanningelectronmicroscope(SEM)

ImagesofsurfacescanbeobtainedbySEM;Critical-pointdrying;Range:15－150,000X.Resolution:5nmScanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog(A).Thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy(B)andbythin-sectionelectronmicroscopy(C).細胞工程技術一、細胞培養(yǎng)二、細胞融合三、顯微操作細胞培養(yǎng)（cellculture）概念是指從活體中取出的細胞或其他建系細胞，在體外給予一定的條件進行培養(yǎng)，使其能繼續(xù)生存、生長和繁殖的一種方法。細胞培養(yǎng)的用途1）直接觀察活細胞的形態(tài)、結(jié)構和生命活動的過程。

2）直接施加物理、化學和生物因子，觀察對細胞影響。

3）可將不同種類的細胞混合培養(yǎng)，研究細胞間的相互作用。

4）配合其他的實驗技術可作大量的研究工作，如細胞周期與調(diào)控、細胞衰老等。

5）為植物育種開辟新途徑，為疫苗生產(chǎn)、藥物研制提供新手段。細胞培養(yǎng)的條件1）溫度

2）pH值

3）營養(yǎng)物質(zhì)

4）無菌條件A.動物細胞培養(yǎng)B.植物細胞培養(yǎng)C.非細胞體系D.細菌的培養(yǎng)E.病毒的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)的種類動物細胞培養(yǎng)的特點

1）能顯示來源組織的分化特征。

例如：成纖維細胞仍能分泌膠原;

神經(jīng)細胞伸展出具有電興奮作用的軸突。

2）可從組織的不同類型的細胞混合群體中

純化某種類型的細胞，便于單因素的分析。

3）取材容易，使用方便。細胞培養(yǎng)的方法1）貼附型：能在玻璃或塑料瓶壁上平展生長，形成單層細胞層。如上皮型細胞、成纖維型細胞等。2）懸浮型：不貼附于支持物上，呈懸浮生長，胞體呈球形。如淋巴細胞等。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primaryculture）1）概念

直接取材于有機體組織的細胞培養(yǎng)。2）步驟取材→剪碎→胰酶消化將細胞分散→置合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)，一般數(shù)小時即可貼壁生長、增殖，直到相互接觸鋪滿瓶壁，形成單層細胞。第一代細胞稱為原代細胞。傳代培養(yǎng)（secondaryculture）：將原代培養(yǎng)的細胞取出，轉(zhuǎn)移到另一盛有新鮮培養(yǎng)液的器皿中進行培養(yǎng)的過程稱傳代培養(yǎng)。用這種方法可重復傳代。

細胞系(cellline)概念培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生了具有無限繁殖能力的變異細胞，這種細胞可被無限地傳代，稱為細胞系常用細胞系：細胞系細胞類型來源

3T3成纖維細胞小鼠

BHK-21成纖維細胞倉鼠

Hela上皮細胞人宮頸癌

PTK1上皮細胞袋鼠

L6成肌細胞大鼠

SP2漿細胞小鼠植物細胞培養(yǎng)A單倍體培養(yǎng)B原生質(zhì)培養(yǎng)Preparationofhybridomasthatsecretemonoclonalantibodiesagainstaparticularantigen(X).MonoclonalAntibodiesThetechniqueforthetakeapartandgatherupofcell,andmicroscopemanipulation

Transgenicmice10weeks44gand29gMethodstointroduceamembrane-impermeantsubstanceintoacell.GeneKnockoutmiceMarioCapecchi(Late1980s)(UniversityofUtah)embryonicstemcellsininnercellmassastargetcells1/104cellsundergoaprocessofhomologousrecombination.Step-by-stepprocedureforthepurificationoforganellesbydifferentialcentrifugation.1.差速離心（differentialcentrifugation）

差速離心在密度均一的介質(zhì)中，不同大小的顆粒沉降速度不同，大顆粒沉降快，先到管底，逐步加大離心力，延長離心時間，可分離細胞的不同組分。組織勻漿沉淀小塊含整個細胞核和細胞骨架低速離心1000g10min將上清中速離心20000g20min沉淀小塊含線粒體、溶酶體、過氧化物酶體沉淀小塊含微粒體小泡將上清高速離心80000g1小時沉淀小塊含核糖體、病毒、大分子將上清超高速離心150000g3小時2.密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)在離心管中制備由上到下逐漸增加密度的蔗糖溶液（5%—20%），形成密度梯度，細胞勻漿放最上面，這樣不同組分以不同速率沉降，形成不同的沉降帶，分別收集，進行分析。密度梯度離心

Theseparationofsmallmoleculesbypaperchromatography.3.PaperchromatographyTheseparationofmoleculesbycolumnchromatography.4.Columnchromatography5.chromatography細胞組分的分析方法一、組織化學和細胞化學法二、免疫化學法三、分子細胞生物學技術金屬沉淀法福爾根(Feulgen)反應

聯(lián)苯胺反應脂溶染色法茚三酮反應一、組織化學和細胞化學法二、免疫化學法蛋白印跡法(westernblot)SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresisSDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS).（一）DNA序列分析（二）核酸分子雜交技術Northernblot，Southernblot（三）聚合酶鏈式反應技術（PCR)（四）放射自顯影術三、分子細胞生物學技術

雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖PCR反應過程示意圖InsituhybridizationforRNAlocalizationintissues.TracingandAssayingMoleculesInsideCellsTheresultsofapulse-chaseexperimentinwhichpancreaticbetacellswerefed3H-leucinefor5minutesfollowedbyexcessunlabeledleucine(thechase).VisualizingintracellularCa2+concentrationsusingafluorescentindicator.

Fluorescentanaloguecytochemistry.Fluorescencemicrographoftheleadingedgeofalivingfibrob