微生物遺傳變異與菌種保藏增加內(nèi)容課件

第八章微生物遺傳變異

與菌種保藏(增加內(nèi)容)本章內(nèi)容：第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變及修復(fù)第三節(jié)基因重組第四節(jié)微生物誘變育種第四節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯及保藏

第一節(jié)基因突變與誘變育種一、基因突變二、突變與育種三、營養(yǎng)缺陷型的篩選（一）突變類型

細(xì)胞形態(tài)1、形態(tài)突變型

菌落形態(tài)

營養(yǎng)缺陷型2、生化突變型抗性突變型抗原性突變（包括細(xì)胞內(nèi)部、表面成分的改變）3、致死性突變型

（合成關(guān)鍵性酶的基因發(fā)生了突變，則表現(xiàn)出致死突變）條件致死突變型——如突變?yōu)闇囟让舾行屯蛔儯?7℃死，25℃活）4、其它突變型毒力突變、糖發(fā)酵突變、產(chǎn)量、產(chǎn)品突變等。（二）突變的特點(diǎn)1非對應(yīng)性：環(huán)境與變異無對應(yīng)性。2自發(fā)性：非人為的誘變因素下發(fā)生。3規(guī)律性：某一特定性的突變率具規(guī)律性。4獨(dú)立性：一個(gè)基因的突變對其它基因突變無影響。5稀有性：生物自發(fā)突變率為10-6～10-12。6誘變性：誘變劑可提高突變率10~105X。7穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳。8可逆性：有回復(fù)突變。彷徨試驗(yàn)（1）抗性細(xì)胞的出現(xiàn)，是在接觸噬菌體之前

（2）噴上噬菌體，僅起淘汰野生型和鑒別抗性株作用；

（3）于甲方高度彷徨，說明突變是隨機(jī)的。平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)涂布敏感菌5×104個(gè)共12個(gè)平板5×104個(gè)菌落5000個(gè)細(xì)菌/菌落噴入T1保溫重新涂布后噴入T1保溫6個(gè)平板共353個(gè)菌落

6個(gè)平板共28個(gè)菌落影印培養(yǎng)無藥培養(yǎng)基含藥培養(yǎng)基影印培養(yǎng)試驗(yàn)

原始敏感菌種（1）實(shí)驗(yàn)表明：從未接觸str的菌株可發(fā)生抗性突變，分離可得到純的str菌株。（2）由此表明：突變是自發(fā)的與環(huán)境不對應(yīng)的。（四）基因突變的機(jī)制（自學(xué)）1DNA的復(fù)制（核苷酸對摻入錯(cuò)誤）微生物自身產(chǎn)生誘變物質(zhì)

（咖啡堿、硫氫化合物、重氮絲氨酸等）環(huán)境對微生物的誘變作用（輻射、加熱等）二突變與育種（一）自發(fā)突變與生產(chǎn)育種（二）誘變育種（一）自發(fā)突變與生產(chǎn)育種1.生產(chǎn)選育：群體培養(yǎng)中個(gè)別的變異個(gè)體表現(xiàn)出生長優(yōu)勢，發(fā)現(xiàn)突變種后，隨時(shí)分離、純化。

2.定向培育：用特定的環(huán)境長期處理某一微生物群體,同時(shí)不斷對其移種、傳代，以達(dá)到積累和選擇合適的自發(fā)突變體的一種育種方法。（1）自發(fā)突變(spontaneous)：

在非人為的情況下由于遺傳物質(zhì)的微小變化引起的性狀變異。（2）原因可能是：

1）環(huán)境因素；2）自身有毒產(chǎn)物的積累；3）互變異構(gòu)效應(yīng)；3、自發(fā)突變的機(jī)制1、概念

誘變育種是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。（1）概念：凡能提高基因突變頻率的理化因素。

（2）種類：1）物理因子（phisicalagents)

物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。2）化學(xué)因子(chemicalagents)3）轉(zhuǎn)座子(transposableelements)2、誘變劑

烷化劑(alkylatingagents)：

如：氮芥、硫酸二乙酯、亞硝基胍、NTG等

機(jī)制：將烷烴加在含氮堿基上，改變氫鍵性質(zhì)?；瘜W(xué)誘變劑：堿基類似物

(baseanalogs)：

如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）等；

機(jī)制：在DNA復(fù)制時(shí)將堿基類似物插入DNA中，而堿基類似物沒有正常堿基的氫鍵性質(zhì)，在DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)突變體。3.誘變程序：

原始菌種原菌種特性鑒定純化斜面/肉湯培養(yǎng)單孢子/單細(xì)胞懸液誘變劑處理計(jì)算存活率平板分離觀察形態(tài)變異，挑單菌落移至斜面初篩復(fù)篩小試良種保藏中試4誘變的主要環(huán)節(jié)（1）誘變劑的選擇（2）出發(fā)菌株的選擇（3）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備（4）設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法

（3）單孢子或單細(xì)胞懸液的制備

1）必要性：單細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑，避免出現(xiàn)不純的菌落——菌種退化。2）制備：物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液。3）方法：三角瓶內(nèi)加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑），用無菌脫脂棉過濾。4）濃度：細(xì)菌、放線菌108個(gè)/ml

霉菌、酵母菌106個(gè)/ml

（4）設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法

1）初篩：平板上做定性、半定量的測定，觀察突變株的生理效應(yīng)范圍。方法梯度平板法（抗性菌株）紙片法（抗性菌株）透明圈法（淀粉酶產(chǎn)生菌株等）變色圈法（氨基酸生產(chǎn)菌株）2）復(fù)篩：（見P250）

較精確的生物化學(xué)分析方法—做搖瓶測定三、營養(yǎng)缺陷型的篩選（一）概念（二）篩選方法

（一）概念1.三種遺傳型個(gè)體2、篩選用的培養(yǎng)基1.三種遺傳型個(gè)體（1）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）：

經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。如：lys-;bio-;（2）野生型(wildtype)：

自然界分離到的任何微生物，在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株，為該微生物的野生型。如：lys+;bio+;

（3）原養(yǎng)型(prototroph)：

指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。

2、篩選用的培養(yǎng)基1）基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）[-]：

滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求最低成分的組合。

2）完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）[+]：

滿足一切auxo生長的天然或半組合培養(yǎng)基。3）補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)auxo生長的組合培養(yǎng)基。（二）篩選方法1、誘變處理2、

auxo的濃縮3、auxo的檢出4、auxo的鑒定5、auxo的應(yīng)用

1.誘變處理（同前)auxo的篩選程序：細(xì)菌培養(yǎng)離心洗滌誘變處理

CM后培養(yǎng)洗滌

MM加PN

涂布于CM平板影印培養(yǎng)挑取鑒定菌種保存。2.auxo的濃縮：（1）抗生素法：

1）原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細(xì)胞，對休止態(tài)細(xì)胞無作用。2）方法：菌培養(yǎng)在含抗生素的MM基中。（2）菌絲過濾法：1）適用于絲狀（放線菌、霉菌）2）原理：基本培養(yǎng)基上只有發(fā)育成菌絲；auxo孢子可通過濾膜，野生型菌絲不能通過。（3）差別殺菌法：基本培養(yǎng)基上只有野生型生長，加熱殺死野生型營養(yǎng)體，保留auxo芽孢。細(xì)菌—80℃酵母——60℃適用于產(chǎn)芽孢、孢子菌。3.auxo的檢出（1）逐個(gè)檢出法（2）影印平板培養(yǎng)法（3）限量補(bǔ)充法（在mm中加0.01%蛋白胨，

auxo菌落小，野生型大）（4）夾層培養(yǎng)法4.auxo的鑒定（1）生長譜法

1）方法簡便；2）回變和污染不影響結(jié)果3）測定物質(zhì)可為粉末或紙片（2）混合氨基酸（Vit）法混合氨基酸法步驟：1）將多種營養(yǎng)因子編組，如：2）將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)3）結(jié)果分析4）營養(yǎng)因子分組編排時(shí)注意：

A、每組內(nèi)無重復(fù)的營養(yǎng)因子

B、每組中應(yīng)包含只出現(xiàn)一次的因子

C、每組中其他因子應(yīng)分別出現(xiàn)二次一組：12345二組：26789三組：37101112四組：48111314五組：591214155.auxo的應(yīng)用（1）作為標(biāo)記菌株：進(jìn)行基因工程、誘變育種、代謝過程的研究中的親本標(biāo)記；（2）作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；（3）作為aa、維生素、堿基的測定菌株。第二節(jié)基因重組一、原核生物的基因重組二、真核生物的基因重組基因重組把兩個(gè)不同性狀個(gè)體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個(gè)體的方式。

基因重組——分子水平的雜交

一般雜交——細(xì)胞水平如：

甲

乙生長快、產(chǎn)量低生長慢、產(chǎn)量高

基因重組

生長快、產(chǎn)量高一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（三）接合(conjugation)（四）原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）（一）轉(zhuǎn)化（transformation)概念——

受體細(xì)胞(receptor)直接吸收了來自供體細(xì)胞(donor)的DNA片斷，并把它整合到自己的基因組中，細(xì)胞部分遺傳性狀發(fā)生變化的現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化。

1.感受態(tài)2.感受態(tài)因子3.轉(zhuǎn)化因子4.轉(zhuǎn)化的檢出（1）感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。（2）轉(zhuǎn)化的決定因素：不同菌株的親緣關(guān)系;受體細(xì)胞是否處于感受態(tài)；不同菌出現(xiàn)感受態(tài)的時(shí)間不同。1.感受態(tài)一種胞外蛋白質(zhì)，分子量為5～10kD其作用為：（1）催化轉(zhuǎn)化，促進(jìn)外來DNA片段吸收。（2）可降解細(xì)胞表面某種成分，使DNA受體暴露。1）不同菌細(xì)胞DNA受體位點(diǎn)不同。2）有的菌感受態(tài)因子只對同種菌起作用。2.感受態(tài)因子3.轉(zhuǎn)化因子（1）轉(zhuǎn)化因子由供體提供