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流式細(xì)胞儀原理與應(yīng)用陳玉嬋流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第1頁提要流式細(xì)胞儀介紹流式細(xì)胞儀工作原理流式試驗(yàn)流程流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第2頁流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展史1930s~1950s:開始出現(xiàn)自動(dòng)細(xì)胞分析技術(shù)(細(xì)胞計(jì)數(shù),是經(jīng)過光電儀統(tǒng)計(jì)流過一根毛細(xì)管細(xì)胞,用結(jié)合了熒光素抗體去標(biāo)識(shí)細(xì)胞內(nèi)特定蛋白,應(yīng)用分層鞘流原理,成功設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器。)1960s晚期發(fā)展:熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)、細(xì)胞分選器檢測(cè)細(xì)胞熒光信號(hào)、單克隆抗體技術(shù)1973年,BD企業(yè)與美國斯坦福大學(xué)合作,研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACSI。流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第3頁什么是流式細(xì)胞儀?在流動(dòng)狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征一個(gè)儀器儀器特點(diǎn):?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞經(jīng)過狹窄激光束,產(chǎn)生能夠反應(yīng)細(xì)胞大小信號(hào),激光束激發(fā)不一樣熒光素所標(biāo)識(shí)細(xì)胞成份能發(fā)射出不一樣熒光。InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第4頁流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)象藻類細(xì)胞染色體血細(xì)胞原生動(dòng)物細(xì)胞任何存在于懸液中直徑為0.2-50微米粒子或細(xì)胞都適合用于流式分析流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第5頁流式細(xì)胞儀工作原理示意圖流式基本組成:1.流動(dòng)室和液流系統(tǒng)2.光路系統(tǒng)3.電系統(tǒng)流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第6頁流式細(xì)胞儀可提供信息物理信息:經(jīng)過散射光信號(hào)反應(yīng)相對(duì)細(xì)胞大小相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度熒光信息:經(jīng)過熒光強(qiáng)度反應(yīng)

流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第7頁散射光信號(hào)產(chǎn)生488nm激光產(chǎn)生散射光流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第8頁1.散射光信號(hào)前向角散射光(FSC,ForwardScatter)入射激光同向散射光信號(hào)反應(yīng)細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積側(cè)向角散射光(SSC,SideScatter)入射激光90角散射光信號(hào)

反應(yīng)細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性

流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第9頁散射光散射光能被用來區(qū)分不一樣細(xì)胞群體基本形態(tài)上差異通常使用“散點(diǎn)圖”來看散射光信號(hào)散點(diǎn)圖上一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒數(shù)據(jù)

流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第10頁利用散射光信號(hào)對(duì)混合細(xì)胞分群流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第11頁2.熒光信號(hào)熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多,產(chǎn)生熒光信號(hào)越強(qiáng)流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第12頁熒光信號(hào)表示方法雙參數(shù)點(diǎn)圖單參數(shù)直方圖流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第13頁一個(gè)完整流式試驗(yàn)組成樣品處理調(diào)整儀器條件數(shù)據(jù)處理流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第14頁1.樣品處理單細(xì)胞懸液制備濃度51051106/mL外周血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞、組織(經(jīng)尼龍網(wǎng)300目過濾)制成單細(xì)胞懸液選擇適當(dāng)熒光染料染色必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配置激光器所激發(fā)激發(fā)光譜必須在儀器上濾光片能夠接收適當(dāng)范圍內(nèi)熒光素光譜重合應(yīng)該盡可能降低流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第15頁2.儀器條件確實(shí)定電壓閾值熒光賠償(多色分析)流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第16頁處于液流中粒子經(jīng)過激光束時(shí)產(chǎn)生光信號(hào),這些光信號(hào)經(jīng)過光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)(電壓)。調(diào)整電壓,可使信號(hào)強(qiáng)度改變。BD流式細(xì)胞儀有兩種類型光電探測(cè)器:光電二極管和光電倍增管(PMTs)。PMT用于檢測(cè)較弱SSC信號(hào)和熒光信號(hào),光電二極管用于檢測(cè)較強(qiáng)FSC信號(hào)電壓流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第17頁閾值閾值:信號(hào)放大過程會(huì)產(chǎn)生不需要脈沖信號(hào),通常來自于碎片。經(jīng)過設(shè)定某一信號(hào)最低強(qiáng)度值,可將不需要脈沖信號(hào)去除,這一設(shè)定值稱為閾值。流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第18頁熒光賠償采取適當(dāng)方法校正熒光染料之間疊加所造成誤差流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第19頁熒光賠償流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第20頁賠償調(diào)整試驗(yàn)過程樣本準(zhǔn)備:陰性樣本,單陽性樣本調(diào)整:第一步:陰性樣本調(diào)整全部PMT第二步:?jiǎn)侮栃詷颖菊{(diào)整賠償判斷標(biāo)準(zhǔn):流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第21頁賠償模型PE-X%FITC賠償前賠償后FITC單染流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第22頁數(shù)據(jù)分析設(shè)門設(shè)定陰性與陽性群體界限確定陽性與陰性細(xì)胞群體統(tǒng)計(jì)陽性或陰性細(xì)胞群體百分率,平均熒光值,絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第23頁設(shè)門設(shè)門意義:選定要分析目標(biāo)細(xì)胞流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第24頁設(shè)門流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第25頁怎樣設(shè)定陰性與陽性界限流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第26頁流式檢測(cè)結(jié)果表示方法百分率絕對(duì)計(jì)數(shù)平均熒光強(qiáng)度圖形:直方圖、散點(diǎn)圖流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第27頁流式細(xì)胞儀能夠告訴我們什么?流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第28頁流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞學(xué)應(yīng)用細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞學(xué)應(yīng)用粒度細(xì)胞表面面積核漿百分比DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量染色體分析細(xì)胞功效細(xì)胞表面/胞漿/核特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子酶活性激素結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞受體細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第29頁流式細(xì)胞儀在微生物研究中應(yīng)用DNA蛋白過氧化物生成胞內(nèi)pH判別死/活細(xì)菌和酵母菌并計(jì)數(shù)區(qū)分革蘭氏陽/陰性細(xì)菌研究酵母菌細(xì)胞器基因表示-綠色熒光蛋白病原菌與吞噬細(xì)胞關(guān)系-吞噬引發(fā)呼吸暴發(fā)病毒-細(xì)胞相互作用:病毒感染造成細(xì)胞蛋白表示改變,對(duì)細(xì)胞周期干擾,對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平影響病毒引發(fā)凋亡流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第30頁流式細(xì)胞儀臨床應(yīng)用HIV免疫分型,CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)白血病和淋巴瘤免疫分型腫瘤細(xì)胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞移植交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞計(jì)數(shù)殘量白血病細(xì)胞檢驗(yàn)HLA-B27檢驗(yàn)血小板功效及相關(guān)疾病流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第31頁賠償調(diào)整試驗(yàn)流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第32頁藻類細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第33頁細(xì)胞周期分析DNA含量分析-PI染色流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第34頁流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第35頁細(xì)胞凋亡細(xì)胞膜分析-PS外翻PS(磷脂酰絲氨酸)正常暴露在胞膜內(nèi)表面,凋亡時(shí),PS外翻向細(xì)胞外表面。重組蛋白Annexin-V可與PS結(jié)合流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第36頁細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第37頁細(xì)胞生理學(xué)研究Ca2+流動(dòng)性檢測(cè)Ca2+是非常主要細(xì)胞內(nèi)離子,在胞膜到胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用。細(xì)胞受到刺激后,胞內(nèi)Ca2+濃度會(huì)發(fā)生改變。最慣用染料Indo-1excitedatUVFluo-3excitedat488nmFuraredexcitedat488nm流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第38頁細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞活性分析

FluoresceinDiacetate進(jìn)入活細(xì)胞后,被胞內(nèi)酯酶降解,生成熒光底物.活細(xì)胞會(huì)發(fā)綠色熒光流式細(xì)胞儀培訓(xùn)第39頁細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞膜電位改變超極化細(xì)胞攝取更多染料,細(xì)胞總熒光強(qiáng)度增大;細(xì)胞去極化時(shí),染料釋放到細(xì)胞外,總熒光強(qiáng)度降低。染料和試劑DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin

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