細(xì)胞生物學(xué)的研究技術(shù)和方法線粒體活體染色與觀察

細(xì)胞生物學(xué)的研究技術(shù)和方法線粒體活體染色與觀察第1頁/共30頁醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)李姣（吳明松）細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室2014.11～2014.12TEL：8609692E-mail:270378076@qq.aom1號(hào)綜合樓2-25室第2頁/共30頁預(yù)習(xí)；穿白大衣并扣好；認(rèn)真操作；愛護(hù)儀器；保持衛(wèi)生；保持安靜。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1#############。2#########。3############。4###################。5#############。6#########7#########實(shí)驗(yàn)課要求第3頁/共30頁實(shí)驗(yàn)室安全注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)完成后檢查水電；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物回收焚燒：填表責(zé)任制；了解化學(xué)試劑毒性和安全使用規(guī)則；突發(fā)情況處理及逃生，如各種原因起火分別用關(guān)電閘、蓋布、打開門窗、報(bào)警，及其他突發(fā)情況，依次離開實(shí)驗(yàn)室及大樓等。第4頁/共30頁本學(xué)期實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)度安排第一次(驗(yàn)證性)

細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)和方法線粒體的活體觀察第二次(驗(yàn)證性)

細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白和堿性蛋白的原位顯示細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA的原位顯示第三次(驗(yàn)證性)

細(xì)胞膜的通透性觀察小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活動(dòng)的觀察第四次(驗(yàn)證性)

細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的原位顯示細(xì)胞有絲分裂的觀察第五次(設(shè)計(jì)性)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告匯報(bào)及指導(dǎo)第六次(設(shè)計(jì)性)

動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞核的分離與鑒定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)第5頁/共30頁第一次實(shí)驗(yàn)Ⅰ

細(xì)胞生物學(xué)的研究技術(shù)和方法Ⅱ

線粒體活體染色與觀察第6頁/共30頁I細(xì)胞生物學(xué)的研究技術(shù)和方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)顯微觀察亞顯微觀察細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞組分的分離純化技術(shù)細(xì)胞和亞細(xì)胞組分的測(cè)定原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)分級(jí)分離技術(shù)層析法電泳法細(xì)胞化學(xué)法熒光細(xì)胞化學(xué)法放射自顯影技術(shù)第7頁/共30頁顯微結(jié)構(gòu)microscopicstructure在光學(xué)顯微鏡下所觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)亞微結(jié)構(gòu)submicroscopicstructure細(xì)胞內(nèi)小于0.2μm的細(xì)微構(gòu)造，通常使用各種電子顯微鏡進(jìn)行觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)分辨力（率）resolution顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處能夠區(qū)分相近兩點(diǎn)最小距離的能力。第8頁/共30頁普通光學(xué)顯微鏡lightmicroscope，LM染色后可觀察線粒體、中心體、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)最大分辨力一般為0.2μm相差顯微鏡phasecontrastmicroscope觀察活細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)和變化第9頁/共30頁暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope反差大、分辨力高（0.04μm)觀察活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器以及液體介質(zhì)中的細(xì)菌和真菌等的存在和運(yùn)動(dòng)第10頁/共30頁熒光顯微鏡fluorescencemicroscope光源——紫外線細(xì)胞熒光化學(xué)，特別是免疫熒光技術(shù)中的重要工具，可觀察細(xì)胞或標(biāo)本中的熒光現(xiàn)象第11頁/共30頁分辨力達(dá)0.08nm觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)二維平面圖像透射電子顯微鏡TEM掃描電子顯微鏡SEM分辨力一般在3nm觀察細(xì)胞（樣本）表面形貌三維立體圖像第12頁/共30頁第13頁/共30頁細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)cellculture細(xì)胞在體外的培養(yǎng)技術(shù)，即在無菌條件下，從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)正常生理狀態(tài)下生存的基本條件，讓它在培養(yǎng)器皿中繼續(xù)生存、生長和繁殖的方法。第14頁/共30頁原代培養(yǎng)primaryculture直接從機(jī)體獲取的組織或細(xì)胞進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代細(xì)胞以一定比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中的擴(kuò)大培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)secondaryculture一般傳一次稱為一代第15頁/共30頁細(xì)胞融合cellfusion又稱為細(xì)胞雜交，指細(xì)胞彼此接觸時(shí)，兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的現(xiàn)象。含有同一親本細(xì)胞核的融合細(xì)胞含有不同親本細(xì)胞核的融合細(xì)胞同核體homokaryon異核體heterokaryon細(xì)胞融合技術(shù)第16頁/共30頁自然融合人工誘導(dǎo)融合細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤等的重要手段，尤其對(duì)單克隆抗體及細(xì)胞去分化的研究開拓了一條新的途徑物理化學(xué)生物第17頁/共30頁細(xì)胞組分的分離純化技術(shù)細(xì)胞組分的分級(jí)分離cellfractionation根據(jù)細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的比重和大小等不同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不同的原理，用不同介質(zhì)或不同轉(zhuǎn)速的離心，將細(xì)胞內(nèi)各組分分級(jí)分離出來，并進(jìn)行分析的方法。第18頁/共30頁基本步驟組織勻漿分級(jí)分離分析密度梯度離心差速離心用細(xì)胞化學(xué)法或生物化學(xué)的方法分析、鑒定得到的細(xì)胞組分第19頁/共30頁差速離心第20頁/共30頁密度梯度離心第21頁/共30頁細(xì)胞和亞細(xì)胞組分的測(cè)定細(xì)胞化學(xué)法cytochemicalmethod在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用某些化學(xué)物質(zhì)可與細(xì)胞內(nèi)某種成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在局部范圍形成有色沉淀物（或電子密度高的物質(zhì)）的原理，對(duì)細(xì)胞的化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位和定量的研究。第22頁/共30頁堿性蛋白顯示酸性蛋白顯示第23頁/共30頁I細(xì)胞生物學(xué)的研究技術(shù)和方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)顯微觀察亞顯微觀察細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞組分的分離純化技術(shù)細(xì)胞和亞細(xì)胞組分的測(cè)定原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)分級(jí)分離技術(shù)層析法電泳法細(xì)胞化學(xué)法熒光細(xì)胞化學(xué)法放射自顯影技術(shù)第24頁/共30頁II線粒體活體染色與觀察了解線粒體的原位分布；了解活體染色的原理和方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?5頁/共30頁二、實(shí)驗(yàn)原理線粒體上的細(xì)胞色素氧化酶系可保持詹納斯綠B染料始終處于氧化狀態(tài)而呈綠色?；铙w染色：應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑顯示活細(xì)胞內(nèi)某些天然結(jié)構(gòu)，是對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)影響較小的一種染色方法。第26頁/共30頁20min實(shí)驗(yàn)步驟（點(diǎn)擊圖片查看詳細(xì)介紹）取口腔粘膜上皮細(xì)胞：

用牙簽輕輕在口腔頰部內(nèi)側(cè)粘膜上來回刮取幾下即可。注意掌握力度。滴加染液：

滴加1～2滴詹納斯綠B染液于載玻片上的口腔粘膜上皮細(xì)胞上。蓋蓋玻片：用鑷子夾住蓋玻片的一端，使另一端輕輕接觸染液，慢慢沿染液往下放，當(dāng)蓋玻片幾乎與載玻片持平時(shí)，抽出鑷子。注意動(dòng)作要輕，避免產(chǎn)生氣泡。顯微鏡下觀察（鏡檢）：

用低倍鏡在視野中尋找目標(biāo)，用高倍鏡進(jìn)行觀察。觀察線粒體：細(xì)胞質(zhì)無色，在細(xì)胞質(zhì)中散在一些藍(lán)綠色短桿狀和圓形顆粒，即為線粒體。2008級(jí)臨床K4班學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果第