基因治療(概述)

基因治療CompanyLogo目錄基因治療的發(fā)展史1基因治療的概述2基因治療的策略3問題互動5基因治療的方式42LogoCompanyLogo基因治療的定義基因治療（genetherapy）是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。也包括轉基因等方面的技術應用。也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當?shù)氖荏w細胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說，凡是在基因水平上進行操作而達到治療疾病的所有療法。3LogoCompanyLogo基因治療的發(fā)展史時間發(fā)生事件研究者1944DNA是轉化物質(zhì)Avery1953DNA雙螺旋結構模型WatsonandCrick1963遺傳密碼的破譯Brenner1979重組體DNA技術、基因轉染MulliganandBerg1980臨床地貧研究Cline1990第一個臨床試驗（ADA)基因BlaséandAnderson1992大量癌癥臨床試驗美國等1993中國制定第一部基因治療質(zhì)控要點中國1997至今重組病毒的產(chǎn)業(yè)化及其技術改進美國4LogoCompanyLogo基因治療的發(fā)展史上世紀九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導致嚴重免疫缺損的四歲女孩，由美國國立衛(wèi)生研究院用ADA基因治療，取得療效?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜纾鸲эA，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。5LogoCompanyLogo基因治療的發(fā)展史人民網(wǎng)深圳2003年10月22日15：30急電正在這里召開的深圳市政府新聞發(fā)布會向世界公布了一項振奮人心的消息：“個基因治療藥物在中國誕生”。世界首深圳市賽百諾基因技術有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥——“重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日獲得國家儀器藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標志著我國在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達世界領先水平，在國際競爭中搶占了先機。世界第一個基因治療藥物在中國誕生6LogoCompanyLogo基因治療的概述基因治療的基本內(nèi)容：基因診斷：產(chǎn)生基因缺陷的原因除了進化障礙因素外，主要包括點突變、缺失、插入、重排等DNA分子畸變事件的發(fā)生。目前已建立多種病變基因的診斷和定位方法：如PCR擴增序列法、單鏈構型多態(tài)性分析法、人類基因庫搜尋法等7LogoCompanyLogo基因治療的發(fā)展史基因分離：利用DNA重組技術克隆、鑒定、擴增、純化用于治療的正?；?，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列和基因表達調(diào)控原件進行體外重組操作。載體構建：主要有病毒和非病毒兩大類，病毒載體一般都需要重新構建。基因轉移：關系到基因治療成敗的關鍵單元操作8LogoCompanyLogo基因治療的概述根據(jù)靶細胞不同，基因治療分為：

將正?；蜣D移到體細胞，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療目的。

將正常基因轉移到患者的生殖細胞（精細胞、卵細胞中早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體，顯然，這是理想的方法。實際上，這種靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質(zhì)性進展。體細胞基因治療：生殖細胞基因治療：9LogoCompanyLogo基因治療的概述生殖細胞的基因治療不僅可使遺傳疾病在當代得到治療，而且還能將新基因傳給患者后代，使遺傳病得到根治。但生殖細胞的基因治療涉及問題較多，技術也較復雜。因此，如今更多地是采用體細胞基因治療。體細胞應該是在體內(nèi)能保持相當長的壽命或者具有分裂能力的細胞，這樣才能使被轉入的基因能有效地、長期地發(fā)揮“治療”作用。因此干細胞、前體細胞都是理想的轉基因治療靶細胞。10LogoCompanyLogo基因治療的策略體細胞基因治療的策略：基因修正基因置換基因激活基因增補基因干擾免疫調(diào)節(jié)藥物敏感療法11Logo基因治療的策略（一）基因修正通過特定的方法如同源重組或靶向突變等對突變的DNA進行原位修復,將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。但目前在技術上還無法做到。因為要在人基因組的某個特異部位上進行重組是一個非常復雜的過程。然而原位修復的方法無疑是進行基因治療最理想的途徑和目的。12Logo基因治療的策略（二）基因置換

基因置換指去除整個變異基因，用有功能的正常基因取代之，使致病基因得到永久地更正。傳統(tǒng)上所謂基因治療實際上就是指基因替代療法，就像外科移植手術一樣。13Logo基因治療的策略（三）基因激活

有些正?；虿荒鼙磉_并發(fā)生了基因突變，而是由于被錯誤地甲基化或編碼區(qū)組蛋白去乙?；拢灰灿械氖蔷幋a區(qū)是正常的但調(diào)控區(qū)發(fā)生了突變。前者可以通過去甲基化或乙?；够蚧謴突钚?；后者可以加入正常啟動子來激活基因。但是實現(xiàn)定點去甲基化和乙?；卜且资?；原位修復調(diào)控序列也是很難的。14Logo基因治療的策略（四）基因增補

又稱基因修飾，是指將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，目的基因的表達產(chǎn)物能修飾缺陷細胞的功能會使原有的某些功能得以加強。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。15Logo基因治療的策略（五）基因干擾

又稱基因失活，有兩種干擾方法：1、抑制有害的基因表達：導入腫瘤抑制基因，（如rb或p53),以抑制癌基因的異常表達。

2、封閉有害基因：用反義RNA或小分子干擾RNA來瘋幣癌基因，同樣不能恢復癌基因的正常功能，但可用來抑制病原體的關鍵基因。16Logo基因治療的策略（六）免疫調(diào)節(jié)

將抗體、抗原或細胞因子的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，改變患者的免疫狀態(tài)，達到預防和治療疾病的目的。如將白細胞介素-2導入腫瘤患者體內(nèi)，提高患者IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達到防治腫瘤復發(fā)的目的。17Logo基因治療的策略（七）藥物敏感療法

應用藥物敏感基因轉染腫瘤細胞，以提高腫瘤細胞對藥物的敏感性。如向腫瘤細胞導入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予患者無毒性的環(huán)氧鳥苷藥物。腫瘤細胞被殺死，而對正常細胞無影響。18Logo基因治療的策略一些常見疾病的基因治療策略：19Logo基因治療的方式1.直接體內(nèi)療法（invivo）是指將目的基因直接導入體內(nèi)有關的組織器官，使其進入相應的細胞并進行表達。2.間接體內(nèi)療法（exvivo）是指在體外將目的基因?qū)氚屑毎?jīng)過篩選和增殖后將細胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達相應產(chǎn)物，以達到治療的目的。20Logo基因治療的方式直接體內(nèi)療法（invivo）、利用反轉錄病毒載體時，要求靶細胞處于分裂期，但許多需進行基因治療的組織多處于靜止期、目前用溫和病毒載體直接注入相應的組織21Logo基因治療的方式間接體內(nèi)療法（exvivo）、從患者體內(nèi)取出帶有缺陷基因的細胞，并培養(yǎng)；、將帶有目的基因的載體通過轉染或感染轉移到培養(yǎng)的靶細胞中，進行遺傳修正、對遺傳修正的細胞進行選擇和培養(yǎng)；、處理過的細胞用融合或移植的方法轉入患者體內(nèi)22LogoCompanyLogo基因治療的方式exvivo載體將目的基因直接輸入體內(nèi)目的基因invivo將目的基因?qū)牖颊甙屑毎?體外培養(yǎng)將重組靶細胞回輸體內(nèi)靶細胞23Logo基因治療的方式基因治療的關鍵步驟：1、目的基因的選擇2、靶細胞的選擇3、選擇安全而有效的方法和載體系統(tǒng)，使外源基因順利地導入靶細胞，并有效表達從而達到治療目的。24Logo基因治療的方式目的基因的選擇是根據(jù)不同的疾病、不同的治療方式而定的25Logo基因治療的方式靶細胞的選擇需考慮：1、最好為組織特異性細胞2、細胞易獲得，具有增殖優(yōu)勢，生命周期長3、離體細胞較易受外源基因轉化4、細胞堅固，能耐受處理，回植到體內(nèi)易成活26Logo基因治療的方式常用的靶細胞有：造血細胞、上皮細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、血管內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、腫瘤細胞等。27LogoCompanyLogo基因治療的方式目的基因的轉移方式：1.直接注射法2.磷酸鈣沉淀法3.顯微注射法4.脂質(zhì)體介導法5.受體介導的基因轉移6.逆轉錄病毒載體介導的基因轉移28Logo直接注射法將目的基因直接注射到體內(nèi)的某些部位(如肌肉)，鄰近細胞攝人DNA并表達。這種方法非常簡單，但效率低。29LogoCompanyLogo磷酸鈣沉淀法將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，即有磷酸鈣微沉淀形成，體外培養(yǎng)的細胞可將沉淀吞入細胞內(nèi)，從而將目的基因?qū)爰毎麅?nèi)。這種方法優(yōu)點在于簡單和通用性，但轉化效率通常很低。30LogoCompanyLogo顯微注射法在顯微鏡下，直接將DNA由細胞玻璃針注人細胞核內(nèi)，可避免DNA的降解，但要求有熟練的操作技巧。31Logo脂質(zhì)體介導法將目的基因包裹到脂質(zhì)體內(nèi)，通過靜脈注人體內(nèi)，脂質(zhì)體與細胞膜融合而使目的基因進人細胞內(nèi)。脂質(zhì)體介導的基因轉移能在活體內(nèi)應用，較為簡單，轉移效率較低，轉移的目的基因不與染色體整合，只能短時間表達。32Logo

受體介導的基因轉移將含有目的基因的重組質(zhì)粒DNA共價連接到能與某種細胞受體結合的配體上，再將這種復合物注人體內(nèi)，配體與細胞受體特異性結合，發(fā)生正常的人胞作用，目的基因從而進人細胞內(nèi)。這種方式轉人的目的基因也不與染色體整合，只能短時間表達。33Logo逆轉錄病毒載體介導的基因轉移帶有外源性基因的重組病毒在感染細胞時.可將外源性基因序列導人細胞內(nèi)。目前主要使用的病毒載體有逆轉錄病毒和腺病毒。逆轉錄病毒可將遺傳物質(zhì)整合到宿主細胞基因組內(nèi)，因而很合適作基因治療載體。將野生的逆轉錄病毒進行重組，除去編碼病毒自身蛋白的序列，插人目的基因。34Logo基因治療的問題安全性問題

1999年首例基因治療失敗事件只限于體細胞，提倡間接體內(nèi)法、主要用于單基因遺傳病治療、療效顯著并經(jīng)過動物實驗驗證等。社會倫理問題禁止用于生殖細胞防止不當應用（如體育上）35Logo目前，基因治療領域存在的主要問題是有效性和安全性。事實上，自1995年以來，全世界基因治療領域的科學家們在改善基因?qū)胂到y(tǒng)和載體方面作了大量的努力，新思路、新技術和