Illumina平臺測序原理及常見測序文庫構建

Illumina

平臺測序原理及常見幾種測序文庫構建流程簡介現(xiàn)在是1頁\一共有63頁\編輯于星期一目錄現(xiàn)在是2頁\一共有63頁\編輯于星期一第一部分：測序測序原理與流程簡介現(xiàn)在是3頁\一共有63頁\編輯于星期一文庫構建(~

6

hrs)cBotHiSeq2500MiSeqHiSeq2000HiSeq2500GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace1-8

samples1-8

samplesDNA現(xiàn)在是4頁\一共有63頁\編輯于星期一Illumina

測序流程文庫構建(~

6

hrs)cBotHiSeq25001-8

samples MiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8

samples GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpaceDNA現(xiàn)在是5頁\一共有63頁\編輯于星期一文庫構建流程片段化

DNA末端補平3’加A接頭連接PCR現(xiàn)在是6頁\一共有63頁\編輯于星期一高質(zhì)量DNA文庫結構文庫構建的目的是在目的DNA片段兩端都連接上想要的接頭此單鏈部分與FlowCell表面上P7接頭相同此單鏈部分與FlowCell表面上P5接頭相同Index

SequencingPrimer現(xiàn)在是7頁\一共有63頁\編輯于星期一文庫構建(~

6

hrs)cBotHiSeq2500MiSeq1-8

samplesHiSeq2000HiSeq25001-8

samples GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace現(xiàn)在是8頁\一共有63頁\編輯于星期一測序芯片

(Flow

Cell)簡介flow

cell是有2個或8個泳道(Lane)的玻璃片，與一元硬幣的厚度相當每個泳道(Lane)內(nèi)的上下兩個表面隨機的布滿了能夠與文庫兩端接頭分別互補配對的寡核苷酸(oligos,P7和P5接頭)在flow

cell上進行cluster簇生成現(xiàn)在是9頁\一共有63頁\編輯于星期一儀器簡介單條DNA模板約1000條DNA模板的拷貝cBotHiSeqSequenncceerr35個循環(huán)的橋式PCR現(xiàn)在是10頁\一共有63頁\編輯于星期一cBot

工作流程DNA文庫變性：使用NaOH將雙鏈DNA文庫變性為單鏈模板鏈雜交： 將單鏈DNA模板雜交到Flow

Cell

上第一鏈合成： 以Flow

Cell

表面上的oligos為引物，合成第一鏈橋式PCR：沖走單鏈DNA模板，以合成的第一鏈為模板進行35循環(huán)的橋式PCR線性化：將與P5接頭連接的DNA鏈從Flow

Cell

上去除阻斷3’–OH：防止在后續(xù)測序過程中繼續(xù)延伸DNA鏈雜交測序引物現(xiàn)在是11頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA模板雜交和一鏈合成接頭序列5’-3’

延伸含有P7和P5兩種接頭的FlowCell表面單鏈DNA分子與FlowCell表面的對應接頭雜交以雜交的單鏈DNA為模板，F(xiàn)lowCell上的接頭為引物，合成第一鏈現(xiàn)在是12頁\一共有63頁\編輯于星期一新合成的鏈原始模板鏈雙鏈DNA變性丟棄原始模板鏈模板鏈被沖洗走新合成的鏈留在FlowCell上現(xiàn)在是13頁\一共有63頁\編輯于星期一橋式PCR擴增單鏈DNA與FlowCell表面對應接頭雜交，形成“橋”以接頭為引物進行擴增現(xiàn)在是14頁\一共有63頁\編輯于星期一橋式PCR擴增現(xiàn)在是15頁\一共有63頁\編輯于星期一變性變性雙鏈的“橋”得到與FlowCell相連的兩條互補的單鏈DNA分子現(xiàn)在是16頁\一共有63頁\編輯于星期一第二輪橋式PCR擴增現(xiàn)在是17頁\一共有63頁\編輯于星期一完成橋式PCR擴增完成28循環(huán)的橋式PCR現(xiàn)在是18頁\一共有63頁\編輯于星期一線性化雙鏈“橋”變性為單鏈紅色箭頭為P5接頭上的切割位點現(xiàn)在是19頁\一共有63頁\編輯于星期一線性化切割并沖走與P5接頭相連的那條DNA鏈現(xiàn)在是20頁\一共有63頁\編輯于星期一阻斷阻斷3’

–OH現(xiàn)在是21頁\一共有63頁\編輯于星期一雜交Read

1

引物Read1

測序引物將測序引物雜交到文庫的接頭上現(xiàn)在是22頁\一共有63頁\編輯于星期一Illumina

測序流程HiSeq2000HiSeq2500GA

IIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文庫構建(~

6hrs)cBotHiSeq25001-8

samples MiSeq1-8

samples現(xiàn)在是23頁\一共有63頁\編輯于星期一進行Read1

測序雜交Index

測序引物，進行Index

測序Paired

End

Turnround，合成Read1互補鏈雜交Read

2

測序引物，進行Read

2

測序HiSeq

SBS

測序流程現(xiàn)在是24頁\一共有63頁\編輯于星期一HiSeq

SBS

測序流程123PairedEndTurnaround現(xiàn)在是25頁\一共有63頁\編輯于星期一Sequencing

By

Synthesis，SBS測序原理4種

Fl-NTP’s

+聚合酶拍照，收集信號去阻斷，切除熒光基團X36-

151現(xiàn)在是26頁\一共有63頁\編輯于星期一可逆終止化學反應一次加入4種修飾的dNTP(可逆終止子)準確度高可以得到同聚物序列合成照相，收集信號去阻斷，切除熒光基團下一個堿基合成現(xiàn)在是27頁\一共有63頁\編輯于星期一100

MicronsClusters現(xiàn)在是28頁\一共有63頁\編輯于星期一已完成測序合成的片段Blocked3’-ends變性掉已完成測序合成的片段恢復被阻斷的3’

–OHPairedEnd

Turnround現(xiàn)在是29頁\一共有63頁\編輯于星期一形成的

橋5’-3’延伸橋式PCR5’-3’延伸PairedEnd

Turnround現(xiàn)在是30頁\一共有63頁\編輯于星期一形成的雙鏈的橋PairedEnd

Turnround現(xiàn)在是31頁\一共有63頁\編輯于星期一模板鏈PairedEnd

Turnround等溫變性，完成15輪橋式PCR后，進行線性化，將模板鏈切除，保留新合成的子鏈現(xiàn)在是32頁\一共有63頁\編輯于星期一新合成的鏈3’

-OH阻斷Read2測序引物PairedEnd

Turnround線性化，3’

-OH阻斷雜交Read2測序引物現(xiàn)在是33頁\一共有63頁\編輯于星期一SequencingBySynthesis2nd

ReadX36-

1514種

Fl-NTP’s

+

聚合酶拍照，收集信號去阻斷，切除熒光基團現(xiàn)在是34頁\一共有63頁\編輯于星期一Illumina

測序流程HCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文庫構建(~

6hrs)cBotHiSeq25001-8

samples MiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8

samples GA

IIxMiSeq現(xiàn)在是35頁\一共有63頁\編輯于星期一第二部分：常見文庫構建流程簡介現(xiàn)在是36頁\一共有63頁\編輯于星期一文庫分類DNA類文庫DNA小片段文庫DNA大片段文庫Exon文庫PCR-Free文庫簡化基因組文庫、單細胞樣本文庫等RNA類文庫轉(zhuǎn)錄組文庫表達譜（RNA-Seq）SmallRNA現(xiàn)在是37頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA小片段文庫DNA小片段文庫片段大小在1Kb以下的普通DNA文庫（200bp,350bp,500bp…）DNA小片段文庫可用來進行人重測序，動植物、微生物的denovo和重測序，16s

rRNA測序，宏基因組測序等項目類型的文庫構建?，F(xiàn)在是38頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA小片段建庫流程現(xiàn)在是39頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA小片段建庫流程現(xiàn)在是40頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA小片段建庫流程現(xiàn)在是41頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA小片段建庫流程現(xiàn)在是42頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA大片段文庫DNA大片段文庫，又名末端配對（mate-paired）文庫片段長度大于1Kbp。主要用于動植物，微生物的denovo測序現(xiàn)在是43頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA大片段文庫建庫流程現(xiàn)在是44頁\一共有63頁\編輯于星期一DNA大片段文庫建庫流程現(xiàn)在是45頁\一共有63頁\編輯于星期一為什么要建大片段文庫現(xiàn)在是46頁\一共有63頁\編輯于星期一Exon文庫人類外顯子組總共約30Mb，占全部人類基因組約1%。外顯子具有高度的保守型，且大部分疾病的致病位點位于外顯子區(qū)。外顯子測序是指利用序列捕獲技術將外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進行高通量測序的基因組分析方法。Exon文庫主要用于人全外顯子測序和目標區(qū)域測序現(xiàn)在是47頁\一共有63頁\編輯于星期一Exon文庫流程現(xiàn)在是48頁\一共有63頁\編輯于星期一外顯子捕獲方式液相雜交液相雜交是通過在溶液中，利用鏈堿基配對的原理，將DNA片段與探針雜交，然后洗脫，富集目的片段。現(xiàn)在是49頁\一共有63頁\編輯于星期一Exon測序特點優(yōu)點：1、

與全基因組測序相比，外顯子測序具有測序覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準確性更高、花費成本更低等優(yōu)勢，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢。不足：1、與全基因組測序相比，不能檢測到基因組內(nèi)較大的結構性變異。2、與轉(zhuǎn)錄組測序相比，不能檢測到新的基因?，F(xiàn)在是50頁\一共有63頁\編輯于星期一PCR-Free文庫PCR-Free文庫，顧名思義，就是在文庫構建過程中不需要進行PCR的文庫。主要是針對一些特殊樣本，比如GC含量高，PCR擴增困難的樣本；PCR產(chǎn)物。不足：所需的樣本起始量較多?，F(xiàn)在是51頁\一共有63頁\編輯于星期一PCR-Free文庫與普通文庫比較現(xiàn)在是52頁\一共有63頁\編輯于星期一簡化基因組(RAD-seq

)文庫RAD-seq

即基于酶切的簡化基因組測序技術，是指利用限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，結合一定大小的插入片段文庫，對其進行高通量測序，快速鑒定高準確性的變異標記（SNPs）信息的技術與傳統(tǒng)技術相比，該類技術操作簡單、不受參考基因組限制、可簡化復雜基因組；另外，基于SNPs

的分子標記技術性價比高，穩(wěn)定性好，在基因組中分布更加廣泛，特別是適合大樣本量的分析。現(xiàn)在是53頁\一共有63頁\編輯于星期一簡化基因組文庫建庫流程現(xiàn)在是54頁\一共有63頁\編輯于星期一轉(zhuǎn)錄組文庫真核生物原核生物總RNA利用Oligo

(dT)富集mRNA去除

rRNA隨機引物六聚體反轉(zhuǎn)錄合成cDNA末端修復，加A，加接頭后PCR擴增Illumina

測序?qū)RNA

隨機打斷成~200

nt轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA。應用：轉(zhuǎn)錄本的種類和基因定量基因的轉(zhuǎn)錄結構可變剪切發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本現(xiàn)在是55頁\一共有63頁\編輯于星期一鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建庫使用ssRNA-seq可以確定轉(zhuǎn)錄本是來自正鏈還是負鏈。以便更加準確的獲得基因的結構以及基因表達信息，并且發(fā)現(xiàn)新的基因。很多基因組區(qū)域具有正負鏈的轉(zhuǎn)錄本，反義轉(zhuǎn)錄是真核基因的一個特征，是一種重要的調(diào)控方式?，F(xiàn)在是56頁\一共有63頁\編輯于星期一常規(guī)轉(zhuǎn)錄組建庫方法基礎上，在合成第二條cDNA鏈時，替換dTTP為dUTP，加上接頭后降解含dU的DNA單鏈。鏈特異性轉(zhuǎn)錄組建庫現(xiàn)在是57頁\一共有63頁\編輯于星期一均一化（DSN）建庫方法：構建常規(guī)轉(zhuǎn)錄組文庫，庫檢合格后取80-100ng文庫進行DSN處理，然后PCR再次出庫。目的：減低高豐度表達基因，有效富集低豐度表達基因。DSN酶：雙鏈特異性核酸酶(Duplex-Specific

Nuclease,

DSN)，能夠選擇性降解雙鏈DNA和DNA-RNA雜交體中的DNA,由于高豐度的基因形成雙鏈的