實(shí)驗(yàn)苯甲醇苯甲酸水揚(yáng)酸酸測(cè)定

實(shí)驗(yàn)課件苯甲醇苯甲酸水揚(yáng)酸酸測(cè)定2023/4/20第1頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握毛細(xì)管電泳的基本概念；2、通過實(shí)驗(yàn)熟悉毛細(xì)管電泳儀的基本原理和操作；3、了解影響毛細(xì)管電泳分離的主要操作參數(shù)。2023/4/20第2頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六二、基本概念：電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。

利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。高效毛細(xì)管電泳:(

CE,capillaryelectrophoresis)，以毛細(xì)管為分離通道（用75um內(nèi)徑石英毛細(xì)管），以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以樣品的多種特性為分離依據(jù)的分析技術(shù)?！咝?xì)管電泳。2023/4/20第3頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電滲流現(xiàn)象電滲流：毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)，來源于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用

電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡(jiǎn)稱EOF）。

電滲現(xiàn)象:當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象.2023/4/20第4頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小:

用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即

ν電滲流=μE淌度：取決于帶電離子在單位電場(chǎng)下的遷移速度；是特征常數(shù)淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。2023/4/20第5頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六電滲流的作用：

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；（1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；在HPCE中，控制電滲流非常重要。電滲流的方向:

取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；2023/4/20第6頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六分離過程

電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。

帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反。ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出。在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。（動(dòng)畫）2023/4/20第7頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)基本原理1.遷移時(shí)間（保留時(shí)間）

HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長(zhǎng)度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在HPCE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。2023/4/20第8頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：2023/4/20第9頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大；柱徑小，柱長(zhǎng)增加。高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。一、采用了75um內(nèi)徑的毛細(xì)管；二、采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。2023/4/20第10頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六高效毛細(xì)管電泳法的特點(diǎn)1.儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化

電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2.分析速度快、分離效率高

在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽(yáng)離子；3.操作方便、消耗少

進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等；

2023/4/20第11頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、儀器結(jié)構(gòu)及主要部件紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；（可檢測(cè)到：10-19～10-21

mol/L）1.高壓電源2.毛細(xì)管柱3.緩沖液池4.檢測(cè)器2023/4/20第12頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；2.毛細(xì)管柱（1）材料：石英（分離柱不涂敷任何固定液）各項(xiàng)性能好；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長(zhǎng)度≈1m2023/4/20第13頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測(cè)器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)；檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測(cè)限/mol

特點(diǎn)紫外

10-13～10-15

光譜信息熒光10-15～10-17

靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20

靈敏度極高，樣品需衍生2023/4/20第14頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.離子分析analysisofion2.藥物分析analysisofpharmaceutics3.氨基酸分析analysisofaminoacids4.核酸分析及DNA測(cè)序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA5.新進(jìn)展及熱點(diǎn)問題advancesandspecialtopics高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用與進(jìn)展2023/4/20第15頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六1.離子分析2023/4/20第16頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六2.藥物分析

檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物；2023/4/20第17頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3.

氨基酸與蛋白質(zhì)分析可分離23種丹?；被幔籋PCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀；問題：吸附和檢測(cè)；蛋白質(zhì)分析2023/4/20第18頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六4.

核酸分析及DNA排序

2023/4/20第19頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六五、操作步驟1.打開計(jì)算機(jī)和主機(jī)，預(yù)熱30min。2.雙擊32Karat7.0工作界面，選擇進(jìn)入U(xiǎn)V檢測(cè)項(xiàng)。3.切換至工具欄里的DirectControl選項(xiàng)，按下Load，并將樣品按照匹配程序的位置放置。（注意：①毛細(xì)管對(duì)準(zhǔn)樣品管口②向瓶中裝樣時(shí)，樣品不應(yīng)過滿，也不能沾濕瓶頸。）4.在工具欄里選擇TimeProgram

選項(xiàng)，對(duì)以下將要進(jìn)行的步驟進(jìn)行編寫。2023/4/20第20頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六5.按下工具欄里的藍(lán)色箭頭（SingleRun），運(yùn)行儀器。注意：運(yùn)行時(shí)不能打開蓋子6.依次檢測(cè)標(biāo)樣和未知樣，并在工具欄里的Reports里的View(Area%)查看實(shí)驗(yàn)結(jié)果。7.結(jié)束測(cè)量時(shí)，用緩沖液清洗10~15min，按下Home鍵。8.關(guān)閉主機(jī)和計(jì)算機(jī)電源。2023/4/20第21頁(yè)，共22頁(yè)，2023年，2月20日，星期六NOTime(min)EventValueDurationLnlet(vial)Outlet(vial)Summary1

Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B1B0:B1forward2

Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B2B0:B1forward3

Rinse-Pressure20.0psi5.00minBl:B3B0:B1forward4

Lnject-Pressure0.5psi5.0secSl:A1B0:A1Override,forward50:00Separate-Voltage25.0KV8minBl:A1