雙水相萃取法

雙水相萃取法第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五基因工程產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需經(jīng)細(xì)胞破碎后才能提取、純化，細(xì)胞顆粒尺寸的變化給固-液分離帶來了困難，同時這類產(chǎn)品的活性和功能對pH值、溫度和離子強(qiáng)度等環(huán)境因素特別敏感。由于它們在有機(jī)溶劑中的溶解度低并且會變性，因此傳統(tǒng)的溶劑萃取法并不適合。采用在有機(jī)相中添加表面活性劑產(chǎn)生反膠束的辦法可克服這些問題，但同樣存在相的分離問題。因此基因工程產(chǎn)品的商業(yè)化迫切需要開發(fā)適合大規(guī)模生產(chǎn)的、經(jīng)濟(jì)簡便的、快速高效的分離純化技術(shù)。第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五其中雙水相萃取技術(shù)(two-aqueousphaseextraction,ATPS)，又稱水溶液兩相分配技術(shù)(Partionoftwoaqueousphaseextraction)是近年來出現(xiàn)的引人注目、極有前途的新型分離技術(shù)。雙水相萃取法的特點(diǎn)是能夠保留產(chǎn)物的活性，整個操作可以連續(xù)化，在除去細(xì)胞或細(xì)胞碎片時，還可以純化蛋白質(zhì)2～5倍，與傳統(tǒng)的過濾法和離心法去除細(xì)胞碎片相比，無論在收率上還是成本上都要優(yōu)越得多。第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相萃取法和傳統(tǒng)的分離方法(如鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等)相比也有很大的優(yōu)勢，如以β-半乳糖苷酶為例，用沉淀或雙水相萃取純化的比較見下表。除此以外，處理量相同時，雙水相萃取法比傳統(tǒng)的分離方法,設(shè)備需用量要少3～10倍，因此已被廣泛地應(yīng)用在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工領(lǐng)域，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)、核酸和病毒等產(chǎn)品的分離純化和分析等。用此法來提純的酶已達(dá)數(shù)十種，其分離過程也達(dá)到相當(dāng)規(guī)模，如乙醇脫氫酶的分離已達(dá)到幾十千克濕細(xì)胞規(guī)模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中試規(guī)模等。第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五聚合物的不相溶性(incompatibility)：當(dāng)兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時，由于相對分子質(zhì)量較大，分子間的相互排斥作用與混合過程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱為聚合物的不相容性?？尚纬呻p水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,

PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無機(jī)鹽的混合溶液也可形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀(KPi)、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產(chǎn)物的雙水相萃取。PEG/無機(jī)鹽系統(tǒng)的上相富含PEG，下相富含無機(jī)鹽。1雙水相系統(tǒng)第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五均相區(qū)圖a和b分別為PEG/Dx和PEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點(diǎn)第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五在系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同，但均分成組成相同而體積不同的兩相。兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則，即

系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度，系線越長，兩相間的性質(zhì)差別越大，反之則越小。當(dāng)系線長度趨向于零時，即在圖b的雙節(jié)線上K點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1，因此K點(diǎn)稱為臨界點(diǎn)(criticalpoint)。

上下相組成分別為T和B,第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五2.雙水相中的分配平衡

與溶劑萃取相同，溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用m=c2/c1表示。為簡便起見，用c1和c2分別表示平衡狀態(tài)下下相和上相中溶質(zhì)的總濃度。有關(guān)雙水相系統(tǒng)中溶質(zhì)分配平衡的理論已有很多研究報(bào)導(dǎo)。但是，由于影響雙水相系統(tǒng)中溶質(zhì)分配平衡的因素非常復(fù)雜，很難建立完整的熱力學(xué)理論體系。從雙水相萃取過程設(shè)計(jì)的角度出發(fā)，確定影響分配系數(shù)的主要因素是非常重要的。第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五已有的大量研究表明，生物分子的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)與雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用等。因此，分配系數(shù)是各種相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分別為靜電作用、疏水作用和生物親和作用對溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻(xiàn)。第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五1．靜電作用非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)不受靜電作用的影響，利用相平衡熱力學(xué)理論可推導(dǎo)下述分配系數(shù)表達(dá)式：lnm=-Mλ/RTm-分配系數(shù)；M-溶質(zhì)的相對分子質(zhì)量；λ-與溶質(zhì)表面性質(zhì)和成相系統(tǒng)有關(guān)的常數(shù);R-氣體常數(shù)，J/(mo1．K)；T-絕對溫度，K。因此，溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與相對分子質(zhì)量之間呈線性關(guān)系，在同一個雙水相系統(tǒng)中，若λ>0，不同溶質(zhì)的分配系數(shù)隨相對分子質(zhì)量的增大而減小。同一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變，這是因?yàn)槭街械摩穗S雙水相系統(tǒng)而異。第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)際的雙水相系統(tǒng)中通常含有緩沖液和無機(jī)鹽等電解質(zhì)，當(dāng)這些離子在兩相中分配濃度不同時(即分配系數(shù)≠1)，將在兩相間產(chǎn)生電位差，此時，荷電溶質(zhì)的分配平衡將受相間電位的影響，從相平衡熱力學(xué)理論推導(dǎo)溶質(zhì)的分配系數(shù)表達(dá)式為lnm=lnmo+ΔφFZ/RT

因此，荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比,由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的相間電位不同，故分配系數(shù)與凈電荷數(shù)的關(guān)系因無機(jī)鹽而異.電位差，總電荷氣體常數(shù)第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五2．疏水作用一般蛋白質(zhì)表面均存在疏水區(qū)，疏水區(qū)占總表面積的比例越大，疏水性越強(qiáng)。所以，不同蛋白質(zhì)具有不同的相對疏水性。在pH為等電點(diǎn)的雙水相中，蛋白質(zhì)主要根據(jù)表面疏水性的差異產(chǎn)生各自的分配平衡。同時，疏水性一定的蛋白質(zhì)的分配系數(shù)受雙水相系統(tǒng)疏水性的影響。因此，有必要確定雙水相系統(tǒng)的疏水性尺度，以便在萃取操作時調(diào)整和設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。PEG/Dx和PEG/無機(jī)鹽等雙水相系統(tǒng)的上相(PEG相)疏水性較大，相間的疏水性差用疏水性因子HF(hydrophobicfactor)表示。HF可通過測定疏水性已知的氨基酸在其等電點(diǎn)處的分配系數(shù)maa測算第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五lnmaa=HF(RH+B)其中，RH為氨基酸的相對疏水性(relativehydrophobicity)，是通過測定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差別確定的，并設(shè)疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。B=lnmGly/HF所以，pH＝pI時氨基酸在雙水相系統(tǒng)中的分配系數(shù)與其RH值呈線性關(guān)系，直線的斜率就是該雙水相系統(tǒng)的HF值。第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五利用前式可確定不同雙水相系統(tǒng)的HF值。如果在pH為等電點(diǎn)的雙水相中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(m0)與HF值之間呈線性關(guān)系，則直線的斜率定義為該蛋白質(zhì)的表面疏水性，用HFS(hydrophobicfactorofsolutes)表示lnm0=HF×HFS一般形式lnm=HF(HFS+ΔHFS)+ΔφFZ/RT

該式較全面地描述了雙水相系統(tǒng)的疏水性和相間電位、蛋白質(zhì)的疏水性和凈電荷數(shù)對分配系數(shù)的影響，同時也間接地通過鹽對蛋白質(zhì)表面疏水性和相間電位的影響表現(xiàn)了鹽對蛋白質(zhì)分配系數(shù)的作用。第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五3.影響物質(zhì)分配平衡的因素

影響物質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中分配的因素主要有雙水相系統(tǒng)的聚合物組成(包括聚合物類型、平均分子量)，鹽類(包括離子的類型和濃度、離子強(qiáng)度、pH值)，溶質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)(包括分子量、等電點(diǎn))以及體系的溫度等。然而，這些參數(shù)并不是獨(dú)立地起作用。所以要預(yù)測溶質(zhì)在雙水相系統(tǒng)間的分配系數(shù)是困難的。這些系統(tǒng)復(fù)雜性表現(xiàn)在如下的一些例子中：在一相中引入疏水性基團(tuán)會影響離子的分配和電位，在大分子(親水聚合物或蛋白質(zhì)溶質(zhì))結(jié)構(gòu)中構(gòu)象的變化，能使另一些原子暴露在微環(huán)境中。這些事實(shí)導(dǎo)致只能用實(shí)驗(yàn)的方法來確定滿足分配要求的操作條件。

第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五3.1雙水相中聚合物組成的影響雙水相系統(tǒng)作為一種成功的萃取方法，很大程度上取決于使用的聚合物類型，當(dāng)兩種不同聚合物的溶液混合時，可能存在三種情況：a完全混溶性(勻相溶液)；b物理的不相溶性(相分離)；c復(fù)雜的凝聚(相分離,聚合物聚集在同一相中，純?nèi)軇?水聚集在另一相中)。離子和非離子聚合物都可以使用在雙水相系統(tǒng)的構(gòu)成上，但是，當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時，它們互相吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五3.2雙水相系統(tǒng)物理化學(xué)性質(zhì)的影響雙水相系統(tǒng)的性質(zhì)主要取決于下列物理化學(xué)參數(shù)：密度(ρ)和兩相間的密度差，黏度(μ)和兩相間的黏度差以及表面張力(σ)。第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五系線長度代表了系統(tǒng)達(dá)到平衡時上、下相和總組成的關(guān)系，在臨界點(diǎn)附近系線的長度趨向于零，上相和下相的組成相同，因此,分配系數(shù)應(yīng)該是1。隨著聚合物和成相鹽濃度增大，系線的長度增加,上相和下相相對組成的差別就增大，產(chǎn)物如酶在兩相中的界面張力差別也增大，這將會極大地影響分配系數(shù)，使酶富集于上相。第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五3.3鹽和緩沖液的影響

鹽的種類和濃度對分配系數(shù)的影響主要反映在對相間電位和蛋白質(zhì)疏水性的影響。在雙聚合物系統(tǒng)中，無機(jī)離子具有各自的分配系數(shù)，不同電解質(zhì)的正負(fù)離子的分配系數(shù)不同，當(dāng)雙水相系統(tǒng)中含有這些電解質(zhì)時，由于兩相均應(yīng)各自保持電中性，從而產(chǎn)生不同的相間電位，因此，鹽的種類(離子組成)影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分配系數(shù)，鹽濃度不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成和相體積比。例如，PEG/KPi系統(tǒng)中上、下相(或稱輕重相)的PEG和磷酸鉀濃度以及Cl離子在上、下相中的分配平衡，隨添加NaCl濃度的增大而改變。這種相組成即相性質(zhì)的改變直接影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。離子強(qiáng)度對不同蛋白質(zhì)的影響程度不同，利用這一特點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)雙水相系統(tǒng)中的鹽濃度，可有效地萃取分離不同的蛋白質(zhì)。在不同的雙水相體系中鹽的作用也不相同。在PEG/磷酸鹽/水中加入氯化鈉可以使萬古霉素的分配系數(shù)由4提高到120,而在PEG/DEX/水體系中只從1.55提高到5。第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五3.4

溫度的影響溫度影響雙水相系統(tǒng)的相圖，因而影響蛋白質(zhì)的分配系數(shù)。但一般來說，當(dāng)雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠(yuǎn)時，溫度的影響很小，1-2度的溫度改變不影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進(jìn)行，不需冷卻。這是基于以下原因：(1)成相聚合物PEG對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，常溫下蛋白質(zhì)一般不會發(fā)生失活或變性；(2)常溫下溶液粘度較低，容易相分離；(3)常溫操作節(jié)省冷卻費(fèi)用。第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五在生物分子回收和純化以后，怎樣從含有目標(biāo)產(chǎn)物殘余物的水溶液中回收聚合物或鹽就成為一個重要的問題。例如從1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和533kgK3PO4，若不回收利用，化學(xué)品的消耗會使生產(chǎn)成本大幅度上升。如果產(chǎn)品是蛋白質(zhì)，并且分配在鹽相，則鹽可以在錯流過程操作方法下，用超濾或滲析膜過濾回收。如果蛋白質(zhì)積聚在聚乙二酵中，可以通過加入鹽來精制，加入的鹽導(dǎo)致蛋白質(zhì)在鹽相中重新分配。PEG的分離同樣可以用膜分離來實(shí)現(xiàn)，即用選擇性孔徑大小的半透膜來截留蛋白質(zhì)，同時排除PEG進(jìn)行回收。另一種力法是通過鹽析或使用水-可混溶性的溶劑來沉淀蛋白質(zhì)，但是固體(產(chǎn)物)的去除被存在的PEG阻礙。也可使用離子交換和吸附，它們是通過蛋白質(zhì)與基質(zhì)的選擇性相互作用進(jìn)行的。然而，當(dāng)黏性聚合物溶液通過柱被處理的時候，會出現(xiàn)高的壓力降。在上述的三種方法中，膜分離是分離和濃縮被純化的蛋白質(zhì)并同步去除聚合物的最佳方法。第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五親和雙水相技術(shù)親和雙水相技術(shù)是指在成相高聚物上偶聯(lián)親和性配基,以提高溶質(zhì)的分配系數(shù)。這種技術(shù)已經(jīng)廣泛地運(yùn)用到蛋白質(zhì)等生物大分子的分離純化工藝中。萬古霉素可以和二肽N-乙酰-D-Ala-D-Ala形成復(fù)合物,當(dāng)二肽作為配基與活性MPEG共價(jià)結(jié)合后,加入到PEG/DEX系統(tǒng)中,不僅大大提高了系統(tǒng)的選擇性,而且分配系數(shù)提高了7倍。丙氨酸

第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五4.

雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用雙水相萃取自發(fā)現(xiàn)以來，無論在理論上還是實(shí)踐上都有很大的發(fā)展。在最近幾年中更為突出,在若干生物工藝過程中得到了應(yīng)用，其中最重要的領(lǐng)域是蛋白質(zhì)的分離和純化，其應(yīng)用舉例如表所示。第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五現(xiàn)舉例介紹具體的分離、純化方法。

A酶的提取和純化雙水相的應(yīng)用始于酶的提取。由于PEG/精Dextran體系太貴，而粗Dextran粘度又太大,故目前研究相應(yīng)用較多的是PEG/鹽體系。下表中列出一些應(yīng)用的實(shí)例。第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五在這些體系中，酶主要分配在上相，菌體在下相或界面上。料液中濕細(xì)胞含量可高達(dá)30%，酶的提取率達(dá)90%以上。如果條件選擇合適，不僅可從發(fā)酵液提取酶，實(shí)現(xiàn)它與茵體的分離。而且還可將各種酶互相分離，

B核酸的分離及純化用PEG/Dextran體系萃取核酸時，鹽組成的微小變化將會引起分配系數(shù)的急劇變動。

C人生長激素的提取用PEG40006.6％／磷酸鹽14％體系從E.coli碎片中提取人生長激素(hGH)，當(dāng)pH值＝7及菌體含量為35％(w／v)干細(xì)胞，混合5-10秒鐘后，即可達(dá)到萃取平衡．hGH分配在上相，其分配系數(shù)高達(dá)6.4，相比為0.2，收率大于60％，對蛋白的純化系數(shù)為7.8。如若進(jìn)行三級錯流萃取，總收率可達(dá)81％，純化系數(shù)為3.5。第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五

Dβ干擾素(β-IEN)的提取雙水相萃取持別適用于β干擾素這些不穩(wěn)定的、在超濾或沉淀時易失活的蛋白質(zhì)的提取和純化,β干擾素是合成纖維細(xì)胞或小鼠體內(nèi)細(xì)胞的分泌物。培養(yǎng)基中總蛋白濃度為1g/L而它的濃度僅為0.1mg/L。用一般的PEG／Dextran體系，不能將β干擾素與主要雜蛋白分開，必須是具有帶電基團(tuán)或親和基團(tuán)的PEG衍生物如PEG—磷酸酯與鹽的系統(tǒng)才能使β干擾素分配在上相，雜蛋白完全分配在下相而得到分離。并且β干擾素的濃度越高，分配系數(shù)越大，純化系數(shù)甚至可高達(dá)350。這一技術(shù)已用于1×109單位的β干擾素的回收。收率達(dá)97%，干擾素的特異活性＞1×l06單位/mg蛋白。這一方法與層析技術(shù)相結(jié)合，組成雙水相萃取—層析純化聯(lián)合流程、已成功地用于工業(yè)生產(chǎn)。

第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五E病毒的分離純化當(dāng)病毒進(jìn)入雙水相體系后，在上相和下相間也會發(fā)生選擇性分配，表現(xiàn)出一定的分配系數(shù)。雙水相萃取技術(shù)的進(jìn)展從上可見雙水相萃取技術(shù)不但用于生物物質(zhì)的分離和純化，而且己成為一種新的分析測試手段。近年來還有了新的進(jìn)展，主要有兩個方向：廉價(jià)雙水相體系的開發(fā)在生化工程中得到應(yīng)用的兩種雙水相體系，即高聚物—高聚物和高聚物—鹽體系。這兩種體系比較見下表：

第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五從表可見，高聚物—高聚物體系對活性物質(zhì)變性作用小，界面吸附少，但價(jià)格高因而尋找廉價(jià)的高聚物：高聚物雙水相體系是雙水相萃取技術(shù)應(yīng)用的一個重要發(fā)展方向。第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五目前比較成功的是用變性淀粉PPT(hydroxypropydertvativeofStarch)代替昂貴的dextran。PPT—PEG體系已被用來從發(fā)酵液中分離過氧化氫酶、β—半乳糖苷酶等。PPT—PEG體系比PEG—鹽體系穩(wěn)定。和PEG—dextran體系相圖非常相似，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)蛋白質(zhì)溶解度大。蛋白質(zhì)在PPT濃度到l5％以前沒有沉淀，但在PEG濃度大于5％時，溶解度顯著地減小，在鹽溶液中的溶解度更小。

(2)粘度小。PPT的動力粘度只是粗dextran的1／2，因而可以大大改善傳質(zhì)效果。

(3)價(jià)格便宜。PPT價(jià)格為每千克幾十美元，而粗Dextran則要每千克幾百美元，所以PPT—PEG雙水相體系具有更廣泛的應(yīng)用前景。第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五液-液雙水相萃取分離α-淀粉酶α-淀粉酶是廣泛應(yīng)用的生物酶類，B.Subtilis細(xì)菌α-淀粉酶是研究和應(yīng)用較多的α-淀粉酶，其分子量為48000道爾頓，PI約為5，最適pH5.3-6.4，在pH4.8-8.5之間穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)研究了α-淀粉酶在聚乙二醇（PEG）/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)中的分配，PEG分子量、PEG濃度、pH、添加NaCl和酶濃度等因素對α-淀粉酶分配系數(shù)影響。第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五PEG：分子量為400，1000，4000和6000α-淀粉酶在PEG/磷酸鹽系統(tǒng)的分配系數(shù)系統(tǒng)K

PEG400（13.2%w/w）磷酸鹽（16.8%w/w）20.42PEG1000(11.5%w/w)磷酸鹽(13.4%w/w)17.62PEG4000(10%w/w)磷酸鹽(11.5%w/w)1.75PEG6000(7.5%w/w）磷酸鹽（10%w/w）0.35貴州啤酒廠

第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相萃取法在天然產(chǎn)物純化中的應(yīng)用傳統(tǒng)雙水相系統(tǒng)在中藥有效成分純化中的應(yīng)用中藥成分雙水相體系分離效率甘草酸聚乙二醇/硫酸銨92.2%

蘆丁聚乙二醇/吐溫/硫酸銨95.0%

銀杏黃酮聚乙二醇/磷酸鉀98.2%

水楊酸乙二醇/聚乙烯吡咯烷酮/硫酸銨102.10%

第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相萃取法應(yīng)用于從白蘿卜中提取過氧化物酶不同工藝制備過氧化物酶的各項(xiàng)指標(biāo)粗酶傳統(tǒng)鹽析法雙水相萃取法蛋白含量(mg)132.5732.4094.196比活(O.D./mg·min)0.07743.30831.173純化倍數(shù)559.5402.8總酶力10.2104.3130.8提取率/%0.06630.00120.0021第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相體系在金屬離子分離中的應(yīng)用第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五金屬離子間的雙水相體系液-液萃取分離是在高聚物/鹽/萃取劑中,通過控制一定的條件,使目的金屬離子被定量萃取到高聚物相,其它金屬離子不被萃取而留在下層水相,從而實(shí)現(xiàn)混合金屬離子之間的分離。第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相生物催化技術(shù)雙水相生物催化技術(shù)的基本原理是:利用兩種不同高聚物的水溶液或一種高聚物和一種無機(jī)鹽的水溶液,因其濃度不同而形成互不相溶的兩液相體系,調(diào)整濃度將反應(yīng)物和生物催化劑分配于下相,產(chǎn)物分配于上相,實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的耦合。該技術(shù)有利于消除產(chǎn)物抑制和解決催化劑回收問題,提高催化反應(yīng)的效率,簡化產(chǎn)物的分離工藝,降低投資和操作費(fèi)用。用青霉素G?；D(zhuǎn)移酶為催化劑,在以PEG400/硫酸鎂組成的雙水相體系中合成頭孢氨芐,酶反應(yīng)35h后仍然有80.16%的活力。產(chǎn)物的產(chǎn)率可以達(dá)到60%,而傳統(tǒng)反應(yīng)體系中產(chǎn)率只能達(dá)到21%。用水溶性高聚物EudragitS2100固定化糜蛋白在PEG/Dextran雙水相體系中催化酪蛋白水解,84%的產(chǎn)物分配到了dextran相,而酶可以通過體系pH值的降低(pH7.16～3.18)從PEG相中分離出來,然后再回調(diào)pH值即可重新溶解、重復(fù)使用。第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相萃取泰樂菌素泰樂菌素是禽畜專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,能預(yù)防和治療各種禽畜多發(fā)病癥,在國際上被廣泛用作飼料添加劑,在國內(nèi)需求量也很大。提取部分的成本占到總生產(chǎn)成本的70%左右。

14%PEG4000和20%Na2HPO4

構(gòu)成的雙水相對泰樂菌素進(jìn)行全發(fā)酵液萃取,小試收率52.14%,省去了過濾操作,只需調(diào)節(jié)一次pH,減少了泰樂菌素的失活,純度明顯提高。第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五雙水相萃取與其他技術(shù)聯(lián)用第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五選講內(nèi)容：反相膠束（膠團(tuán)）反相膠團(tuán)是表面活性劑分子溶于非極性溶劑中自發(fā)形成的聚集體,其中表面活性劑的極性頭朝內(nèi)而非極性頭朝外與有機(jī)溶劑接觸。膠團(tuán)內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池。反膠團(tuán)溶液是宏觀上透明均一的熱力學(xué)穩(wěn)定體系。第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五1，反膠團(tuán)的萃取原理蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠團(tuán)溶液是一協(xié)同過程。在有機(jī)溶劑相和水相兩宏觀相界面間的表面活性劑層,同鄰近的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸引而變形,接著兩界面形成含有蛋白質(zhì)的反膠團(tuán),然后擴(kuò)散到有機(jī)相中,從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。改變水相條件(如pH值、離子種類或離子強(qiáng)度),又可使蛋白質(zhì)從有機(jī)相中返回到水相中,實(shí)現(xiàn)反萃取過程。第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五p154第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五2.反膠團(tuán)的制備1）注入法：將蛋白質(zhì)水溶液直接注入到含有表面活性劑的有機(jī)溶劑中，攪拌，形成透明的溶液2）相轉(zhuǎn)移法：將蛋白質(zhì)水相與含表面活性劑的有機(jī)相接觸3）溶解法：將含反膠團(tuán)的有機(jī)相與蛋白質(zhì)固體粉末一起攪拌（非水溶性蛋白質(zhì)）第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五反膠團(tuán)萃取原理有機(jī)相、水相間的分配萃取第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五蛋白質(zhì)的溶解第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五（四）在分離工藝中的應(yīng)用2-乙基己基琥珀酸酯磺酸鈉

第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期五2，反相膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)成本低選擇性高操作方便