BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)易操作步驟corr-ZYH-

BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)易操作步驟一開1）先開凈化交流穩(wěn)壓電源，其次打開110V穩(wěn)輸出電源，再次打開流式胞儀，最后打開計(jì)算機(jī)。2）向拉開儲(chǔ)液箱抽屜，檢查鞘液筒、廢液筒水量，如需充填鞘液，先將減閥（紅色箭頭所示）方向調(diào)在VENT位（箭頭向），再加入超純水，保持水位在鞘液桶的3/4左，加好后擰緊桶蓋并將減壓閥方向調(diào)在RUN位置。二開軟、輯驗(yàn)件1）屏幕下點(diǎn)擊（第四個(gè)圖標(biāo)）啟動(dòng)軟件桌面會(huì)出現(xiàn)件，可點(diǎn)擊實(shí)驗(yàn)文件的左上角的放大鈕（綠色），將實(shí)驗(yàn)文件窗口放大。2）工具板點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。出現(xiàn)散點(diǎn)圖對(duì)話方框（當(dāng)所要編輯的圖窗口被選中時(shí)，會(huì)在其四角出現(xiàn)四個(gè)小黑塊）。3）出現(xiàn)的點(diǎn)圖對(duì)話方框中點(diǎn)擊PlotSource選擇AcquisitionandAnalysis(收取、分析)，確認(rèn)X和Y軸數(shù)設(shè)為FSC-H1024SSC-H10244）屏幕上Plots菜中選擇DotPlot功，可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，在出現(xiàn)的對(duì)話方框內(nèi)選擇X：FL1-H1024；如果是雙標(biāo)Y軸擇FL2-H1024(根據(jù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)樣品確定所選通道，本步驟選FL1/FL2來明，如果是單標(biāo)Y軸擇。點(diǎn)擊OK，F(xiàn)L1/FL2的點(diǎn)圖出現(xiàn)。完成可將重制圖移至原圖右方。說：點(diǎn)圖Dotplot）又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立

參數(shù)的相互關(guān)系。在圖中，橫坐標(biāo)X和縱坐標(biāo)Y參數(shù)分別設(shè)為FSC-H1024SSC-H1024雙熒光標(biāo)記時(shí)，第二圖XY參數(shù)分別設(shè)為、FL2-H1024，X軸為熒光強(qiáng)的相對(duì)值，單位是道數(shù)Y軸通常表示熒光或散射強(qiáng)度的相對(duì)值。儀器使用者可因?qū)嶒?yàn)需求來修改所有圖譜中顯示之參數(shù)。修改動(dòng)作為輕擊圖譜上X和Y軸數(shù)，并依需要選擇之FSC細(xì)大小，SSC：細(xì)胞折射率FL1：FITC綠熒光，F(xiàn)L2：PE橙熒光FL3：紅色熒光）。5）工具板選擇四象限工具，在FL1/FL2散圖上拖動(dòng)Quadrant的心將它設(shè)定在（x，y＝（101，10）處，這些象限將指定陰性陽(yáng)性區(qū)域。6）工具板點(diǎn)擊直方圖圖示，在實(shí)驗(yàn)文件的空白區(qū)點(diǎn)擊，拖曳對(duì)角線至適當(dāng)大小，然后放開鼠標(biāo)。單色熒光只需一個(gè)直方圖，和第二個(gè)散點(diǎn)圖一樣，橫坐標(biāo)選擇FL-1縱坐標(biāo)默認(rèn)為Counts；若是雙色熒光，需畫2直方圖，一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-1-1024，另一個(gè)橫坐標(biāo)選擇FL-2-1024；7）上面直圖中畫出M1，其中M1代表隱性數(shù)目（一般標(biāo)示是10陽(yáng)性數(shù)目（除M1以所有的部分）。

，M2代8）Stats菜中選擇QuadrantStats象限統(tǒng)計(jì)））步驟中的點(diǎn)圖將分為四個(gè)象限。三建儀和算之通從Acquire單中選擇快鍵Win+b)，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)AcquisitionControl對(duì)方框。四儀設(shè)文注：驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件不能在數(shù)據(jù)收取后再更改，研究人員必須在第一次就使用正確的儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（Instrumentsettings）含號(hào)器高壓Detector/Amps，閾值Threshold），熒光補(bǔ)償（Compensation）等儀器條件的組合。一般而言，儀器設(shè)定的序?yàn)镈etector/Amps--。

1）查現(xiàn)有器條件，從Cytometer單中選擇Detectors/Amps。出現(xiàn)Detectors/Amps窗。在Detectors/Amps窗確認(rèn)FSC與SSC（根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品確定，一般細(xì)胞選擇，細(xì)菌選擇）其它FL1-3LOG（對(duì)數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)2）Cytometer單中選擇Threshold，現(xiàn)Threshold窗在Threshold窗：確認(rèn)FSC為設(shè)閾參數(shù)，初步確認(rèn)預(yù)設(shè)閾值52將其拖至空白區(qū)。3）Cytometer菜中選擇，認(rèn)所有預(yù)設(shè)數(shù)值皆為零。將其拖至空白區(qū)。五上品設(shè)儀使儀器處于HighRUN，樣品管支撐架左，上陰性對(duì)照管樣品，支撐架回位。確認(rèn)AcquisitionControl窗中Setup需打叉或打勾即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，用于儀器設(shè)，點(diǎn)擊Acquire。1、節(jié)FSC/SSC探測(cè)（壓觀察FSC/SSC圖變化。壓(Voltage)預(yù)設(shè)為E00可調(diào)節(jié)AmpGain從1.009.99使要細(xì)胞群得以清楚顯示（細(xì)胞較大，將FSC電設(shè)置于E-1；較小細(xì)胞，將FSC電壓設(shè)置于E01）。調(diào)節(jié)SSC電使要細(xì)胞群得以清楚呈現(xiàn)。調(diào)節(jié)FSC/SSC圖原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。調(diào)整定位后，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗中的。2、Gating圈細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。我們常用前方散射FSC與側(cè)方散射（SSC的二維位圖，即散射圖譜ScatterPlot，來圈選出不同細(xì)胞群的范圍，選擇性顯示出有意義的細(xì)胞群體，如下圖圈選白血球之淋巴細(xì)胞族群。1）工具板選擇多邊形的Region，F(xiàn)SC/SSC散圖上劃淋巴細(xì)胞R1區(qū)（下圖）。分析樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)細(xì)胞應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)成紅色，可移動(dòng)或改變形狀來圈選有意義的細(xì)胞。如果要?jiǎng)h除R1區(qū)，可以在工具列中點(diǎn)選Gates→Regionlist以鼠標(biāo)點(diǎn)選，按Delete刪除R1域。刪除區(qū)后，可用繪圖工具板，重畫R1。

2）選希望Gate的FL1/FL2散圖，從Plots菜中選擇在出現(xiàn)對(duì)話方框內(nèi)，將NoGate選G1=R1點(diǎn)擊OK。3、節(jié)FL1、的探測(cè)（壓1）擊AcquisitionControl窗口中的Restart在Detector/Amps窗中調(diào)節(jié)FL1、FL2的電壓，使NegativeControl細(xì)群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之10--101處2）Threshold窗，適當(dāng)?shù)靥岣逨SC閾>52以去除碎片或低階噪音。唯需意不要切掉主要細(xì)胞族群。3）擊AcquisitionControl窗中的Pause、Abort。移去陰性對(duì)照管，我已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光，不要再改動(dòng)Detector/AmpsThreshold等數(shù)值。4、節(jié)光償說明：最適化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重迭（如單熒實(shí)驗(yàn)跳此驟如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)FL2-%FL1，F(xiàn)L1-%FL2若色本，必要時(shí)需調(diào)節(jié)、FL1-%FL2、FL3-%FL2FL2-%FL3的償）。1）HighRUN換上單染CD3-FITC管。點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Acquire。調(diào)節(jié)FL2-%FL1使FITC陽(yáng)細(xì)胞在FL1/FL2點(diǎn)圖的右下象限。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊來?yè)裰苯油蟿?dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Pause。

2）去單染CD3換上單染CD19-PE管點(diǎn)AcquisitionControl窗中的Restart。調(diào)節(jié)FL1-%FL2使PE+細(xì)胞在FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。調(diào)節(jié)完畢，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗中的Pause。3.最后以CD3-FITC/CD19-PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊AcquisitionControl窗口中的Restart確定三群細(xì)胞工整垂直。當(dāng)您已完成色熒光之光譜重迭時(shí)，點(diǎn)擊AcquisitionControl口中的Pause、Abort。4）去樣本，換上管讓儀器暫且處于Standby狀。關(guān)閉窗口。您已完成2色光之最適化。六收實(shí)數(shù)1）定儲(chǔ)存胞總數(shù)：預(yù)設(shè)之「儲(chǔ)存細(xì)胞總數(shù)」為。如需修改，從單中選擇Acquisition&Storage，并出現(xiàn)的窗口功，確認(rèn)CollectionCriteria從10000ofAll，再點(diǎn)擊OK

2）找檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù)，本機(jī)所有數(shù)據(jù)都貯存在D盤data盤，按實(shí)驗(yàn)日期編排。Acquire菜中選擇ParameterDescription，現(xiàn)ParameterDescription對(duì)方框。點(diǎn)擊，在隨后出現(xiàn)對(duì)話方框，選擇YourFolder」新建活頁(yè)夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的Select’YourFolder（一般用實(shí)驗(yàn)日期來命名Folder。3）名即將存之文件名：點(diǎn)擊ParameterDescription對(duì)方框的File，出文件名編輯窗口，輸入文件名（根據(jù)實(shí)驗(yàn)來決定），點(diǎn)擊此對(duì)話方框的OK4）Optional如有需要，可選擇或在P1-P5后空格中輸入相關(guān)參數(shù)。如P1Size,P2：Granularity,P3CD3FITC。輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔中，顯示在圖譜上。5）數(shù)器Counters：Acquire單中選擇窗會(huì)顯示樣品析速率、與總數(shù)進(jìn)度6）始收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)LOWRUN（根據(jù)Counters來調(diào)節(jié)速度，一般保持在

700-800/Second，將第一管樣品放到檢測(cè)區(qū)，在AcquisitionControl窗口中，將Setup改成Setup，此時(shí)CellQuest會(huì)自動(dòng)顯示YourFolder文件名為資料文件名。點(diǎn)擊“Acquire”便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存。計(jì)算機(jī)成功地收取足夠數(shù)據(jù)，會(huì)自動(dòng)儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件文件名.001，并會(huì)“嘟”聲告知，CellQuest會(huì)自動(dòng)升冪附加檔名成文件名002。等待下一指示。7）上超純，清洗管路，直到Counters持顯示0/Second30s(為10-20s)，換上下一管樣品，點(diǎn)擊Acquire”啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù)儲(chǔ)存?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢。七退軟并機(jī)1）檢分析完畢后，記SaveAs，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文編輯。

得從屏幕上方File指欄選擇件，以備日后使用，不需每次重新

2）品分析畢后，用鼠標(biāo)從屏幕上方Acquire指欄中，選取DisconnecttoCytometer以斷絕計(jì)算機(jī)與儀器間之聯(lián)機(jī)。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件File”“Quit”(遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇Don”，進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。3）2ml10漂白水取