DNA片段擴(kuò)增及DNA連接PCR講解課件

一、PCR實(shí)驗(yàn)背景二、PCR基本原理三、PCR引物設(shè)計(jì)原則四、PCR反應(yīng)注意事項(xiàng)五、常見問題與對策六、PCR的應(yīng)用講解內(nèi)容

第二次實(shí)驗(yàn)課、DNA片段擴(kuò)增及DNA連接一．實(shí)驗(yàn)背景

Thepolymerasechainreaction(PCR)isinventedbyK.Mullisin1985.ThistechniqueisusedtoamplifyaspecificsequenceofDNAinvitrobysimulatingthereplicationprocedureofnaturalDNAinvivo.PCRenableustounlimitedlyamplifyDNAfragments.TheNobelPrizeinChemistry1993體外擴(kuò)增特異DNA片段二．PCR基本原理3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。PCR儀設(shè)定的反應(yīng)條件：94oC45SDNA變性55oC45SDNA復(fù)性72oC1min產(chǎn)物鏈延伸

25-30個(gè)循環(huán)后72oC10min

一般地，基因片段在500-1000bp左右時(shí)，可按下列條件進(jìn)行PCR：介紹：PCR儀如果上蓋加熱的PCR儀，可以直接放入儀器中進(jìn)行PCR；如果下面加熱的PCR儀，加入2滴礦物油后，加入儀器中，不過這種儀器現(xiàn)在已經(jīng)很少用到。PCR儀內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)變性退火延伸551234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，在引物、模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺期”。到達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率等因素。PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于引物的正確設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的總原則就是提高擴(kuò)增的特異性，這取決于引物與模板的特異結(jié)合。PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′引物和3′引物。三、PCR引物的設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)的基本原則引物的設(shè)計(jì)實(shí)例(＊)

PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則2.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。在NCBI上搜索該基因。通過序列同源性比較軟件（比如DNAman）比對（Alignment），相同的序列就是其保守區(qū)。1.引物的方向永遠(yuǎn)是5→3引物長度一般在15~30核苷酸之間。

引物長度（primerlength）常用的是18-27bp。過短會使PCR的特異性降低；過長沒有必要。引物3′端要避開密碼子的第3位。因?yàn)槊艽a子的第3位易發(fā)生不改變aa突變。3.引物3’端是DNA延伸的起點(diǎn)，因此一定要嚴(yán)格與模板DNA配對。尤其是引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基要求與模板嚴(yán)格互補(bǔ)。但引物的3′端最好沒有連續(xù)3個(gè)G和C。否則會使引物在模板的G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤配對。引物3′端最好選擇T？引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異。當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。引物3′端的從結(jié)合的角度講最佳堿基選擇是G和C。

6.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)。尤其在引物3’末端。按經(jīng)驗(yàn)，不能有連續(xù)4(5)個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物3’末端一般不達(dá)到3bp。引物間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)，以免形成引物二聚體。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）PrimersThatFormHairpins?Aprimermaybeself-complementaryandbeabletofoldintoahairpin.?The3′endoftheprimerisbase-paired,preventingitannealingtothetargetDNA.5′-GTTGACTTGATAT3′-GAACTCTPrimersThatFormDimers?Primerpairsshouldbecheckedforcomplementarityatthe3'-end.Thisoftenleadstoprimer-dimerformationwithitselforwiththeotherprimer.?Primerdimerscanbeanexcellent,butunwanted,substratefortheTaqpolymerase.5′-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3′

3′-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5′8.引物5′端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3′端△G值較低?！鱃值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟件進(jìn)行分析）9.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。10.引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。與模板之間的特異性結(jié)合序列一般不少于15-18bp。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。引物的設(shè)計(jì)實(shí)例(＊)已知IFN-cDNA序列,你該如何設(shè)計(jì)引物？atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggctgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgcaggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaagaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaattgtctccttttacttcaaactttttaaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatgaatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaattattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatggctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcaaggtcgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的結(jié)合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的結(jié)合設(shè)計(jì)引物時(shí):

5′引物與位于待擴(kuò)增片段5′上游的一小段DNA序列相同，以信息鏈的互補(bǔ)鏈為模板，引導(dǎo)信息鏈的合成;

3′引物與擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)，引導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。PCR反應(yīng)擴(kuò)增的就是這一對引物之間的DNA片段。答：5’引物照抄，3’引物互補(bǔ)倒讀；酶切位點(diǎn)加在引物的5’；調(diào)GC含量的堿機(jī)放在最前邊；此外無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、與基因組其它區(qū)域的同源性較差。atgaaatatacaagtgaagagcatcccagtaaatgaaatatacaagt3’5’3’5’上游(5’)引物的結(jié)合CTTCTCGTAGGGTCATT下游(3’)引物的結(jié)合----:ForG+CcontentSenseprimer:5’－GCAGCGGATCCATG

AAATATACAAGT－3’15bpGC=11AT=15Anti-Senseprimer:5’－ATCGGAATTCTTA

CTGGGATGCTCTTC－3’17bpBamHIstartcodonGC=12AT=15EcoRIstopcodon引物的方向是5→3：特異性序列是否少了點(diǎn)?通常在引物的5‘-端設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)引物設(shè)計(jì)軟件介紹：PrimerPremier5.0顧名思義，該軟件就是用來進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的?？梢院唵蔚赝ㄟ^手動拖動鼠標(biāo)以擴(kuò)增出相應(yīng)片段所需的引物，而在手動的任何時(shí)候，下面顯示各種參數(shù)的改變和可能的二聚體、異二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等。也可以給定條件，讓軟件自動搜索引物，并將引物分析結(jié)果顯示出來。而且進(jìn)行這些操作非常簡單Oligo6.57引物分析著名軟件，主要應(yīng)用于核酸序列引物分析設(shè)計(jì)軟件，同時(shí)計(jì)算核酸序列的雜交溫度（Tm）和理論預(yù)測序列二級結(jié)構(gòu)。PrimerD'Signer1.1免費(fèi)的引物設(shè)計(jì)輔助軟件，專門用于pASK-IBA和pPR-IBA表達(dá)載體，簡化引物設(shè)計(jì)工作。四．PCR反應(yīng)注意事項(xiàng)OptimizationofPCRcondition

＊PCR方法操作簡便，但影響因素頗多。去離子水（補(bǔ)足反應(yīng)體系）39l模板2

l10PCRbuffer（含MgCl2）5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物(sense10mol/L)0.5~1

l3’引物(anti-sense10mol/L)0.5~1

lTaqDNApol.(2U/l)1l

輕彈管底混合（用離心機(jī)甩一下）（一）、PCR反應(yīng)體系-----finalvolume

50l加各種成分最好在冰上進(jìn)行。

1.模板DNA不是越多越好：2

l

1)在一定范圍內(nèi)PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高，2)但模板濃度過高會導(dǎo)致引物無法與模板結(jié)合，反應(yīng)的非特異性增加。3)一般采用102105拷貝的待擴(kuò)增片段作為模板:微克水平的基因組DNA、重組質(zhì)粒DNA用ng水平的量。4)模板過多還能大量消耗鎂離子。Theamountoftemplate—“moreisless”.Don’taddtoomuchtemplateTemplateDNA不能含有其提取時(shí)所用試劑：提取genomicDNA的基本過程：（1）裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，抑制DNaseactivityproteinaseK＋SDS＋EDTA（2）然后用酚－氯仿多次抽提，去除蛋白質(zhì)（3）用RNase去除RNA（4）用乙醇沉淀DNA，airdry,無菌水溶解。2.引物：0.5lPrimer1:OD=5PCR反應(yīng)引物濃度為0.1~0.5μmol/L,引物與模板的摩爾比至少為108：1。

如此過量的引物才能確保模板DNA一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度太高，（1）會增大引物結(jié)合到不嚴(yán)格配對區(qū)域的機(jī)會，這樣的錯(cuò)配會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增;（2）可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。但如果該比例太低，PCR效率也會降低。primers引物的配制Primer1:OD=5注意：凍干品，計(jì)算一管引物的總含量或克分子數(shù)先配成100mM的濃度作為儲存液工作液:10mol/L,-20℃保存。50l反應(yīng)體系中加：0.5～1l,

終濃度：0.1~0.5mol/L如果需要反復(fù)應(yīng)用的引物，配制后一定要分裝保存，一段時(shí)間后棄掉。切記：不要將合成回來的引物一次性配成工作液！primersRT的引物選擇：

Oligo(dT)15-18Specificanti-senseprimerRandomprimer因?yàn)榛蛐蛄信cmRNA序列是一致的。病毒RNA作為RT模板時(shí)，一定要知道病毒是屬于哪一種病毒：正鏈RNA病毒？負(fù)鏈RNA病毒？正鏈RNA病毒：RT引物用anti-senseprimer；負(fù)鏈RNA病毒：RT引物用senseprimer。ThermostableDNApolymerase3.DNA聚合酶活性：5`--3`方向的聚合酶活性。在75~80℃具有最高的聚合酶活性。半衰期：95℃，40分鐘缺乏3`--5`外切酶活性。因此沒有校正功能。Fidelity（保真度）：PCR反應(yīng)的錯(cuò)配率一般為1~2X10-4AnextraA（3.1）TaqDNA聚合酶(2U/l)1l保存:在-20℃至少6個(gè)月。抑制劑:乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS等。內(nèi)源DNA污染:制備過程中殘留的原細(xì)菌DNA等。會在無模板對照管出現(xiàn)擴(kuò)增帶。在50μl反應(yīng)體系中加Taq:一般為0.5~2U，

TooLowConc.:lowactivity，PCR產(chǎn)物的量減少TooHighConc.:non-specificamplification.加各種成分最好在冰上進(jìn)行。操作時(shí)先加水，最后加酶（3.2）PfuDNA聚合酶此酶耐熱性極好，在97.5℃半衰期>3小時(shí)，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠實(shí)性比TaqDNA聚合酶高12倍。3→5proofreadingexonucleaseactivity.

withgreateraccuracy.

noextraA.（3.3）Vent-TMDNA聚合酶半衰期：100℃，95分鐘97.5℃

，130分鐘其擴(kuò)增產(chǎn)物的長度可達(dá)10~13kb。活性：具有35外切酶活性，具有校對功能，錯(cuò)誤摻入率為1/31000。忠實(shí)性比TaqDNA聚合酶提高510倍。（3.4）TthDNA聚合酶半衰期：950C，20分鐘

活性：具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可簡化RT-PCR。但不具35外切酶活性，沒有校對功能，催化聚合反應(yīng)的錯(cuò)誤摻入率為1/500。緩沖液含50mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。4、10XPCRbuffer5lBuffer:10-50mmol/LTris-HCl(pH8.3-8.8,20℃)。5、Mg2+：20~25mmol/L3lForTaqpolymeraseactivity.

鎂離子濃度：1.5~2.0mmol/L

Concentration:tooLow:lowactivitytooHigh:non-specificamplificationTaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+濃度過低，會顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)體系中含有高濃度的primers、dNTP、EDTA時(shí):

?上述分子中的磷酸基團(tuán)可與Mg2+結(jié)合而降低游離Mg2+濃度，從而影響TaqDNA聚合酶的活性。

?Vary[Mg2+]instepsof0.5mMWithin1.5~5.0mM;?Sometimesacompromisebetweenyieldandspecificity.dNTPs貯備液：濃度為10mmol/L。（注：dNTP具有較強(qiáng)的酸性，使用時(shí)應(yīng)用1mol/LNaOH將pH值調(diào)至中性(7.0~7.5)。分裝，－20℃存放，反復(fù)凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTPs濃度在20~200μmol/L。

dNTP濃度過高會增加非特異性配對堿機(jī)的錯(cuò)誤摻入率。低濃度的dNTP會導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，減少PCR產(chǎn)物量，但可提高反應(yīng)的特異性及實(shí)驗(yàn)的精確性。4種dNTP濃度應(yīng)相同:錯(cuò)誤堿基的摻入率降至最低。1kbgene:1l;2kbgene:2l6、底物:dNTPs（脫氧核苷三磷酸）

(10mmol/L)1l（被稀釋了50倍,即濃度：200mol/L）7、添加劑：DMSO（二甲基亞砜）2.5l

相當(dāng)于將退火溫度提高了5℃。

但>10％的DMSO會對聚合酶活性產(chǎn)生不良影響。加入適量二甲基亞砜（終濃度：5％）有利于引物、模板的解鏈，減少其二級結(jié)構(gòu)，1）為什么有時(shí)候需要進(jìn)行熱啟動？（二）、如何確定PCR的變性、退火和延伸溫度和時(shí)間？熱啟動：TaqDNA聚合酶在DNA雙鏈充分打開之后再加入PCR反應(yīng)體系中，這樣可保證模板DNA、引物變性充分，避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級結(jié)構(gòu)影響引物的退火，使引物能更加順利地、特異性地結(jié)合到模板上。熱啟動結(jié)束后暫停PCR反應(yīng)，在PCR儀上直接趁熱加入DNApol。OptimizingthePCRReactionprogram

變性溫度：一般選用94～

95

℃

。變性時(shí)間：可根據(jù)模板長短、G和C含量確定，一般采用30秒。

2）變性但過高或時(shí)間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。HalflifeofTaqDNApolymerase：92.5oC2h，95oC40mins，97oC5mins.

30cycleswillneed15min

3）退火溫度和時(shí)間PCR的基本流程：94oC,45sec55oC,1min72oC,2min退火溫度的變化是根據(jù)引物的GC比例、引物的長度調(diào)整的。AnnealingFrom45oCto60oC.

Usuallyitisaround55℃

for1min.

退火

溫度與引物序列關(guān)系非常密切，退火時(shí)間與引物長度和GC含量有關(guān)。引物長度一般在15-25bp之間。Tm=4(G+C)+2(A+T)(a)AnnealingtemperatureistoohighPrimersandtemplatesremaindissociated.(b)Annealingtemperatureistoolow.Mismatchedhybrid.(c)Correctannealingtemperature.Primingoccuresonlyatthedesiredtargetsites.Howtodecideannealingtemperature?(a)(b)(c)溫度越高，特異性

(specificity)越高。溫度：72℃，74℃，是Taq酶的最適工作溫度。時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增基因片段的大小確定延伸時(shí)間。

過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。酶的延伸效率：1000bp/1min。

小于500bp，一般采用1分鐘即可；

500~2000bp:2min。

超過2000bp，一般可適當(dāng)延長延伸時(shí)間，3分鐘。

4）延伸溫度和時(shí)間典型的PCR條件：94～95℃30S，55℃1min，72℃2min

25～30個(gè)cycles后72℃延伸10min。循環(huán)次數(shù)：

25～30cycles循環(huán)過多會增加堿基的錯(cuò)配幾率。

4）循環(huán)次數(shù)總結(jié)：其他因素1）熱啟動：提高擴(kuò)增的特異性2）添加劑：DMSO消除引物與模板的二級結(jié)構(gòu)，降低DNA的解鏈溫度，增進(jìn)DNA復(fù)性時(shí)的特異配對。3）液體石蠟：防止反應(yīng)液蒸發(fā)后反應(yīng)成分的改變。HowbigisatargetDNA??typicallyinthesizerange100-1500bp.?Longertargetsareamplifiable—>25kb.?Requiresmodifiedreactionbuffer,cocktailsofpolymerases,andlongerextensiontimes.五、常見問題與對策PCR常見問題之一無擴(kuò)增產(chǎn)物---假陰性1.模板:①提取的模板核酸中含有雜蛋白質(zhì)、酚、EDTA等抑制了Taq酶活性

②toomuchortoolittle

原因2.引物：①選一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，

兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物發(fā)生降解:

引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放4℃導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不當(dāng):

引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：

濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量,甚至不出擴(kuò)增條帶。酶失活：①酶的失活，