外源目的基因表達(dá)與調(diào)控2課件

第四節(jié)目的基因表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)

與分離純化一、外源目的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)外源目的基因的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)階段。外源基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)過(guò)程就是對(duì)特異性mRNA或蛋白質(zhì)的檢測(cè)。特異性mRNA的檢測(cè):Northern雜交特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè):ELISA,Western雜交1.Northern印跡雜交(Northernblot)檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的區(qū)別靶核酸：RNARNA電泳:在變性條件下進(jìn)行,以去除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu),保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。轉(zhuǎn)膜：不需變性2.ELISA1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlmann，荷蘭學(xué)者VanWeeman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA）。

ELISA原理圖YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）ELISA可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種。直接法：直接法是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原—抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量。見(jiàn)圖a間接法：是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反應(yīng)一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量。見(jiàn)圖b夾心法：是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物；也可以象間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，見(jiàn)圖C。前者稱(chēng)為直接夾心法，后者稱(chēng)為間接夾心法。ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程3.WesternBlot

要檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化，首選方法是WesternBlot。Westernblot是生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。Westernblot整個(gè)過(guò)程主要包括：PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及蛋白檢測(cè)3個(gè)階段。聚丙烯酰胺凝膠的組成及特點(diǎn)組成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N’-甲叉(亞甲基)雙丙烯酰胺(Bis)聚合而成。聚合：?jiǎn)为?dú)或混合時(shí)穩(wěn)定，出現(xiàn)自由基團(tuán)時(shí)會(huì)聚合?；瘜W(xué)法的引發(fā)劑：過(guò)硫酸銨（APSorAP)，催化劑：四甲基乙二胺（TEMED)

特點(diǎn)：凝膠濃度越大，交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小。故根據(jù)分離蛋白質(zhì)的大小選擇不同濃度的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）的原理

WesternBlot基本原理

經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)特定蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。Westernblot基本原理

Figure1A.Inthedirectdetectionmethod,labeledprimaryantibodybindstoantigenonthemembraneandreactswithsubstrate,creatingadetectablesignal.1B.Intheindirectdetectionmethod,unlabeledprimaryantibodybindstotheantigen.Then,alabeledsecondaryantibodybindstotheprimaryantibodyandreactswiththesubstrate.A.DirectDetectionB.IndirectDetectionGelelectrophoresisTips:Separateproteinsbygelelectrophoresis

1-Dgels2-DgelsTransfer(WettanktransfersystemandSemi-drytransfersystem)二、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化

（一）細(xì)胞收集

1.離心法收集細(xì)胞2.過(guò)濾法收集細(xì)胞3.絮凝法收集細(xì)胞變性劑裂解法：SDS超聲波破碎法：將電能通過(guò)換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過(guò)液體介質(zhì)(如水)而變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生的象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細(xì)胞等物質(zhì)的作用(俗稱(chēng)“空化效應(yīng)”)。機(jī)械破碎法：液氮凍干細(xì)胞再研磨，高壓勻漿器細(xì)胞漿液通過(guò)止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi)，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速?zèng)_出，并射向撞擊環(huán)上，