基因工程的常規(guī)技術(shù)1課件

第八章植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)(背景知識)第一節(jié)凝膠電泳技術(shù)第二節(jié)分子雜交技術(shù)第三節(jié)PCR技術(shù)1第一節(jié)凝膠電泳技術(shù)

什么是電泳技術(shù)？電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。2特點：1.可以制成非常均勻的凝膠，帶電質(zhì)點在凝膠的孔中泳動。2.電泳操作方法簡便，電泳速度快3.分辨率高，重復(fù)性好，電泳圖譜清晰。

瓊脂糖半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷本節(jié)主要介紹瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。瓊脂糖與瓊脂有區(qū)別么？35影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在76影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子越大，摩擦阻力越大，同時大分子通過凝膠孔徑的效率也低于較小的分子，所以分子大的遷移慢。等量的空間結(jié)構(gòu)，緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。7瓊脂糖凝膠的濃度9影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。10影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5-8V/cm11瓊脂糖凝膠的濃度13影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7溶液pH值距離其等電點愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對于蛋白質(zhì)等兩性分子，緩沖液pH還會影響到其電泳方向;溶液的離子強(qiáng)度過低，會使電導(dǎo)率降低，DNA不是全然不動就是遷移極慢；而離子過強(qiáng)時，電導(dǎo)率上升，會產(chǎn)生大量熱能，使凝膠變化甚至熔化，也會使DNA變性。14影響電泳遷移率的因素DNA分子的大小1凝膠的濃度2DNA的構(gòu)象3使用的電壓4瓊脂糖的種類5電泳緩沖液6嵌入染料的存在7染色劑溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加，因此，線性DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15%。15

當(dāng)用EB對DNA樣品染色時，加入的EB就插入DNA分子中形成熒光結(jié)合物，熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比，如果用DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)品作電泳對照，就可以估計出待測樣品的分子量大小和濃度。17DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測

+-儀器

電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍；藥品Agarose、TAEbuffer、EB（溴化乙錠）上樣緩沖液（6X）0.25%溴酚藍(lán)（指示100-200bp的帶）、0.25%二甲苯青（指示800-100bp的帶）、40%蔗糖；水溶液4℃保存。18玻璃片19預(yù)染色的標(biāo)本212223第二節(jié)分子雜交技術(shù)所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

核酸雜交技術(shù)主要有Southern雜交、Northern雜交和菌落原位雜交等。25一、探針與探針標(biāo)記雜交的主要目的是為了檢測出同源DNA序列，而為了達(dá)到這一目的，必需要有標(biāo)記的探針。帶有能檢測的標(biāo)記物的DNA或RNA叫探針。使DNA或RNA帶有可檢測的標(biāo)記物的過程叫探針標(biāo)記。262.隨機(jī)引物標(biāo)記能與任何DNA模板的多個位點配對互補(bǔ)的多個不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫隨機(jī)引物。DNA聚合酶Klenow大片段能在隨機(jī)引物的引導(dǎo)下以帶有標(biāo)記的dNTP為原料合成新的與模板DNA互補(bǔ)的探針。29二、Southern雜交根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。30（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片雜交步驟：1.酶切2.電泳(變性）3.轉(zhuǎn)膜(注意DNA要小于2kb）4.封閉（預(yù)雜交）5.雜交6.顯影31

SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EB染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。32三、Northern雜交1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與Southern印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northern印跡技術(shù)（Northernblotting）。33Southern雜交和North