激光共聚焦技術(shù)課件

激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用技術(shù)

－－蛋白的細(xì)胞器定位分子生物學(xué)課件ConfocalLaserScanningMicroscopyZeiss

LSM510META激光共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)激光光源冷卻系統(tǒng)掃描器光學(xué)裝置熒光顯微鏡系統(tǒng)圖象存儲與處理及控制系統(tǒng)針孔光欄分光鏡發(fā)射熒光單色器檢測器激光掃描共聚焦顯微鏡（LSM）是當(dāng)今世界上最先進(jìn)的分子生物學(xué)分析儀器之一。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，使用紫外光或激光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化或生理功能的改變。成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)和遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新的有力研究工具。熒光顯微鏡系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同，但又有其特點(diǎn)。需與掃描器連接。使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品，并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測器。需有光路轉(zhuǎn)換裝置。即汞燈與激光轉(zhuǎn)換，同時(shí)汞燈光線強(qiáng)度可調(diào)。熒光鏡座要有防震動裝置。激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖激光經(jīng)放大、分光后由物鏡聚焦于焦平面上，同時(shí)，焦平面上被激光掃描的點(diǎn)F所發(fā)出的一定波長的熒光通過檢測針孔光欄達(dá)到檢測器，并成像于顯示器上，得到相應(yīng)的熒光圖象。激光共聚焦顯微鏡基本操作獲取共焦圖像的步驟在VIS模式中觀察樣品

裝入LSM配置

掃描圖像

保存圖像Z軸掃描時(shí)間系列掃描Z軸掃描＋時(shí)間系列掃描Z軸掃描、時(shí)間系列掃描組織和細(xì)胞樣品中熒光的來源自發(fā)熒光熒光染色免疫熒光－熒光抗體法產(chǎn)生熒光外源性熒光物質(zhì)進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生熒光酶致熒光熒光樣品的制備要求熒光標(biāo)記反應(yīng)的特異性強(qiáng)、熒光定位準(zhǔn)確保持樣品應(yīng)有的結(jié)構(gòu)形態(tài)完整性熒光信號的響應(yīng)準(zhǔn)確、靈敏、具有可重復(fù)性熒光強(qiáng)度適宜熒光穩(wěn)定性好樣品的熒光分布均勻兩種及兩種以上的熒光信號之間熒光光譜交叉可以消除圖象背景干凈、干擾雜質(zhì)少熒光探針標(biāo)記樣品的過程樣品預(yù)處理給藥、切片或細(xì)胞標(biāo)本的制備熒光探針標(biāo)記樣品百合花粉管鈣離子濃度梯度檢測液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)百合花粉觀察花粉管生長情況，長度大概為花粉粒直徑的2－5倍，過長的花粉管會彎曲扭轉(zhuǎn)不利于觀察。熒光探針Fluo-3（/AM）屬于單波長染料，用于測定鈣離子的相對濃度。Fluo-3/AM是fluo-3的一種乙酸甲酯衍生物，fluo3/AM是脂溶性物質(zhì)，能跨膜進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞漿中被水解脫掉AM后，變成游離的fluo-3，因其不具備跨過完整細(xì)胞膜的特性因此停留在細(xì)胞內(nèi)。游離配體形式的fluo-3是非熒光性的，但是當(dāng)它與Ca2＋結(jié)合后，形成具有熒光的fluo-3-Ca，是細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加40至80倍，而且其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)[Ca2＋]呈正相關(guān)，因此可以得到Ca2＋濃度。另外Fluo3對于紫外光照射下可裂解的螯合鈣或其它形式的鈣也有作用。圖7～10.

7.連續(xù)降溫下生成Ca2+熒光隨時(shí)間變化的曲線同時(shí)記錄的熒光圖像,顯示冬小麥胞內(nèi)熒光有相同的變化趨勢。8.連續(xù)降溫下生成Ca2+熒光隨時(shí)間變化的曲線同時(shí)記錄的熒光圖像,顯示春小麥胞內(nèi)熒光有相同的變化趨勢。9.Fluo-3/AM染色后,靜息態(tài)下冬小麥原生質(zhì)體的三維重組圖像。10.Fluo-3/AM染色后,靜息態(tài)下春小麥原生質(zhì)體的三維重組圖像。劉煒等，低溫處理對冬、春小麥細(xì)胞Ca2+時(shí)空變化的影響，植物學(xué)報(bào)，2001，43(12):1218－1223目的蛋白細(xì)胞器定位觀察含有熒光蛋白的載體pA7-GFP目的基因洋蔥表皮目的蛋白細(xì)胞器定位觀察對提取的質(zhì)粒，用目的基因的引物進(jìn)行PCR鑒定，出現(xiàn)了目的片段。根據(jù)pA7-GFPVector上提供的酶切位點(diǎn)，對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行電泳分析，也出現(xiàn)了目的片段，表明目的片段已經(jīng)和質(zhì)粒DNA重組。

圖3-9pA7-TTG1重組質(zhì)粒酶切鑒定及PCR鑒定酶切：重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；M：MarkerDL2000；PCR：重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物目的蛋白細(xì)胞器定位觀察含TTG1的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞將提取好的的含有目的基因的瞬時(shí)表達(dá)載體以及pA7-GFP載體約20μL分別加入1.5mL離心管中，分別加入500μL的蒸餾水，兩管分別標(biāo)號P1，P2。(2)分別取4片約1.5cm*1.5cm大小的洋蔥表皮放入P1，P2。(3)將P1，P2管管蓋打開，用封口膜將其封上，扎兩到三個(gè)小孔。(4)將P1，P2管進(jìn)行抽真空，抽到剛剛沸騰為止，一共抽三次。(5)取MS培養(yǎng)基并在其上鋪上一層濾紙。(6)取出P1，P2管中的洋蔥表皮，將其鋪在MS培養(yǎng)基的濾紙上，加少量的水培養(yǎng)16小時(shí)。目的蛋白細(xì)胞器定位觀察

BrightGFP Merged

TTG1在津田蕪菁洋蔥表皮細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)檢測A-C：GFP蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中的表達(dá)；D-F：T