細(xì)胞融合與單克隆抗體1課件

第三章細(xì)胞融合與單克隆抗體3.1細(xì)胞融合(cellfusion)定義:在離體條件下用人工的方法把不同種的細(xì)胞通過(guò)無(wú)

性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。3.1.1細(xì)胞融合的發(fā)展歷史“自發(fā)”細(xì)胞融合現(xiàn)象：1838年Muller多核的腫瘤細(xì)胞1858年Virchow正常組織、發(fā)炎組織及腫瘤組織——多核細(xì)胞1873年Luginbuhl天花病人——多核體血細(xì)胞1875年Lange蛙類血液細(xì)胞發(fā)生合并3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)重要事件1962年,(日)岡田善雄仙臺(tái)病毒促細(xì)胞融合70年代,(華裔加籍)高國(guó)楠PEG促植物原生質(zhì)體的融合80年代，電融合3.1細(xì)胞融合(cellfusion)植物細(xì)胞融合：1972年（美）P.S.Carlson——雜種煙草現(xiàn)代植物細(xì)胞融合的開(kāi)始1978年（德）梅歇爾斯——“pomoto”3.1細(xì)胞融合(cellfusion)“Pomoto”3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1.3動(dòng)物細(xì)胞融合

動(dòng)物細(xì)胞融合是研究細(xì)胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造新細(xì)胞株的有效途徑。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)腫瘤細(xì)胞與樹(shù)突狀細(xì)胞的融合3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1.4細(xì)胞融合的誘導(dǎo)誘導(dǎo)融合的方法:物理法:電場(chǎng)刺激激光顯微操作化學(xué)法:聚乙二醇(PEG)結(jié)合高pH、高鈣離子法生物法:仙臺(tái)病毒3.1細(xì)胞融合(cellfusion)不同細(xì)胞融合的條件及其主要應(yīng)用來(lái)源前處理融合方法主要應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞不需仙臺(tái)病毒、PEG、電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細(xì)胞脫壁PEG、電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細(xì)胞脫壁PEG高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種3.1細(xì)胞融合(cellfusion)融合的可能機(jī)制：

病毒被膜含有糖蛋白，其表面還分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細(xì)胞膜上的糖蛋白，使細(xì)胞膜局部凝集，再通過(guò)膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而打開(kāi)質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞融合。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)融合過(guò)程：1.病毒顆粒附著細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞粘著成堆，在4℃冰浴中細(xì)胞緊密靠近，但不發(fā)生融合。2.37℃溫浴后，粘結(jié)部位的細(xì)胞膜破壞，形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通、融匯。3.病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)兩個(gè)細(xì)胞合并、變圓，完成融合，全過(guò)程約15～30分鐘。4.細(xì)胞核也相互合并,完成細(xì)胞融合3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)融合的可能機(jī)制？脫水作用能使細(xì)胞凝聚，并使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化？改變膜表面電荷或膜電位，而導(dǎo)致膜上蛋白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之故。

？3.1細(xì)胞融合(cellfusion)初步分析

可能是由于帶有大量負(fù)電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負(fù)電荷間，在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結(jié)合，在高pH、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分子洗脫，導(dǎo)致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負(fù)電荷連接起來(lái)，進(jìn)而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)PEG誘導(dǎo)過(guò)程注意事項(xiàng)：控制與分子量、濃度和處理時(shí)間懸浮法：將細(xì)胞懸于40～50％的PEG4000進(jìn)行溶，處理1～2分鐘為宜。離心法：先將細(xì)胞混合物懸于30～40％的

PEG4000，再離心進(jìn)行融合，則可適當(dāng)延長(zhǎng)融合時(shí)間，以5～8分鐘為宜。

3.1細(xì)胞融合(cellfusion)PEG融合法優(yōu)點(diǎn)

效率高材料方便，操作簡(jiǎn)易效果穩(wěn)定PEG融合法缺點(diǎn)

對(duì)細(xì)胞有毒性3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)電融合優(yōu)點(diǎn)：融合效率高，可達(dá)50～80％產(chǎn)生雜交細(xì)胞的頻率高，是PEG法的100倍。

操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，但需設(shè)備。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用?？稍陲@微鏡下觀察操作。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)融合率融合細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細(xì)胞的細(xì)胞核總數(shù)

×100％融合率=3.1細(xì)胞融合(cellfusion)植物細(xì)胞融合基本過(guò)程去除細(xì)胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞細(xì)胞相互靠近形成細(xì)胞橋–最關(guān)鍵的一步胞質(zhì)滲透細(xì)胞核融合篩選,培養(yǎng),促進(jìn)細(xì)胞分裂,分化,從細(xì)胞團(tuán),愈傷組織到最后成株3.1細(xì)胞融合(cellfusion)動(dòng)物細(xì)胞融合基本過(guò)程動(dòng)物單個(gè)細(xì)胞的獲得組織的獲得組織的消化誘導(dǎo)細(xì)胞融合形成雜種細(xì)胞篩選，培養(yǎng)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合細(xì)胞融合的原理細(xì)胞膜的流動(dòng)性、植物細(xì)胞全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞融合的方法去處細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法物理（顯微操作、電融合）化學(xué)（聚乙二醇）物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體3.1細(xì)胞融合(cellfusion)影響細(xì)胞融合的因素(1)親本細(xì)胞表面性質(zhì)，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則者較易融

合；表面光滑者較難融合。(2)細(xì)胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及株化細(xì)胞較易

融合，而淋巴細(xì)胞或血球細(xì)胞幾乎不融合。(3)細(xì)胞融合時(shí)需要適宜溫度和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。如仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)歐

利希氏腹水癌細(xì)胞融合時(shí)，于37℃振搖時(shí)易于融合，且

融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。

在37℃時(shí)不振搖則幾乎不融合。影響細(xì)胞融合的因素3.1細(xì)胞融合(cellfusion)(4)細(xì)胞融合過(guò)程中，通常耗氧量較大．缺氧時(shí)經(jīng)常不融合?？諝庵泻趿看笥?0％時(shí)有一定融合率，但有些細(xì)胞在無(wú)氧條件下也可融合。(5)有些細(xì)胞融合時(shí)需要Ca2+，否則不融合，細(xì)胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生

變化。實(shí)驗(yàn)表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+．但有效濃度較Ca2+大的多。融合時(shí)最適合的離子強(qiáng)度

一般為0.1mol/L(6)最適合的pH為7．4—7．8之間，在此范圍之外，融合率均較

低。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)融合細(xì)胞的特征及其意義染色體組不穩(wěn)定，尤其種間雜交細(xì)胞,培養(yǎng)過(guò)程中染色體會(huì)逐漸丟失

3.1細(xì)胞融合(cellfusion)理論研究——基因定位和繪制基因圖工作中十分有用應(yīng)用價(jià)值——單克隆抗體

植物育種3.1細(xì)胞融合(cellfusion)融合細(xì)胞類型同核體（homokaryon）異核體(heterokaryon）多核體（polykaryon）異胞質(zhì)體(heterocybrid)3.1細(xì)胞融合(cellfusion)

同核體(homokaryon)同源細(xì)胞的融合體。由于是同源細(xì)胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)異核體(heterokaryon)

非同源細(xì)胞的融合體。一般是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，這種親和雜種細(xì)胞含有雙親全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個(gè)體也是可育的，如煙草屬種間的細(xì)胞雜種。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)多核體(polykaryon)

含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體以一個(gè)細(xì)胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細(xì)胞少量遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細(xì)胞。3.1細(xì)胞融合(cellfusion)異胞質(zhì)體(heterocybrid)

不