細胞融合與單克隆抗體1課件

第三章細胞融合與單克隆抗體3.1細胞融合(cellfusion)定義:在離體條件下用人工的方法把不同種的細胞通過無

性方式融合成一個雜合細胞的技術。3.1.1細胞融合的發(fā)展歷史“自發(fā)”細胞融合現(xiàn)象：1838年Muller多核的腫瘤細胞1858年Virchow正常組織、發(fā)炎組織及腫瘤組織——多核細胞1873年Luginbuhl天花病人——多核體血細胞1875年Lange蛙類血液細胞發(fā)生合并3.1細胞融合(cellfusion)3.1細胞融合(cellfusion)重要事件1962年,(日)岡田善雄仙臺病毒促細胞融合70年代,(華裔加籍)高國楠PEG促植物原生質(zhì)體的融合80年代，電融合3.1細胞融合(cellfusion)植物細胞融合：1972年（美）P.S.Carlson——雜種煙草現(xiàn)代植物細胞融合的開始1978年（德）梅歇爾斯——“pomoto”3.1細胞融合(cellfusion)“Pomoto”3.1細胞融合(cellfusion)3.1.3動物細胞融合

動物細胞融合是研究細胞遺傳信息轉(zhuǎn)移，基因在染色體上的定位以及創(chuàng)造新細胞株的有效途徑。3.1細胞融合(cellfusion)腫瘤細胞與樹突狀細胞的融合3.1細胞融合(cellfusion)3.1細胞融合(cellfusion)3.1.4細胞融合的誘導誘導融合的方法:物理法:電場刺激激光顯微操作化學法:聚乙二醇(PEG)結合高pH、高鈣離子法生物法:仙臺病毒3.1細胞融合(cellfusion)不同細胞融合的條件及其主要應用來源前處理融合方法主要應用動物細胞不需仙臺病毒、PEG、電融合生產(chǎn)單克隆抗體植物細胞脫壁PEG、電融合創(chuàng)造植物新品種微生物細胞脫壁PEG高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新菌種3.1細胞融合(cellfusion)融合的可能機制：

病毒被膜含有糖蛋白，其表面還分布有許多具有神經(jīng)氨酸酶和凝血活性的突起，神經(jīng)氨酸酶可降解細胞膜上的糖蛋白，使細胞膜局部凝集，再通過膜上蛋白質(zhì)分子的重新分布，使膜中的脂類分子重排，而打開質(zhì)膜，導致細胞融合。3.1細胞融合(cellfusion)融合過程：1.病毒顆粒附著細胞膜上起搭橋作用，使細胞粘著成堆，在4℃冰浴中細胞緊密靠近，但不發(fā)生融合。2.37℃溫浴后，粘結部位的細胞膜破壞，形成通道，細胞質(zhì)流通、融匯。3.病毒顆粒進入細胞質(zhì)，此時兩個細胞合并、變圓，完成融合，全過程約15～30分鐘。4.細胞核也相互合并,完成細胞融合3.1細胞融合(cellfusion)3.1細胞融合(cellfusion)融合的可能機制？脫水作用能使細胞凝聚，并使膜結構發(fā)生變化？改變膜表面電荷或膜電位，而導致膜上蛋白質(zhì)顆粒聚集及膜脂分子隨之發(fā)生重排之故。

？3.1細胞融合(cellfusion)初步分析

可能是由于帶有大量負電荷的PEG分子和原生質(zhì)體表面的負電荷間，在鈣離子的連接下形成靜電鍵，促使異源的原生質(zhì)體間的粘著和結合，在高pH、高鈣離子溶液的作用下，將鈣離子和與質(zhì)膜結合的PEG分子洗脫，導致電荷平衡失調(diào)并重新分配，使兩種原生質(zhì)體上的正負電荷連接起來，進而形成具有共同質(zhì)膜的融合體。3.1細胞融合(cellfusion)PEG誘導過程注意事項：控制與分子量、濃度和處理時間懸浮法：將細胞懸于40～50％的PEG4000進行溶，處理1～2分鐘為宜。離心法：先將細胞混合物懸于30～40％的

PEG4000，再離心進行融合，則可適當延長融合時間，以5～8分鐘為宜。

3.1細胞融合(cellfusion)PEG融合法優(yōu)點

效率高材料方便，操作簡易效果穩(wěn)定PEG融合法缺點

對細胞有毒性3.1細胞融合(cellfusion)3.1細胞融合(cellfusion)電融合優(yōu)點：融合效率高，可達50～80％產(chǎn)生雜交細胞的頻率高，是PEG法的100倍。

操作簡便、穩(wěn)定，但需設備。對細胞無毒害作用。可在顯微鏡下觀察操作。3.1細胞融合(cellfusion)融合率融合細胞的細胞核總數(shù)視野內(nèi)全部細胞的細胞核總數(shù)

×100％融合率=3.1細胞融合(cellfusion)植物細胞融合基本過程去除細胞壁以獲得大量的原生質(zhì)體誘導細胞融合形成雜種細胞細胞相互靠近形成細胞橋–最關鍵的一步胞質(zhì)滲透細胞核融合篩選,培養(yǎng),促進細胞分裂,分化,從細胞團,愈傷組織到最后成株3.1細胞融合(cellfusion)動物細胞融合基本過程動物單個細胞的獲得組織的獲得組織的消化誘導細胞融合形成雜種細胞篩選，培養(yǎng)3.1細胞融合(cellfusion)3.1細胞融合(cellfusion)植物體細胞雜交和動物細胞融合的比較比較項目植物體細胞雜交動物細胞融合細胞融合的原理細胞膜的流動性、植物細胞全能性細胞膜的流動性細胞融合的方法去處細胞壁后誘導原生質(zhì)體融合使細胞分散后誘導細胞融合誘導方法物理（顯微操作、電融合）化學（聚乙二醇）物理、化學方法（同左）滅活的病毒用途獲得雜種植株制備單克隆抗體3.1細胞融合(cellfusion)影響細胞融合的因素(1)親本細胞表面性質(zhì)，表面覆蓋絨毛而不規(guī)則者較易融

合；表面光滑者較難融合。(2)細胞種類不同，融合效果不同，如腹水癌及株化細胞較易

融合，而淋巴細胞或血球細胞幾乎不融合。(3)細胞融合時需要適宜溫度和運動狀態(tài)。如仙臺病毒誘導歐

利希氏腹水癌細胞融合時，于37℃振搖時易于融合，且

融合效率與病毒量呈正比。但在34℃振搖則融合率下降。

在37℃時不振搖則幾乎不融合。影響細胞融合的因素3.1細胞融合(cellfusion)(4)細胞融合過程中，通常耗氧量較大．缺氧時經(jīng)常不融合?？諝庵泻趿看笥?0％時有一定融合率，但有些細胞在無氧條件下也可融合。(5)有些細胞融合時需要Ca2+，否則不融合，細胞蛋白質(zhì)亦發(fā)生

變化。實驗表明Sr2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+等離子可代替Ca2+．但有效濃度較Ca2+大的多。融合時最適合的離子強度

一般為0.1mol/L(6)最適合的pH為7．4—7．8之間，在此范圍之外，融合率均較

低。3.1細胞融合(cellfusion)融合細胞的特征及其意義染色體組不穩(wěn)定，尤其種間雜交細胞,培養(yǎng)過程中染色體會逐漸丟失

3.1細胞融合(cellfusion)理論研究——基因定位和繪制基因圖工作中十分有用應用價值——單克隆抗體

植物育種3.1細胞融合(cellfusion)融合細胞類型同核體（homokaryon）異核體(heterokaryon）多核體（polykaryon）異胞質(zhì)體(heterocybrid)3.1細胞融合(cellfusion)

同核體(homokaryon)同源細胞的融合體。由于是同源細胞，它們的基因型及表現(xiàn)型完全一樣。3.1細胞融合(cellfusion)異核體(heterokaryon)

非同源細胞的融合體。一般是親源關系較近的細胞，這種親和雜種細胞含有雙親全部細胞核和細胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育的個體也是可育的，如煙草屬種間的細胞雜種。3.1細胞融合(cellfusion)多核體(polykaryon)

含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。親源關系較遠的細胞間融合，融合體以一個細胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細胞少量遺傳物質(zhì)，如胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細胞。3.1細胞融合(cellfusion)異胞質(zhì)體(heterocybrid)

不