食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)

食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)第1頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二第四章食品毒理學(xué)實驗基礎(chǔ)Chapter4ExperimentalBasisforFoodToxicology第2頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二本章內(nèi)容4.1常用實驗動物選擇和處理4.1.1

常用實驗動物特征4.1.2實驗動物的選擇和處理4.1.3

實驗動物的染毒和處置4.2食品毒理學(xué)試驗的設(shè)計原則4.2.1體外試驗涉及4.2.2

體內(nèi)毒理學(xué)試驗涉及4.3毒理學(xué)試驗結(jié)果處理和分析4.3.1

毒理學(xué)試驗的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法4.3.2

統(tǒng)計學(xué)意義和生物學(xué)意義第3頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二本章學(xué)習(xí)目的與要求掌握實驗動物的選擇原則和方法；熟悉實驗動物的常規(guī)處置、染毒方式、采樣和處死方法；了解常用實驗動物外貌、生活習(xí)性、生長發(fā)育和解剖生理特征。掌握食品毒理學(xué)實驗設(shè)計基本原則；熟悉毒理學(xué)試驗結(jié)果處理和分析方法。第4頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1常用實驗動物選擇和處理4.1.1

常用實驗動物特征實驗動物(laboratoryanimals)：經(jīng)人工飼育，對其攜帶的微生物實行控制，遺傳背景明確或者來源清楚的，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、檢驗以及其他科學(xué)實驗的動物?；蛘吆唵握f以科學(xué)研究為目的而進(jìn)行科學(xué)飼養(yǎng)繁殖的動物稱為實驗動物。實驗動物種類：常用的實驗動物物種為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞、青蛙等。第5頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二第6頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二第7頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.1常用實驗動物特征

常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)表

參數(shù)小鼠大鼠豚鼠兔成體體重(kg)0.0350.450.433.7平均壽命(年)1.534~58水消耗(ml/d)635145300飼料消耗(成本g/d)51012180成體代謝(cal/kg.d)600130100110體溫(℃)37.438.238.639.4呼吸頻率(次/min)160(80-240)85(65-110)90(70-100)53(40-65)心率(次/min)600328300200血壓mmHg(收縮/舒張)120/75130/9077/50110/80出生體重(g)1.55~675~100100斷乳時體重(g)

10-1240-50250100-1500第8頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.1

常用實驗動物特征

常用實驗動物生物學(xué)和生理學(xué)參數(shù)表（續(xù)）參數(shù)小鼠大鼠豚鼠兔開眼(d)1110～12出生當(dāng)天10妊娠(d)20216731性周期(d)4～54～516～1915～16動情期(d)11130窩數(shù)量1～126～91～51～13斷乳年齡(周)33～428生殖年齡(月)22～336～7生殖期(年)1131～3生殖季節(jié)任何時間任何時間任何時間任何時間環(huán)境溫度(℃)19～2519～2519～2518～28血容量(ML/Kg)80657553凝血時間(s)146060300HCT(％紅細(xì)胞)41464242Hb(g／bl)16.014.812.413.6第9頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2實驗動物的選擇和處理4.1.2.1實驗動物的選擇毒理學(xué)的動物實驗是以實驗動物作為研究對象，為獲得可靠的研究結(jié)果，先決條件是正確地選用實驗動物。實驗動物選擇原因：外源化學(xué)物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物之間表現(xiàn)不同，物種差別可以表現(xiàn)在量方面，引起毒性的劑量差別，即毒性大小的差別，如有報道，人對138種化學(xué)物的敏感性為大鼠的1.8-10.5倍。物種差別也可以表現(xiàn)在質(zhì)方面(毒性效應(yīng)的差別)，如除草劑百草枯對人引起肺損傷，而對狗則未見到。第10頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1實驗動物的選擇——選擇原則相似性原則：選擇結(jié)構(gòu)、功能、代謝、群體分布、疾病狀態(tài)方面與人類相似的物種。差異性原則：研究過程要求以差異為指標(biāo)或特殊條件時，選用不同種系實驗動物的某些特殊反應(yīng)，更適合于不同研究目的的要求。例如人類利用不同種屬動物對病原微生物的易感性差異來生產(chǎn)弱毒疫苗。易化性原則：進(jìn)化程度高、結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜的動物有時會給實驗條件控制或?qū)嶒灲Y(jié)果分析帶來困難，則應(yīng)從易化角度入手，選擇既能滿足實驗要求，結(jié)構(gòu)功能又簡單，便于實驗分析的動物。如反射弧的研究選擇兩棲動物；遺傳學(xué)研究選擇果蠅。第11頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1實驗動物的選擇——選擇原則相容或相匹配原則：設(shè)計動物實驗時，選用的動物質(zhì)量等級要與實驗設(shè)計、實驗條件、實驗者技術(shù)、方法、試劑性能相匹配?？色@得性原則：在不影響實驗質(zhì)量的前提下，選擇最易獲得、最經(jīng)濟(jì)、易飼養(yǎng)管理的動物。重復(fù)性和均一性原則：選用標(biāo)準(zhǔn)化的實驗動物。杜絕使用隨意交配而來的雜種動物和未經(jīng)任何微生物控制的非標(biāo)準(zhǔn)化動物。第12頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1

實驗動物的選擇——選擇方法物種選擇物種選擇的基本原則選擇對受試物在代謝、生物化學(xué)和毒理學(xué)特征與人最接近的物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；經(jīng)濟(jì)并易于獲得的物種。目前常規(guī)選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。第13頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1

實驗動物的選擇——選擇方法系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠，非嚙齒類是狗；豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗；兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗；遺傳毒理學(xué)試驗多用小鼠；致癌試驗常用大鼠和小鼠；致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔；遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。第14頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二品系選擇

品系是實驗動物學(xué)的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。

實驗動物按遺傳學(xué)控制分類可分為：

①近交系：指同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。群體基因才能達(dá)到純合和基本穩(wěn)定。

②雜交群動物(雜交1代)，指兩個不同的近交系之間有目的進(jìn)行交配，所產(chǎn)生的第一代動物。

③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機(jī)交配繁殖的動物群。

根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。

4.1.2.1實驗動物的選擇——選擇方法第15頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1

實驗動物的選擇——選擇方法實驗動物微生物控制的選擇對于毒性試驗及毒理學(xué)研究應(yīng)盡可能使用Ⅱ級(或Ⅱ級以上)的動物，以保證實驗結(jié)果的可靠性。級別要求I

級普通動物，應(yīng)沒有傳染給人的疾?、蚣壡鍧崉游?，除I級標(biāo)準(zhǔn)外，種系清楚，沒有該動物特有的疾?、蠹墴o特定病原體動物(SPF)，除Ⅱ級標(biāo)準(zhǔn)外，動物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病細(xì)菌叢，沒有致病病原體IV級無菌動物，在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物，動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(包括絕大部分病毒)第16頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1

實驗動物的選擇——選擇方法

實驗動物對外來化學(xué)物的毒性反應(yīng)還存在個體差異，應(yīng)注意實驗動物的個體選擇。重點(diǎn)是動物的性別、年齡、體重、生理狀態(tài)和健康狀況。對于初次試驗的受試物，應(yīng)該采用兩種性別。毒理學(xué)試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。急性試驗一般選用成年動物；慢性試驗因?qū)嶒炛芷陂L，應(yīng)選用較年幼的或初斷乳的動物，以使實驗周期能復(fù)蓋成年期。實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡。性激素對外源化學(xué)物代謝轉(zhuǎn)化有影響，故應(yīng)選用未產(chǎn)未孕的雌性動物。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及繁殖試驗等，則需有計劃地合籠交配。為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察5-7天。第17頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.1

實驗動物的選擇——選擇方法大、小鼠根據(jù)形態(tài)鑒定日齡（大、小情況基本一樣）第18頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二第19頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.2

實驗動物的處理1.健康檢疫實驗動物在購進(jìn)之后，應(yīng)雌雄分開飼養(yǎng)。一般應(yīng)進(jìn)行5-7天的檢疫，在此期間應(yīng)多次觀察動物，及時剔除不健康的動物。

2.實驗動物的抓取和固定方法3.性別鑒定4.實驗動物的編號和標(biāo)記方法實驗動物的標(biāo)記方法對嚙齒動物常用染色法，可用苦味酸(黃色)、品紅(紅色)的酒精飽和溶液在動物被毛上染色。對嚙齒動物還可用剪耳法標(biāo)記。對狗等大動物一般用掛牌法。

5.實驗動物被毛去除方法剪毛、拔毛、剃毛、脫毛（如硫化鈉或硫化鋇）6.實驗動物的麻醉第20頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.2

實驗動物的處理

2.實驗動物的抓取和固定方法小鼠用右手提起小鼠尾部，放在實驗臺上，當(dāng)其向前爬行時，左手抓住兩耳及頭頸部皮膚，再置小鼠于左手心，拉直四肢并用手指夾住肢體固定。右手可行注射或其它操作。

大鼠右手輕輕抓住大鼠尾部向后輕拉，左手抓緊鼠兩耳及頭頸部皮膚，并將其固定在左手中，右手可行注射或其它操作。第21頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.2

實驗動物的處理

2.實驗動物的抓取和固定方法兔1、可傷兩腎；2、可造成皮下出血；3、可傷兩耳；4、頸部皮膚厚可抓；5、用手拖住身體。4和5為正確的方法。豚鼠先用手掌以穩(wěn)準(zhǔn)的手法迅速扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，將手張開，用手指握住頸部，或握住身體的四周，再拿起來。懷孕或體重較大的豚鼠，應(yīng)以另手托其臀部。第22頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.2實驗動物的處理

4.實驗動物的編號和標(biāo)記方法染色法第23頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.2.2

實驗動物的處理

4.實驗動物的編號和標(biāo)記方法耳朵標(biāo)記方法第24頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3

實驗動物的染毒和處置4.1.3.1實驗動物染毒毒理學(xué)試驗中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人在接觸該受試物的方式。最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射＞吸入＞肌肉注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經(jīng)口＞皮內(nèi)注射＞其他途徑(如經(jīng)皮等)。

第25頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3.1

實驗動物染毒1.經(jīng)口(胃腸道)染毒常用有喂飼、灌胃和吞咽膠囊等方式。(1)喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。優(yōu)點(diǎn)：簡單易行，符合人類接觸受試物的實際情況。缺點(diǎn)：如適口性差的受試物，動物拒食，攝入量達(dá)不到設(shè)計劑量；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。實驗動物應(yīng)單籠喂飼，以食物消耗量計算其實際染毒劑量。

第26頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3.1實驗動物染毒——經(jīng)口(胃腸道)染毒(2)灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時(因小鼠消化吸收和代謝速度較快)，均不停飲水。灌胃后2～4小時提供飼料。經(jīng)口多次染毒，一般不禁食，但應(yīng)每日定時染毒。灌胃法優(yōu)點(diǎn)是劑量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。

(3)吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至動物的舌后部，迫使動物咽下，此法劑量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。缺點(diǎn)是動物有咬傷人的危險。第27頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3.1實驗動物染毒2.經(jīng)呼吸道染毒經(jīng)呼吸道染毒可分為吸入染毒和氣管內(nèi)注入。

(1)靜式吸入染毒：將一定數(shù)量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。染毒簡易；但缺點(diǎn)較多，主要是隨試驗進(jìn)行氧分壓降低(因此，實驗動物數(shù)量有限制)，柜內(nèi)受試物濃度也逐漸下降(由于動物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且實驗動物有經(jīng)皮吸收的可能。第28頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3.1實驗動物染毒——經(jīng)呼吸道染毒(2)動式吸入染毒：由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成。優(yōu)點(diǎn)是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定；缺點(diǎn)是消耗受試物的量大，并易于污染環(huán)境。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。動式吸入染毒柜中受試物的濃度應(yīng)實際監(jiān)測。(3)氣管內(nèi)注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。第29頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3.1

實驗動物染毒3.經(jīng)皮膚染毒將受試動物皮膚表面涂抹一定量的受試物，再用紗布和塑料薄膜蓋上，用膠布固定，接觸規(guī)定的時間。經(jīng)皮膚染毒的目的有兩種：一種是經(jīng)皮染毒毒性試驗，如經(jīng)皮LD50測定常用大鼠，皮膚致癌試驗常用小鼠。另一種是皮膚刺激和致敏試驗，皮膚刺激試驗常用兔和豚鼠，皮膚致敏試驗用豚鼠。第30頁，共33頁，2023年，2月20日，星期二4.1.3.1