A細(xì)胞工程-原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交3課件

第六章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交第六章植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交主要內(nèi)容：第一節(jié)原生質(zhì)體的分離和純化第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)第三節(jié)植物體細(xì)胞雜交

學(xué)習(xí)的目標(biāo)與要求：掌握植物細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義，了解原生質(zhì)分離方法，原生質(zhì)純化方法和活力測(cè)定方法。掌握原生質(zhì)體融合概念、介紹原生質(zhì)體融合方法，了解雜種細(xì)胞的篩選、鑒定和雜種植株的鑒定方法。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

原生質(zhì)體的概念

植物原生質(zhì)體(protoplast):指將植物細(xì)胞壁去掉后得到的裸露的球形細(xì)胞原生質(zhì)體的特性去壁的原生質(zhì)體容易實(shí)現(xiàn)外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入和吸收。原生質(zhì)體具有細(xì)胞全能性。不同來(lái)源的原生質(zhì)體具有彼此融合的能力。原生質(zhì)體培養(yǎng)將植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜的培養(yǎng)條件下，使其再生細(xì)胞壁，進(jìn)行經(jīng)過(guò)培養(yǎng)成完成植株植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體的生物學(xué)意義細(xì)胞原生質(zhì)體酶解體細(xì)胞融合遺傳轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)顯微操作基因槍導(dǎo)入原生質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)再生植株植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

體細(xì)胞雜交(somatichybridization)又稱為原生質(zhì)體融合(protoplastfusion),是指在人工控制條件下，不經(jīng)過(guò)有性過(guò)程，兩種體細(xì)胞原生質(zhì)體相互融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，并使之分化再生,形成新物種或新品種的技術(shù)。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞的融合過(guò)程一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離1)材料來(lái)源植物幼嫩的葉片無(wú)菌實(shí)生苗的子葉和下胚軸外植體來(lái)源的愈傷組織和懸浮細(xì)胞系花粉細(xì)胞2)材料的預(yù)處理

用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離3)酶的種類及酶液配制

原生質(zhì)體分離常用的商品酶一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離4)分離方法原生質(zhì)體分離的方法機(jī)械分離法酶解分離法一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離4)分離方法機(jī)械分離法：先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點(diǎn)：該方法可避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞作用。一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離4)分離方法

酶解分離法：指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。常用的酶種類：纖維素酶類（纖維素酶、半纖維素酶、崩潰酶[Driselase]）、果膠酶類（果膠酶和離析酶[Macerozyme]）、蝸牛酶和胼胝質(zhì)酶。一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離4)分離方法酶解分離法優(yōu)點(diǎn)：獲得量大，適用廣泛。缺點(diǎn)：商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過(guò)氧化物酶以及酚類物質(zhì)會(huì)影響所獲原生質(zhì)體的活力一、原生質(zhì)體的分離和純化1.原生質(zhì)體的分離4)分離方法Principlestepsinenzymaticisolation一、原生質(zhì)體的分離和純化2.原生質(zhì)體的純化1)過(guò)濾-離心法2)漂浮法3)界面法一、原生質(zhì)體的分離和純化2.原生質(zhì)體的純化1)過(guò)濾-離心法利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過(guò)濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。

優(yōu)缺點(diǎn)：純化原生質(zhì)體比較簡(jiǎn)單。由于原生質(zhì)體沉積于試管底部，造成相互擠壓，常引起原生質(zhì)體的破碎。一、原生質(zhì)體的分離和純化2.原生質(zhì)體的純化3)

界面法又稱不連續(xù)梯度法，采用兩種密度不同的溶液形成不連續(xù)梯度，通過(guò)離心使原生質(zhì)體與破損細(xì)胞分別處于不同液相中，從而純化原生質(zhì)體的方法。

優(yōu)點(diǎn)：可以收集到數(shù)量較大的純凈原生質(zhì)體，同時(shí)避免收集過(guò)程中原生質(zhì)體因相互擠壓而破碎。一、原生質(zhì)體的分離和純化2.原生質(zhì)體的純化加培養(yǎng)基使原生質(zhì)體密度為104－106/mL原生質(zhì)體混合液收集濾液去上清洗液重懸原生質(zhì)體培養(yǎng)基重懸原生質(zhì)體去上清40-100μm過(guò)濾500rpm1-5min500rpm1-5min重復(fù)3次500rpm1-5min去上清重復(fù)3次一、原生質(zhì)體的分離和純化3.原生質(zhì)體活力測(cè)定1)形態(tài)識(shí)別形態(tài)完整、富含細(xì)胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。一、原生質(zhì)體的分離和純化3.原生質(zhì)體活力測(cè)定2)染色法

酚藏花紅染色法（0.1%)：酚藏花紅能使無(wú)活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。

伊凡藍(lán)(Evan’sblue)染色法(0.025%)：有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取。

細(xì)胞質(zhì)環(huán)流法和氧電極法

一、原生質(zhì)體的分離和純化4.影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素供試材料的基因型和外植體酶的種類、濃度與酶解時(shí)間滲透壓穩(wěn)定劑質(zhì)膜穩(wěn)定劑酶解方式pH濕度和光照二、原生質(zhì)體培養(yǎng)1.原生質(zhì)體培養(yǎng)方法1)液體淺層培養(yǎng)

優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強(qiáng)的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。操作簡(jiǎn)單，對(duì)原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。

缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步的生長(zhǎng)和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)1.原生質(zhì)體培養(yǎng)方法2)固體平板培養(yǎng)

優(yōu)點(diǎn)：使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動(dòng)，有利于對(duì)單個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞壁再生及細(xì)胞團(tuán)形成的全過(guò)程進(jìn)行定點(diǎn)觀察。

缺點(diǎn)：培養(yǎng)基溫度對(duì)薄層質(zhì)量和原生質(zhì)體分布有一定影響；另外，固體中單細(xì)胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細(xì)胞分裂時(shí)間會(huì)推遲2d左右。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)1.原生質(zhì)體培養(yǎng)方法3)液體-固體雙層培養(yǎng)法

優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。

缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)2.植株再生過(guò)程植株(原生質(zhì)體)再生過(guò)程是指分離、純化的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法和良好的培養(yǎng)條件下，很快恢復(fù)細(xì)胞壁，再生細(xì)胞持續(xù)分裂形成細(xì)胞團(tuán)，最后或通過(guò)愈傷組織或通過(guò)胚狀體分化出完整植株的過(guò)程。細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂植株再生二、原生質(zhì)體培養(yǎng)2.植株再生過(guò)程細(xì)胞壁再生再生所需時(shí)間與植物種類和起源細(xì)胞的分化程度及生理狀態(tài)有關(guān)。再生過(guò)程：先是質(zhì)膜合成細(xì)胞壁主要成分微纖維，然后在質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用，形成多片層的結(jié)構(gòu)，以后在質(zhì)膜和片層結(jié)構(gòu)之間或在膜上產(chǎn)生小纖維絲，逐漸形成不定向的纖維團(tuán)，最后形成完整的細(xì)胞壁。細(xì)胞壁再生是細(xì)胞分裂的先決條件二、原生質(zhì)體培養(yǎng)2.植株再生過(guò)程

細(xì)胞分裂植株再生植株再生有兩種途徑：通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)器官形成途徑通過(guò)誘導(dǎo)胚狀體途徑二、原生質(zhì)體培養(yǎng)3.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素材料培養(yǎng)基滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體的培養(yǎng)密度培養(yǎng)條件二、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)與植株再生(動(dòng)畫)二、原生質(zhì)體培養(yǎng)4.原生質(zhì)體培養(yǎng)的操作實(shí)例7a:分離原生質(zhì)體10天后第1次分裂7b,c:2和3周齡小細(xì)胞團(tuán)7d,e:4和6周齡小愈傷組織7f:轉(zhuǎn)到B5h培養(yǎng)基前8周齡小愈傷組織8a:轉(zhuǎn)到B5H培養(yǎng)基上的小愈傷組織和體細(xì)胞胚誘導(dǎo)8b:轉(zhuǎn)到Boi2y培養(yǎng)基上的球形胚8c:轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基上的子葉期胚以轉(zhuǎn)化為小植株紫花苜蓿葉片原生質(zhì)體分裂、克隆體的發(fā)育及通過(guò)體細(xì)胞胚再生小植株三、植物體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)(動(dòng)畫)三、植物體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交

兩種異源（種、屬間）原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互接觸從而發(fā)生膜融合，胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的過(guò)程。體細(xì)胞雜交的意義實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，形成新的物種創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雜種培育作物新種質(zhì)和新品種三、植物體細(xì)胞雜交生物種類細(xì)胞來(lái)源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽牛——龍面花大麥——花生大麥——大豆小麥——矮牽牛油菜——大豆玉米——大豆大豆——野豌豆大麥——蠶豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙番茄——馬鈴薯葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉葉——根尖1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972三、植物體細(xì)胞雜交1.原生質(zhì)體融合的類型1)自發(fā)融合同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)2個(gè)靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合；2)誘發(fā)融合指將植物原生質(zhì)體制備出來(lái)后，再加入誘導(dǎo)劑或用其他方法促使兩親本原生質(zhì)體融合的方法。三、植物體細(xì)胞雜交1.原生質(zhì)體融合的類型(動(dòng)畫)三、植物體細(xì)胞雜交2.原生質(zhì)體融合的方法1)化學(xué)誘導(dǎo)融合利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)融合法高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法PEG誘導(dǎo)融合法PEG-高pH-高Ca2+誘導(dǎo)融合法

2)電誘導(dǎo)融合法

利用改變電場(chǎng)來(lái)誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此連接成串，再施以瞬間強(qiáng)脈沖使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿而使原生質(zhì)體融合的方法。三、植物體細(xì)胞雜交2)電誘導(dǎo)融合法(動(dòng)畫)三、植物體細(xì)胞雜交3.體細(xì)胞雜種的篩選及再生植株鑒定1)雜種細(xì)胞的篩選

互補(bǔ)選擇法抗性互補(bǔ)選擇法營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇法生長(zhǎng)互補(bǔ)選擇法細(xì)胞代謝互補(bǔ)選擇法機(jī)械選擇法2)再生植株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、同工酶鑒定、分子生物學(xué)鑒定三、植物體細(xì)胞雜交4.體