中國藥科大學生化設(shè)計性實驗報告參考-菠蘿蛋白酶的提取和活力測定課件

從菠蘿中提取菠蘿蛋白酶微生物09301班第三實驗小組成員：徐雨婷楊洋劉楊何威劉鄂龍一、實驗目的

1、掌握從原料物中提取分離目的蛋白酶；

2、掌握對目的蛋白酶質(zhì)量的檢驗；

3、學習酶比活力的計算；二、實驗基本原理

菠蘿蛋白酶是一種具有消炎，抗水腫作用的疏基酶，能分解蛋白質(zhì)、酯和酞胺。菠蘿蛋白酶一般從菠蘿汁或菠蘿廢皮中提取，為淺黃色無定形粉末，分子量33000，微有異臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等電點9.55。本實驗先從新鮮的菠蘿汁中使用有機酸（單寧）沉淀法提取出菠蘿蛋白酶，然后通過考馬斯亮藍法測定酶制品中菠蘿蛋白酶的總量，最后菠蘿蛋白酶將酪蛋白水解產(chǎn)生酪氨酸，通過在275nm波長下測定吸光度的變化，可以測得菠蘿蛋白酶的活力。三、實驗材料和試劑

1、實驗材料

新鮮菠蘿(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白

2、實驗試劑檸檬酸鈉維生素c單寧0.1%EDTA溶液1.5%氯化鈉溶液1%酪蛋白溶液1mol/L氫氧化鈉溶液0.05mol/L磷酸緩沖液（溶解磷酸二氫鉀，加氫氧化鉀調(diào)PH至7.0）激活劑（PH7.0，0.05mol/L磷酸緩沖液，內(nèi)含15mmol/L硫代硫酸鈉和6mmol/LEDTA-2Na,現(xiàn)配現(xiàn)用）五、實驗操作方法法和步驟（一）從菠蘿中提取菠蘿蛋白酶操作步驟：將菠蘿切碎加檸檬酸鈉，榨汁菠蘿汁紗布過濾澄清液2000r/min，7min離心上清液沉淀物酶復合物酶復合物沉淀加Vc,0.2%單寧溶液攪拌15min,靜置40min4200r/min,5min離心加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化鈉液4200r/min,5min離心加適量1.5%氯化鈉溶液，4000r/min,7min離心凍存?zhèn)溆茫ǘ┛捡R斯亮藍法測定酶制品中蛋白酶含量1、標準曲線的制作按下表操作根據(jù)上表，以吸光度為縱坐標，標準蛋白質(zhì)量為橫坐標作圖根據(jù)線性擬合關(guān)系y=6.2357x,計算蛋白酶的質(zhì)量（三）菠蘿蛋白酶活力的測定1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸緩沖液（PH7.0)至10ml,離心得上清液；2、取5支試管，分別標號1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活劑；3、另取5支試管，分別對應(yīng)標號、、、、，各加1ml緩沖液和0.9ml激活劑；4、將10支試管置于37℃水??；5、然后按下表操作（四）數(shù)據(jù)的處理1、由線性關(guān)系y=6.2357x，可以計算酶制品中蛋白酶的總質(zhì)量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg2、菠蘿蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg4、提取率=0.1123mg/0.735kg=0.00001528%（五）結(jié)果討論從上述結(jié)果可知菠蘿蛋白酶的比活力較低，可能的原因有：1、所加入的有機酸單寧的量對菠蘿蛋白酶沉淀有的影響；2、在實驗中是否把單寧溶液弄混而導致菠蘿蛋白酶很少沉淀析出；3、菠蘿蛋白酶對熱不穩(wěn)定，試驗中溫度的控制是否合理；4、在活力測定的步驟中所加入的酪蛋白的量不足，導致結(jié)果偏低；5、在活力的測定步驟中，設(shè)置了幾個梯度，最后的結(jié)果中應(yīng)該有至少兩支