生化藥物分析及生物檢定技術(shù)

生化藥物分析及生物檢定技術(shù)第1頁/共106頁一、生化藥物分析的特點(diǎn)1、分子量不確定性(1)只有氨基酸、核苷酸、輔酶、甾體激素等化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子化合物，分子量確定。(2)大多分子量不確定，結(jié)構(gòu)不確定因此，生化藥物常需進(jìn)行純度及分子量測定。第2頁/共106頁2、分析項(xiàng)目的特殊性(1)除采用理化法分析外,尚需用生物檢定法進(jìn)行檢定,以證實(shí)其生物活性(2)因易引入雜質(zhì)，常需做熱源、熱敏、異常毒性、安全性試驗(yàn)(3)多用含量測定表示主藥含量，但酶類需進(jìn)行效價(jià)/酶活力測定，來表示有效成分含量。第3頁/共106頁3、分析方法的多樣性如：理化、生化、生物檢定法等。第4頁/共106頁二、生化藥物分析的方法1、鑒別(1)化學(xué)反應(yīng)法(2)UV(3)酶法：如尿激酶-蛋白水解酶(4)電泳法：如肝素-糖凝膠電泳法(5)生物法：利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)第5頁/共106頁2、雜質(zhì)檢查

(1)一般雜質(zhì)

(2)特殊雜質(zhì)3、安全性檢查

(1)熱原檢查：由微生物所分泌的某一種代謝產(chǎn)物，一般以為是內(nèi)毒素，能使恒溫動(dòng)物體溫升高。方法：家兔法/鱟試劑第6頁/共106頁(2)異常毒性試驗(yàn)用一定劑量藥物按指定的操作方法和給藥途徑給規(guī)定體重的試驗(yàn)動(dòng)物，觀察其急毒反應(yīng)(是否死亡)，是一個(gè)限度試驗(yàn)。異常毒性試驗(yàn)出現(xiàn)：主要取決于供試品在生產(chǎn)中是否引入，可發(fā)生異常毒性雜質(zhì)。第7頁/共106頁(3)過敏試驗(yàn)檢異性蛋白試驗(yàn)----引起多種過敏反應(yīng)輕:皮膚產(chǎn)生紅斑/丘疹過敏重:窒息、發(fā)紺、血管神經(jīng)性水腫血壓降低、休克、死亡。第8頁/共106頁(4)降壓物質(zhì)檢查指藥物中含有能導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其他物質(zhì)。來源：用動(dòng)物臟器/組織制備時(shí)，在正常組織中存在。方法：貓/狗血壓法檢藥物中所含降壓物質(zhì)。第9頁/共106頁(5)無菌檢查對藥物及敷料是否染有活菌的檢查。由于許多生化藥物不能高溫滅菌，故檢查此項(xiàng)。第10頁/共106頁4、含量/效價(jià)測定表示方法：

(1)含量百分比：適用于化學(xué)結(jié)構(gòu)明確小分子/經(jīng)水解后變成小分子藥物。

(2)生物效價(jià)/酶活力單位表示，適于酶類、蛋白質(zhì)類。第11頁/共106頁常用方法：(1)酶法(2)電泳法(3)生物檢定法(4)理化法第12頁/共106頁(1)酶法①酶活力測定法：

a.終點(diǎn)法：單酶反應(yīng)定量法指示酶反應(yīng)偶聯(lián)定量法

b.取樣測定法

c.連續(xù)測定法②酶分析法：

a.動(dòng)力學(xué)分析法

b.總變量分析法第13頁/共106頁(2)電泳法①自由界面電泳法②高效毛細(xì)管電泳法③區(qū)帶電泳法

a.紙電泳法

b.醋酸纖維素薄膜電泳法

c.聚丙烯酰胺凝膠電泳法

d.十二烷基硫酸鈉(SDS)

聚丙烯酰胺凝膠電泳法第14頁/共106頁(3)生物檢定法是利用藥物對生物體的作用以測定其效價(jià)或生物活性的一種方法。以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過供試品和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谝欢l件下比較產(chǎn)生特定生物反應(yīng)的劑量比例，來測得供試品的效價(jià)。第15頁/共106頁(4)理化法①重量法

a.提取法

b.揮發(fā)法

c.沉淀法②測定法③比色法④UV第16頁/共106頁⑤高效凝膠過濾色譜法

a.分離根據(jù)有效粒徑

b.分離在固定比例水液中

c.活性蛋白可回收第17頁/共106頁⑥高效離子交換色譜法

a.分離根據(jù)離子化濃度

b.分離鹽濃度增大的梯度洗脫法

c.分離在陽/陰離子交換間呈現(xiàn)差異大

d.柱效中等并具高質(zhì)量的活性回收第18頁/共106頁三、生化藥物分析進(jìn)展總體向理化/儀器分析發(fā)展如：GC、HPLC、UV、TR、質(zhì)譜、磁共振、超離技術(shù)、放射免疫、酶試劑、酶電極檢測等。另，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)，對生化藥的活力和效價(jià)檢測。單克隆體免疫分析技術(shù)及基因分析技術(shù)，提高檢測限量和靈敏度。第19頁/共106頁生物檢定技術(shù)第一節(jié)微生物限度檢查第20頁/共106頁一、定義微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。第21頁/共106頁二、檢查方法藥品微生物限度檢查采用活菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法包括：平皿法、薄膜過濾法。第22頁/共106頁一、平皿法1．設(shè)備、儀器及用具無菌室、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱(室)、勻漿儀、恒溫水浴箱、電熱干燥箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、菌落計(jì)數(shù)器(JLQ-ST或JLQ-S2型)、顯微鏡(1500×)、天平(感量0.1g)、錐形瓶、研缽(直徑10～12mm)、培養(yǎng)皿(直徑90mm)、量筒、試管及塞子、吸量管(1mL、10mL)、載玻片、蓋玻片、玻璃或搪瓷消毒缸(帶蓋)、大橡皮乳頭、小橡皮乳頭、無菌衣、無菌褲、無菌帽、無菌口罩(也可用一次性物品替代)、接種環(huán)、酒精燈(乙醇燈)、乙醇棉球、滅菌剪刀及鑷子、滅菌稱樣紙及不銹鋼藥勺、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆等。玻璃器皿均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽滅菌12l℃20min，烘干備用。第23頁/共106頁一、平皿法2．試劑稀釋劑(pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液)、聚山梨酯80、無菌斯盤80、單硬脂酸甘油酯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)。第24頁/共106頁一、平皿法3．試驗(yàn)前的準(zhǔn)備無菌室使用前開啟紫外燈和空氣過濾裝置，至少30min；將所需已滅菌或消毒的用品按無菌操作技術(shù)要求移至無菌操作室；操作人員按要求穿戴無菌服，進(jìn)入無菌操作室；操作前，先用乙醇棉球消毒手，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用無菌的手術(shù)剪刀將供試品瓶、盒、袋啟封。啟封后先仔細(xì)檢查瓶蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍有無生霉長螨的跡象，對肉眼可見疑似者用放大鏡和顯微鏡觀察，若證實(shí)為生霉、長螨，即可判定為不合格，無需繼續(xù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)量：一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10mL，化學(xué)膜劑為100cm2，檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑不得少于4片。一般隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量的3倍量供試品。第25頁/共106頁一、平皿法4．藥品的預(yù)處理供試液制備若需水浴加溫時(shí)，溫度不超過45℃，從制備到加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基不得超過1h。

(1)液體供試液一般取供試品10mL，加入稀釋劑90mL中，充分振搖，即可作為l∶10供試液；含王漿或蜂蜜的合劑、滴眼劑可以原液作為供試液；油劑可加入適量聚山梨酯80，再照上法制備成供試液；氣霧劑可以適宜方法使拋射劑導(dǎo)出后，加入適量稀釋劑，混勻，吸取相當(dāng)于10g或10mL供試品，再稀釋至100mL，作為供試液。第26頁/共106頁一、平皿法4．藥品的預(yù)處理(2)固體、半固體或黏稠液供試品①一般取供試品取10g，置pH7.0無菌氧化鈉一蛋白胨緩沖溶液100mL中，用勻漿儀或其他適宜方法，混勻后制備成1∶10供試液。②非水溶性供試品取供試品5g(5mL)，加入含溶化的無菌斯盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45℃左右的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液至100mL，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液(1∶20)。也可以取供試品10g，加至含20mL無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的適宜容器中，充分振搖，使其溶解，然后加入45℃左右的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液100mL，振搖5～10min，萃取，靜置，取水層作為1∶10供試液。。第27頁/共106頁一、平皿法4．藥品的預(yù)處理(2)固體、半固體或黏稠液供試品③不溶于水的膜劑供試品取100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液100mL(必要時(shí)可增加稀釋劑)，浸泡，振搖，作為供試液。④腸溶膠囊(片)供試品稱取供試品10g，置含pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液100mL的錐形瓶內(nèi)，于45℃水浴中，保濕，振搖，使溶解作為供試液。第28頁/共106頁一、平皿法4．藥品的預(yù)處理

(3)含抑菌成分供試品當(dāng)供試品對控制菌的檢查有干擾時(shí)，需根據(jù)供試品的不同情況，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行處理，以消除抑菌成分的干擾。常用的處理方法有以下幾種。①培養(yǎng)基稀釋法將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。②離心沉淀集菌法取規(guī)定量的供試液，離心(3000r/min)30min，棄去上清液，留底部集菌液約2mL，再稀釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心(500r/min)5min，取全部上層液，再進(jìn)行集菌處理。第29頁/共106頁一、平皿法4．藥品的預(yù)處理

(3)含抑菌成分供試品當(dāng)供試品對控制菌的檢查有干擾時(shí)，需根據(jù)供試品的不同情況，適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行處理，以消除抑菌成分的干擾。常用的處理方法有以下幾種。③薄膜過濾法取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100mL中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45μm±0.02μm微孔濾膜的過濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜3次，每次50～100mL，取出濾膜備檢。④中和法凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化活性因子，中和毒性后制成供試液。第30頁/共106頁一、平皿法5．細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(1)供試液制備按各類制劑制備供試液的方法制備成1∶10的供試液。

(2)稀釋(10倍遞增稀釋法)取2～3支滅菌試管，分別加入9mL稀釋劑，并取1支1mL滅菌吸量管吸取1∶10均勻供試液1mL，加入已備妥的裝有9mL滅菌稀釋劑的試管中，混勻即成1∶100的供試液。以此類推，稀釋至1∶1000或l∶10000。第31頁/共106頁一、平皿法5．細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(3)吸樣根據(jù)供試品污染程度，分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液，一般取1∶10、l∶100、l∶1000三級稀釋液檢驗(yàn)。每級稀釋液用1mL滅菌吸量管吸取稀釋液，分別注入2～3個(gè)平皿各1mL。另取1支1mL吸量管吸取稀釋劑各1mL注入2個(gè)平皿中，作為陰性對照，應(yīng)不得有菌生長。操作時(shí)，應(yīng)特別注意每次吸液前必須使稀釋液充分混勻，以使菌體充分均勻分散，降低測定誤差。

(4)傾注培養(yǎng)基事先將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基熔化，冷至低于45℃時(shí)，注入上述各平皿，每皿15～20mL，快速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。第32頁/共106頁一、平皿法5．細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(5)培養(yǎng)將已凝固的平板倒置，放入30～35℃培養(yǎng)箱(室)中，培養(yǎng)48h。

(6)菌落計(jì)數(shù)由于細(xì)菌種類繁多，形成的菌落大小、形狀、色澤、透明度等皆因種而異，差別甚大。計(jì)數(shù)時(shí)一般用肉眼直接計(jì)數(shù)、標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，必要時(shí)借助放大鏡或顯微鏡。不要漏計(jì)瓊脂層內(nèi)和平板邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與藥渣或培養(yǎng)基的沉淀物、酵母菌及霉菌菌落的區(qū)別。第33頁/共106頁一、平皿法5．細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(7)結(jié)果報(bào)告菌數(shù)報(bào)告：選擇菌落數(shù)在30～300之間的稀釋級平板計(jì)數(shù)，以該稀釋級的平均平板菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)作為報(bào)告菌數(shù)；若鄰近的2個(gè)稀釋級平均平板菌落數(shù)均在30～300之間，計(jì)算級間比值，當(dāng)比值≤2時(shí)，以2級菌落數(shù)的平均值為報(bào)告菌落數(shù)，比值大于2但不超過5時(shí)，按低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)。當(dāng)比值大于5時(shí)，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)重新驗(yàn)證；各稀釋級平均菌落數(shù)均不足30時(shí)，以最低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)；如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)的值為報(bào)告菌數(shù)。第34頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(1)培養(yǎng)基、稀釋劑①培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)。該培養(yǎng)基更適合于酵母菌生長，故《中國藥典》規(guī)定含有王漿、蜂蜜的合劑用它測定酵母菌數(shù)。②稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶液，pH6.8磷酸鹽緩沖液。第35頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(2)操作方法霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細(xì)菌數(shù)測定同時(shí)進(jìn)行，按規(guī)定取2個(gè)以上包裝的供試品。①供試液制備按各類制劑制備供試液的方法制備成1∶10的供試液。②稀釋(10倍遞增稀釋法)取2～3支滅菌試管，分別加入9mL稀釋劑，并取1支1mL滅菌吸量管吸取1∶10均勻供試液1mL，加入已備妥的裝有9mL滅菌稀釋劑的試管中，混勻即成1∶100的供試液。以此類推，稀釋至l∶1000或1∶10000。第36頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(2)操作方法霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細(xì)菌數(shù)測定同時(shí)進(jìn)行，按規(guī)定取2個(gè)以上包裝的供試品。③吸樣根據(jù)供試品污染程度，分別取連續(xù)3級10倍稀釋的供試液，一般取1∶10、1∶100、1∶10003級稀釋液檢驗(yàn)。每級稀釋液用1mL滅菌吸量管吸取稀釋液，分別注入2～3個(gè)平皿各1mL。另取1支1mL吸量管吸取稀釋劑各1mL注入2個(gè)平皿中，作為陰性對照，應(yīng)不得有菌生長。操作時(shí)，應(yīng)特別注意每次吸液前必須使稀釋液充分混勻，以使菌體充分均勻分散，降低測定誤差。第37頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(2)操作方法霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細(xì)菌數(shù)測定同時(shí)進(jìn)行，按規(guī)定取2個(gè)以上包裝的供試品。④傾注培養(yǎng)基事先將玫瑰紅鈉培養(yǎng)基熔化，冷至低于45℃時(shí)，注入上述各平皿。每皿約15~20mL，含王漿、蜂蜜的合劑另做一套平板，傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，快速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使稀釋液與培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。⑤培養(yǎng)將已凝固的平板倒置，放入23～28℃培養(yǎng)箱(室)中，培養(yǎng)72h，必要時(shí)可適當(dāng)延長時(shí)間至5～7天。第38頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(2)操作方法霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細(xì)菌數(shù)測定同時(shí)進(jìn)行，按規(guī)定取2個(gè)以上包裝的供試品。⑥菌落計(jì)數(shù)一般在平板背面用肉眼直接點(diǎn)數(shù)，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。固體制劑在玫瑰紅鈉瓊脂平板上點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)，液體制劑在玫瑰紅鈉瓊脂平板上同時(shí)點(diǎn)計(jì)霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)，含王漿或蜂蜜的合劑須以玫瑰紅鈉平板的霉菌菌落數(shù)加上酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂平板上的酵母菌菌落數(shù)作為供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)。第39頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(2)操作方法霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細(xì)菌數(shù)測定同時(shí)進(jìn)行，按規(guī)定取2個(gè)以上包裝的供試品。⑦菌數(shù)報(bào)告選擇菌落數(shù)在30～100之間的稀釋級平板計(jì)數(shù)，以該稀釋級的平均平板菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)作為報(bào)告菌數(shù)；若鄰近的2個(gè)稀釋級平均平板菌落數(shù)均在30～100之間，計(jì)算級間比值。當(dāng)比值≤2時(shí)，以2級菌落數(shù)的平均值為報(bào)告菌落數(shù)；比值大于2但不超過5時(shí)，按低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)比值大于5時(shí)，或高稀釋級的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)重新驗(yàn)證；各稀釋級平均菌落數(shù)均不足30時(shí)，以最低稀釋級平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)為報(bào)告菌數(shù)；如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于l時(shí)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)的值為報(bào)告菌數(shù)。。第40頁/共106頁一、平皿法6．霉菌總數(shù)及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)

(2)操作方法霉菌和酵母菌數(shù)測定一般與細(xì)菌數(shù)測定同時(shí)進(jìn)行，按規(guī)定取2個(gè)以上包裝的供試品。⑧復(fù)試供試品檢測霉菌(酵母菌)數(shù)不合格的，應(yīng)從同一批號樣品中隨機(jī)雙倍量抽樣，平行復(fù)試2次，取3次測定數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值報(bào)告。眼科用藥的霉菌和酵母菌菌落數(shù)復(fù)試報(bào)告，須以2次復(fù)試結(jié)果均不得長菌，方可判為供試品合格。第41頁/共106頁一、平皿法7．原始記錄（詳見附錄四）。第42頁/共106頁二、薄膜過濾法

采用薄膜過濾法，濾膜孔徑不大于0.45μm、直徑約50mm，水溶性供試液過濾前將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜；油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。過濾后，若需用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100mL。第43頁/共106頁二、薄膜過濾法

取相當(dāng)于每張濾膜含1g或1mL供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻過濾，若供試品每lg或1mL所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液1mL過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備1張濾膜。第44頁/共106頁二、薄膜過濾法

陰性對照試驗(yàn)：取試驗(yàn)用的稀釋液1mL，按照上述濾膜過濾法操作，作為陰性對照，陰性對照不得長菌。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100個(gè)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：以相當(dāng)于1g或1mL供試品的菌落報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以小于1報(bào)告菌數(shù)(每張濾膜過濾1g或1mL供試品)，或小于1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。第45頁/共106頁生物檢定技術(shù)第二節(jié)無菌檢查第46頁/共106頁

無菌檢查法系用于檢查《中國藥典》要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、敷料及其他品種是否無菌的一種方法。無菌檢查法應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。第47頁/共106頁1．儀器與用具(1)儀器恒溫培養(yǎng)箱(室)或生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干燥箱、生物學(xué)顯微鏡。

(2)滅菌器材玻璃器皿：試管、錐形瓶、量筒、量杯、載玻片、刻度吸管(1mL，2mL，5mL，10mL)、注射器注(2mL，5mL，10mL)、培養(yǎng)皿(直徑90mm)、輸液瓶、酒精燈等。手術(shù)剪刀、鑷子、注射器針頭(9號，12號，16號)、接種針(環(huán))、白金耳、橡皮塞、橡皮管、紗布、棉花(制棉塞、堵吸管及無菌試驗(yàn)均用原棉不用脫脂棉)、脫脂棉(消毒棉球用)、乳膠手套等。無菌衣、褲、帽、罩、鞋。開放式濾器、微孔濾膜(直徑50mm，孔徑0.45μm)。

(3)消毒器材第48頁/共106頁2．試劑(1)消毒劑0.2%苯扎溴銨溶液、75%乙醇溶液(制酒精棉球用)、3%～5%甲酚溶液、5%甲醛、01%高錳酸鉀等。

(2)稀釋劑0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

(3)滅活劑無菌青霉素酶溶液。

(4)染色劑革蘭染色液。

(5)蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鎂、L-胱氨酸、硫乙醇酸鈉(或硫乙醇酸)、胰酶水解酪胨、刃天青(或亞甲藍(lán))、瓊脂、2moL/L鹽酸溶液、2moL/L氫氧化鈉溶液等。第49頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(1)菌種《中國藥典》2005年版規(guī)定培養(yǎng)基靈敏度所用菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)。金黃色葡萄球菌(Staphylococcμsaureus)[CMCC(B)26003]

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerμginosa)[CMCC(B)10104]

枯草芽孢桿菌(Bacillμssubtilis)[CMCC(B)63501]

生孢梭菌(Clostridiμmsporogenes)[CMCC(B)64941]

白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]

黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC（F）98003]第50頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(2)培養(yǎng)基的配制①好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基(硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基)

培養(yǎng)基配方酪胨(胰酶水解)15.0g、葡萄糖5.0g、L-胱氨酸0.5g、硫乙醇酸鈉0.5g(或硫乙醇酸0.3mL)、酵母浸出粉5.0g、氯化鈉2.5g、新配制的0.1%刃天青溶液1.0mL、瓊脂0.75g、蒸餾水1000mL。配制方法除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.1±0.2，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層的顏色(粉紅色)不得超過培養(yǎng)基深度約1/2，滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基指示劑氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度約l/5，否則，須經(jīng)100℃水浴加熱至粉紅色消失(不超過20min)，迅速冷卻，只限加熱1次，并應(yīng)防止被污染。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30～35℃培養(yǎng)。第51頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(2)培養(yǎng)基的配制②改良馬丁培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)真菌)

培養(yǎng)基配方胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氯二鉀1.0g、硫酸鐵0.5g、水l000mL。配制方法除葡萄糖外，取上述成分加入蒸餾水內(nèi)，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH約為6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。改良馬丁培養(yǎng)基置23～28℃：培養(yǎng)。第52頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(2)培養(yǎng)基的配制③選擇性培養(yǎng)基按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量的中和劑或表面活性劑，如對氨基苯甲酸(用于磺胺類供試品)、聚山梨酯80(用于非水溶性供試品)或β-內(nèi)酰胺酶(用于β-內(nèi)酰胺酶類供試品)等。中和劑或表面活性劑的用量應(yīng)通過驗(yàn)證。第53頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(2)培養(yǎng)基的配制④營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基取10.0g胨、5.0g氯化鈉、牛肉浸出粉3.0g、水1000mL混合，微溫溶解后，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。⑤營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按上述培養(yǎng)基的處方及制法，加入14.0g瓊脂，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。第54頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(2)培養(yǎng)基的配制上述培養(yǎng)基分別按15mL與40mL或需要量分裝于試管或其他容器中，裝量約為試管或容器高度的2/5，以免滅菌時(shí)溢出。培養(yǎng)基制備時(shí)，均以116℃滅菌40min。制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2～25℃、避光的環(huán)境。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，一般在3周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在1年內(nèi)使用。第55頁/共106頁3．培養(yǎng)基及培養(yǎng)基適用性檢查(3)培養(yǎng)基適用性檢查①無菌性檢查制備好的每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。②靈敏度檢查制備好的培養(yǎng)基按規(guī)定接入小于l00CFU/mL(菌落形成單位)的菌懸液，培養(yǎng)后，空白對照管應(yīng)無菌生長，加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。第56頁/共106頁4．陽性對照試驗(yàn)及陰性對照試驗(yàn)(1)陽性對照試驗(yàn)《中國藥典》2005年版規(guī)定無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品以白色念珠菌為對照菌，加菌量小于100CFU。陽性對照管培養(yǎng)基48～72h應(yīng)生長良好。

(2)陰性對照試驗(yàn)進(jìn)行供試品無菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照，不得有菌生長。第57頁/共106頁5．操作前準(zhǔn)備(1)無菌室消毒，操作人員用肥皂刷洗雙手，進(jìn)入緩沖間換消毒拖鞋，用消毒劑洗雙手，用消毒巾擦干，換上無菌衣、褲、帽子、口罩，戴乳膠手套等。在操作過程中要用75%酒精擦手套。

(2)凡放到超凈工作臺上的物品，如滅過菌的用具、取樣用盒子、培養(yǎng)基、樣品等外面均先用消毒劑擦拭，然后再打開超凈工作臺上的紫外燈。紫外燈開到45min時(shí)打開層流，當(dāng)紫外燈開夠1h，關(guān)閉超凈工作臺和緩沖間的紫外燈。第58頁/共106頁5．操作前準(zhǔn)備(3)進(jìn)入無菌室的物品、用具，需經(jīng)高壓蒸汽滅菌，不能用高壓蒸汽滅菌的，需用消毒液擦拭其外部，由傳遞窗遞入無菌室。

(4)洗滌物品、用具。消毒無菌檢查的供試品容器外部。第59頁/共106頁6．檢查方法(1)薄膜過濾法①過濾按規(guī)定量取供試品，按該樣品項(xiàng)下規(guī)定的方法處理后，對于無菌粉針劑和粉末原料應(yīng)用稀釋劑溶解到至少100mL具塞的瓶中，混勻。用滅菌刻度吸管注入或直接倒入裝有孔徑≤0.45μm、直徑約50mm濾膜的無菌過濾器，抽干，使藥液中的微生物截留在濾膜上。②沖洗用沖洗液或其他適宜的溶劑沖洗濾膜多次，以洗去抗菌物質(zhì)。每張濾膜每次沖洗量為100mL，且沖洗量不宜過大。第60頁/共106頁6．檢查方法(1)薄膜過濾法③接種培養(yǎng)將好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基及陽性對照用培養(yǎng)基分別加至薄膜過濾器內(nèi)(封閉式過濾器)；或取出薄膜分成3等份，分別加入好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基及陽性對照用培養(yǎng)基中，好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基管置30～35℃，真菌培養(yǎng)基管置23～28℃，培養(yǎng)14天，在培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對照管應(yīng)根據(jù)供試品特性加人相應(yīng)對照菌液1mL(抗細(xì)菌藥物加入金黃色葡萄球菌對照菌液，抗厭氧菌藥物加入生孢梭菌對照菌液，抗真菌藥物加入白色念球菌對照菌液)，陽性對照管細(xì)菌應(yīng)在30～35℃培養(yǎng)48h，真菌應(yīng)在23～28℃培養(yǎng)72h，有菌生長。第61頁/共106頁6．檢查方法(2)直接接種法①供試品的制備供試品如為注射液、供角膜穿通傷及手術(shù)用的滴眼劑或滅菌溶液，按規(guī)定量取供試品，混合。供試品如為注射用無菌凍干品或供直接分裝成注射用的無菌粉末原料，按規(guī)定量取供試品，加入稀釋掖，或該藥品項(xiàng)下規(guī)定的溶劑用量制成一定濃度的供試品溶液。第62頁/共106頁6．檢查方法(2)直接接種法①供試品的制備供試品如為外科敷料，取供試品4個(gè)包裝，以無菌操作拆開包裝，于不同部位分別剪取約100mg或lcm×3cm的供試品11份。供試品如為腸線、縫合線，取最小包裝5個(gè)，拆開包裝，共取11股，接種于足以浸泡沒供試品的適量培養(yǎng)基中。第63頁/共106頁6．檢查方法(2)直接接種法①供試品的制備供試品如為滅菌醫(yī)用器具，依據(jù)樣品大小、形狀的不同，取供試品11個(gè)，接種于足以浸沒供試品的適量培養(yǎng)基中(或用稀釋液各40mL，分別沖洗內(nèi)壁，收集各種洗液，混合，按薄膜過濾法檢查)。供試品如為青霉素類藥品，接規(guī)定量取供試品，分別加入足夠使青霉素滅活的無菌青霉素酶溶液適量，搖勻，混合(亦可按薄膜過濾法檢查)。第64頁/共106頁6．檢查方法②檢查方法取上述備好的供試品，以無菌操作將供試品分別接種2mL于6管好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基，其中1管接種金黃色葡萄球菌對照用菌液1mL作陽性對照，另接種于真菌培養(yǎng)基5管。輕輕搖動(dòng)，使供試品與培養(yǎng)基混合。好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基管置30～35℃，真菌培養(yǎng)基管置23～28℃，培養(yǎng)14天，在培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對照管在24h應(yīng)有菌生長。如果在加入供試品后培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種在同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)2天，真菌培養(yǎng)3天，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面上有無菌生長，或用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)液涂片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。第65頁/共106頁7．無菌檢驗(yàn)結(jié)果判斷及報(bào)告《中國藥典》(2005年版)的無菌檢查結(jié)果判斷。在培養(yǎng)期結(jié)束后，當(dāng)陽性對照管顯渾濁并確有菌生長，陰性對照管澄清時(shí)才可根據(jù)觀察所得結(jié)果判定如下。①第一次檢查結(jié)果供試品的好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基管及真菌培養(yǎng)基管均為澄清或雖顯渾濁但經(jīng)檢查證明無菌生長，均判為供試品無菌檢查合格。②第一次檢查結(jié)果供試品的好氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基管及真菌培養(yǎng)基管中任何一管顯渾濁時(shí)，取生長管的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂或真菌培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)，取菌苔或培養(yǎng)物，經(jīng)革蘭染色、鏡檢，確證有菌生長，應(yīng)重新取樣進(jìn)行復(fù)試。第66頁/共106頁7．無菌檢驗(yàn)結(jié)果判斷及報(bào)告③復(fù)試時(shí)，取同量供試品，依法重試，復(fù)試結(jié)果除陽性對照管外，其他各管均無菌生長，判供試品檢查合格；復(fù)試結(jié)果其中任一培養(yǎng)基管有菌生長，應(yīng)判供試品無菌檢查不合格。復(fù)試時(shí)需同時(shí)做陰性試驗(yàn)。陰性試驗(yàn)只是不加樣品，一切操作與檢查樣品相同。如果陰性試驗(yàn)培養(yǎng)管中有菌生長表示操作中無菌操作有過失，檢驗(yàn)結(jié)果無效，并且可以重新復(fù)試。第67頁/共106頁7．無菌檢驗(yàn)結(jié)果判斷及報(bào)告當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。①無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。②回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。③陰性對照管有菌生長。④供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和(或)無菌操作不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。第68頁/共106頁8．原始記錄（詳見附錄五）。第69頁/共106頁生物檢定技術(shù)第三節(jié)熱原檢查第70頁/共106頁熱原檢查法一般采用家兔升溫法，系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀測家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定的方法。家兔被注射一定量的熱原后，一般15～30min體溫開始上升，70～120min達(dá)到最高峰。如果注射規(guī)定量的供試品后，家兔沒有升溫或升溫不多，說明供試品內(nèi)熱原含量極少，沒有超出許可范圍；反之，如果注射供試品后，家兔的升溫比較明顯，即超出了規(guī)定的范圍，說明供試品內(nèi)熱原量較大，用于臨床后會產(chǎn)生不良反應(yīng)。第71頁/共106頁

一、儀器、用具、試劑的準(zhǔn)備1．儀器、用具、試劑家兔升溫法中所需的儀器、用具和試劑有：分析天平(萬分之一)、熱原測試儀、電熱干燥箱(帶自動(dòng)控溫裝置，最高溫度應(yīng)達(dá)300℃)、超凈工作臺、恒溫水浴(38℃)；時(shí)鐘、煮鍋、金屬飯盒、金屬吸管筒、臺秤、兔固定器、肛門溫度計(jì)或測溫儀、注射器(2mL，5mL，l0mL，20mL，30mL)、注射針頭(6號、7號)、吸量管(1mL，2mL，5mL，10mL)、稱量瓶(30mm×60mm)和廣口瓶（100mL，250mL)；75%酒精棉、甘油(或凡士林)、2%碳酸氫鈉溶液、注射用水、氯化鈉注射液。第72頁/共106頁

一、儀器、用具、試劑的準(zhǔn)備2．用具的清洗和熱原的除去(1)用具的清洗玻璃用具用自來水沖洗浮塵后，放入去污劑溶液中浸泡30min以上，取出后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3遍。注射針頭用自來水沖洗后，在2%碳酸氫鈉溶液中煮沸15min后，用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3遍。(2)用具的除熱原將清洗干凈的注射器、稱量瓶、玻璃小瓶、注射針頭等置于金屬盒(或錫箔紙)內(nèi)，將吸量管置于金屬筒(或錫箔紙)內(nèi)，放入電熱干燥箱內(nèi)，升溫至250℃，保溫0.5h。(3)溫度計(jì)的校正測量家兔體溫應(yīng)使用精密度為±0.1℃的測溫裝置。第73頁/共106頁

二、家兔的挑選與準(zhǔn)備1．家兔的挑選

(1)選擇健康無傷，體重為1.7～3.0kg的家兔，雌兔應(yīng)未孕。測前7天用同一飼料飼養(yǎng)，在此期間，家兔無體重減輕、精神、食欲、排泄等異?，F(xiàn)象。(2)試前3～7天內(nèi)預(yù)測體溫，每半小時(shí)一次，共8次，體溫在38~39.6℃之間，高低溫差小于0.4℃的家兔可用。上次用于檢查為陰性的家兔，休息2天可用，不需選擇。升溫達(dá)0.6℃的家兔，仍按上法挑選。

(3)每一批家兔使用次數(shù)，用于一般藥品的檢查，不超過10次。第74頁/共106頁

二、家兔的挑選與準(zhǔn)備2．檢查前的準(zhǔn)備查前1～2天內(nèi)，供試家兔應(yīng)在與實(shí)驗(yàn)室相同溫度的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，二者溫差不大于5.0℃。實(shí)驗(yàn)室室溫在17~25℃，試驗(yàn)全過程，室溫差小于3℃。此外實(shí)驗(yàn)室要安靜。試驗(yàn)前參加試驗(yàn)的家兔停食lh以上。第75頁/共106頁

三、檢查操作方法1．供試品溶液的制備

(1)如供試品為原料藥，則精密稱定適量，根據(jù)其效價(jià)或含量計(jì)算加水量，稀釋至所需濃度。

(2)如供試品為制劑，按標(biāo)示量計(jì)算加水量，稀釋至所需濃度。

(3)如供試品溶液注射劑量≥3mL/kg，應(yīng)在注射前預(yù)熱至38℃。

(4)供試品溶液的制備，應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行；除另有規(guī)定外，試驗(yàn)用水均指滅菌用水。第76頁/共106頁

三、檢查操作方法2．家兔體溫的測量

(1)家兔的固定左手抓住家兔的雙耳，右手托住家兔的尾部，從飼養(yǎng)籠放到臺秤上稱重，并把體重記在兔卡上，而后放入固定器中固定。

(2)探頭固定輕輕提起兔尾，把蘸有甘油(或凡士林)的測溫儀探頭輕輕插入肛門約6cm深，再把兔尾和探頭固定在一起，避免探頭脫落，直到試驗(yàn)完畢。第77頁/共106頁

三、檢查操作方法2．家兔體溫的測量

(3)體溫預(yù)測家兔置于固定器中至少休息lh后，開始測量第1次體溫，隔30min測第2次體溫。兩次體溫相差不超過0.2℃為符合要求，并以兩次體溫的平均值作為該兔的正常體溫。當(dāng)日使用的家兔體溫應(yīng)在38.0～39.6℃范圍內(nèi)，且所有家兔體溫之差不得超過1℃。測量溫度的方式有兩種：一種使用熱原測溫儀，按操作程序即可；另一種用肛門溫度計(jì)，測溫時(shí)插入肛門的時(shí)間不少于1.5min。第78頁/共106頁3．供試品溶液的注射

經(jīng)測定，家兔體溫符合要求后15min內(nèi)，進(jìn)行耳靜脈注射。每批供試品注射家兔的數(shù)量為初試3只，復(fù)試5只。注射前先用75%酒精棉擦耳朵邊緣，用小鑷子將除熱原的注射器和針頭套好，按規(guī)定劑量抽取溫?zé)嶂良s38℃的供試品溶液，由耳靜脈徐徐注入。注射完后用手捏緊針眼處數(shù)秒鐘，以助止血。第79頁/共106頁4．注射后家兔體溫的測量

注射后，每隔30min測量體溫1次，共測6次。以6次中體溫最高1次減去注射前的正常體溫，即為該兔體溫的升高度數(shù)。如3只家兔中有1只體溫升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔體溫升高均低于0.6℃，但體溫升高的總和達(dá)1.4℃或1.4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復(fù)試，檢查方法同上。第80頁/共106頁5．結(jié)果判斷(1)供試品熱原檢查合格初試3只家兔中，升溫均小于0.6℃，總升溫?cái)?shù)小于1.4℃；或復(fù)試5只家兔中，體溫升高大于或等于0.6℃者不超過1只，且初試、復(fù)試8只家兔的升溫總數(shù)小于或等于3.5℃時(shí)，均可判斷供試品熱原檢查合格。(2)供試品熱原檢查不合格初試3只中，體溫升高大于或等于0.6℃超過1只，或復(fù)試的5只中，升溫大于或等于0.6℃的家兔超過1只，或初試、復(fù)試8只家兔的升溫總數(shù)大于3.5℃時(shí)，均判斷供試品熱原檢查不合格。當(dāng)家兔升溫為負(fù)值時(shí)，均以0℃計(jì)。第81頁/共106頁6．原始記錄（詳見附錄六、附錄七）。第82頁/共106頁生物檢定技術(shù)第四節(jié)降壓物質(zhì)檢查第83頁/共106頁本法系比較組胺對照品與供試品引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。第84頁/共106頁l．儀器與用具

自動(dòng)平衡記錄儀、分析天平(十萬分之一)、電冰箱、直形剪刀、彎形剪刀、止血鉗、鑷子、眼科直形小鑷子、彎頭小鑷子、彎頭小剪刀、手術(shù)縫合針、注射器(1mL，2mL，5mL，10mL)、注射針頭(5號，9號)、A類吸量管(1mL，2mL，10mL)、具塞試管(25mL，50mL)、燒杯(100mL)、雙向活塞管、量杯(100mL)、脫脂棉、紗布、線繩、乳膠管、動(dòng)靜脈插管、手術(shù)縫合線等。第85頁/共106頁2．試劑

垂體后葉標(biāo)準(zhǔn)品、10%戊巴比妥鈉溶液(臨用時(shí)用注射用水新鮮配制)、注射用水、氯化鈉注射液、烏拉坦溶液、肝素鈉(12500U/2mL)、0.5μg/mL的磷酸組胺對照品溶液(臨用時(shí)新鮮配制)。第86頁/共106頁3．試驗(yàn)動(dòng)物

降壓物質(zhì)檢查用貓應(yīng)毛色光滑，眼睛有神，無病癥，鼻孔無黏液，肛門清潔干燥，皮下無腫塊，動(dòng)作敏捷，體重2.0kg以上，雌雄均可，雌貓無孕。第87頁/共106頁4．檢定用溶液(1)組胺對照品溶液的配制用十萬分之一天平精密稱取磷酸組胺對照品25mg左右，按組胺計(jì)算加注射用水溶解使成每1mL中含1.0mg的溶液，分裝于小瓶中，4～8℃避光貯存，如無沉淀析出，可在3個(gè)月內(nèi)使用。臨用前，用氧化鈉注射液稀釋成0.5μg/mL的溶液。(2)降壓物質(zhì)供試品溶液的配制按各藥品標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定的劑量，用氯化鈉注射液配成適當(dāng)濃度的供試品溶液。如供試品為原料藥，則精密稱定適量，按效價(jià)或含量計(jì)算加水量。如供試品為制劑，按標(biāo)示量計(jì)算加水量，稀釋至適當(dāng)濃度。第88頁/共106頁5．降壓物質(zhì)檢查法(1)手術(shù)前的準(zhǔn)備將靜脈插管用乳膠管與灌滿氯化鈉注射液的雙向活塞裝置連接好，并排除氣泡；將動(dòng)脈插管用三通與灌有1/2氯化鈉注射液的制壓瓶和信號轉(zhuǎn)換裝置連接好，排除氣泡；制壓瓶保持一定壓力；準(zhǔn)備好自動(dòng)平衡記錄儀(或多導(dǎo)生理儀)；接通電源開啟記錄儀，檢查運(yùn)行是否正常。(2)貓的麻醉把貓放入布袋內(nèi)稱重，按體重計(jì)算麻醉劑(戊巴比妥鈉)劑量(40～45mg/kg)，用10%戊巴比妥鈉溶液按1mL/kg進(jìn)行腹腔注射，將麻醉好的貓，仰臥于保溫手術(shù)臺上并固定好。第89頁/共106頁5．降壓物質(zhì)檢查法(3)動(dòng)脈、靜脈的分離與插管①股靜脈的分離與插管用彎形剪刀剪干凈手術(shù)部位的毛，用鑷子將近膝部、股內(nèi)側(cè)的皮膚剪開，分離出一側(cè)股靜脈，剪一小口，插入靜脈插管、扎緊并固定于貓腿上。推入一定量的氯化鈉注射液，如其暢通無漏水即可。②動(dòng)脈的分離與插管用手術(shù)彎形剪刀剪去頸部毛，再用鑷子將咽部皮膚提起，用剪刀沿中線自甲狀軟骨下方剪至胸骨上緣，在胸鎖乳突肌與頸闊肌之間分離出一側(cè)頸動(dòng)脈后，再把與動(dòng)脈相連的神經(jīng)分開，剪口插入動(dòng)脈管，扎緊并固定好，將動(dòng)脈插管與記錄儀之間的螺旋夾打開，打開記錄儀觀察走紙，檢查結(jié)扎是否嚴(yán)密，走紙不下滑即可。③血壓記錄往動(dòng)脈插管注入0.3～0.5mL肝素鈉溶液，緩慢打開動(dòng)脈夾，記錄血壓。第90頁/共106頁5．降壓物質(zhì)檢查法(4)供試品的檢查①靈敏度測定打開動(dòng)脈夾后，觀察貓的血壓。待血壓穩(wěn)定后，從股靜脈注入第一組組胺對照品，分別按每千克體重0.05μg，0.10μg，0.15μg三個(gè)劑量注射，每次注入后均以5～6mL氯化鈉注射液送入。相鄰兩針間隔應(yīng)一致(不少于3～5min)，并應(yīng)在前一針反應(yīng)恢復(fù)后再進(jìn)行下一針注射。如此重復(fù)2～3組。如果0.10μg/kg的劑量所致血壓下降均超過2.67kPa，同時(shí)相應(yīng)各劑量所致反應(yīng)的平均值有差別，則認(rèn)為該貓的靈敏度符合規(guī)定。②供試品溶液測定待貓的血壓恢復(fù)穩(wěn)定后，開始供試品的測定，依次注射組胺對照品(ds)0.1μg/kg和供試品溶液(dΤ)(調(diào)節(jié)兩者溶液的濃度，使注入的體積一致)。4針的順序?yàn)閐s、dΤ，dΤ、ds。然后以第一針與第三針、第二針