細(xì)菌與病毒的微生物學(xué)檢查法

細(xì)菌與病毒的微生物學(xué)檢查法第1頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二

第七章細(xì)菌與病毒的微生物學(xué)檢查法微生物學(xué)教研室Jiz-Zhaoj12zhao@第2頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二教學(xué)大綱掌握內(nèi)容標(biāo)本的采集和送檢原則病原菌的檢驗(yàn)程序細(xì)菌感染的血清學(xué)診斷及常用方法了解內(nèi)容病原體的抗原成分、核酸及其他成分的檢測(cè)方法第3頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二病原學(xué)檢查的目的進(jìn)行病因?qū)W診斷指導(dǎo)合理用藥觀察治療進(jìn)行傳染病的流行病學(xué)調(diào)查第4頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二標(biāo)本的采集和送檢六原則※無菌操作：避免雜菌污染不同期不同標(biāo)本用抗生素以前采集病變明顯部位運(yùn)送注意保存采集雙份血清第5頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)細(xì)菌感染的微生物學(xué)檢查法第6頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二可疑細(xì)菌感染采集標(biāo)本血清學(xué)實(shí)驗(yàn)雙份血清直接形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌成分檢測(cè)特異性抗體檢測(cè)細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定形態(tài)學(xué)檢查生化學(xué)檢查血清學(xué)鑒定藥物敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（毒力）實(shí)驗(yàn)抗原檢測(cè)核酸檢測(cè)直接凝集實(shí)驗(yàn)協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)乳膠凝集實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測(cè)ELISA等核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA芯片凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中和試驗(yàn)ELISA等第7頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌學(xué)診斷

檢測(cè)病原菌成分檢測(cè)患者血清中特異性抗體細(xì)菌病原學(xué)檢查法形態(tài)學(xué)檢查分離培養(yǎng),純培養(yǎng)生化試驗(yàn)血清學(xué)鑒定藥物敏感試驗(yàn)毒力實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)抗原核酸第8頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二一、細(xì)菌學(xué)診斷第9頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（一）形態(tài)學(xué)檢查光學(xué)顯微鏡檢查法：細(xì)菌染色檢查法革蘭染色法抗酸染色法負(fù)染法暗視野檢查：用于檢查活菌、螺旋體及其動(dòng)力熒光顯微鏡第10頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二腦脊液的直接涂片染色-肺炎鏈球菌第11頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二鏈球菌第12頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二淋病奈瑟球菌-膿液直接涂片第13頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二結(jié)核分枝桿菌第14頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二霍亂弧菌第15頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二暗視野顯微鏡鉤端螺旋體第16頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二肺炎雙球菌第17頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二病原菌的分離培養(yǎng)/直接涂片大小形態(tài)顏色表面性狀透明度溶血性Flamesterilizewireloop,metalforceps,etcbeforeandafteruseinahoodedBunsenburner第18頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)菌動(dòng)力的檢測(cè)第19頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二化膿性球菌葡萄球菌鏈球菌第20頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二腸道桿菌大腸埃希菌沙門氏菌志賀菌細(xì)菌形態(tài)無特異性可采用生化學(xué)檢查法-鑒別細(xì)菌的重要方法第21頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（二）生化試驗(yàn)

糖發(fā)酵試驗(yàn)H2S試驗(yàn)枸櫞鹽利用試驗(yàn)第22頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二鑒定中最重要的生化反應(yīng)※乳糖發(fā)酵試驗(yàn)?zāi)c道非致病菌（埃希菌屬）發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣＋腸道致病菌（志賀菌屬、沙門菌屬等）不發(fā)酵乳糖—第23頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（三）血清學(xué)鑒定利用含已知的特異性抗體的免疫血清，檢測(cè)未知的細(xì)菌抗原，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種的鑒定志賀菌屬、沙門菌屬常用方法是玻片凝集試驗(yàn)第24頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二測(cè)定抗生素或其他抗微生物制劑在體外抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的能力方法：擴(kuò)散法、稀釋法（四）藥物敏感試驗(yàn)第25頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二MIC&MBC最低抑菌濃度，MIC最低殺菌濃度，MBC第26頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二全自動(dòng)分析儀全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀全自動(dòng)生化分析儀第27頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（五）檢測(cè)毒力-動(dòng)物實(shí)驗(yàn)1.常用動(dòng)物

Mouse

GuineaPig

RabbitDogMonkey第28頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二接種途徑皮內(nèi)皮下腹膜內(nèi)靜脈顱內(nèi)椎管內(nèi)鼻內(nèi)灌胃第29頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二毒力檢測(cè)半數(shù)致死量

LD50半數(shù)感染量

ID50第30頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二二、檢測(cè)病原菌成分抗原的檢測(cè)核酸的檢測(cè)第31頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（一）抗原的檢測(cè)利用已知的特異性Ab檢測(cè)Ag的方法常用的方法有玻片凝集協(xié)同凝集試驗(yàn)ELISA免疫熒光法第32頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二ELISA第33頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（二）核酸檢測(cè)方法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸雜交技術(shù)SouthernblotNorthernblotDotblotInsituhybridization基因芯片(Genechip)16SrRNA第34頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二16sRNA基因序列分析只存在于原核細(xì)胞型微生物的染色體基因中16sRNA，23sRNA,5sRNA可變區(qū)和保守區(qū)保守區(qū)：所有的細(xì)菌所共有可變區(qū)：屬和種的特異性第35頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二PCRGeneChip第36頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二第37頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二三、抗體的檢測(cè)用已知細(xì)菌或其Ag檢測(cè)相應(yīng)的特異性Ab及其量的多少，作為某些病原菌感染的輔助診斷急性期和恢復(fù)期雙份血清，恢復(fù)期效價(jià)升高≥4倍有診斷價(jià)值方法玻片或試管凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、冷凝集試驗(yàn)、ELISA局限難以早期診斷第38頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)病毒感染的微生物學(xué)檢查法形態(tài)學(xué)病毒的分離鑒定在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)病毒成分的檢測(cè)病毒抗體的檢測(cè)第39頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二第40頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（一）病毒的形態(tài)學(xué)檢查

電子顯微鏡（EM）

免疫電鏡,IEM光學(xué)顯微鏡（CM）包涵體內(nèi)基小體（Negribody）HAVNegribody第41頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二動(dòng)物接種：動(dòng)物模型雞胚接種：9～14d組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)

原代細(xì)胞培養(yǎng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)三大培養(yǎng)方法（二）病毒的分離培養(yǎng)的方法第42頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二血凝抑制實(shí)驗(yàn)中和實(shí)驗(yàn)PCR檢測(cè)病毒分離培養(yǎng)及鑒第43頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞病變（cytopathy)

※紅細(xì)胞吸附(hemadsorption)病毒干擾作用(viralinterference)中和試驗(yàn)(neutralizationtest,NT)空斑形成試驗(yàn)(plaqueformation)病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)※第44頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞病變—細(xì)胞病變效應(yīng)※

（CPE）

細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）A：未感染病毒的HeLa細(xì)胞；B：被柯薩奇病毒B3感染后，細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞折光性減弱；C：被腺病毒感染后，細(xì)胞腫脹，折光性增強(qiáng)，呈葡萄狀排列。200

50%組織細(xì)胞感染量TCID50:根據(jù)有無細(xì)胞病變來判斷病毒感染性和毒力的指標(biāo)第45頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二細(xì)胞病變紅細(xì)胞吸附：血凝素（HA）病毒干擾作用中和試驗(yàn)病毒數(shù)量及感染性的檢測(cè)空斑形成試驗(yàn)紅細(xì)胞凝集紅細(xì)胞吸附病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)plaque第46頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二空斑形成試驗(yàn)用于病毒濃度的精確定量和測(cè)定抗病毒藥物的作用一個(gè)空斑是由一個(gè)病毒大量復(fù)制而成，稱為空斑形成單位（Plaqueformingunit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示第47頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（三）病毒成分的檢測(cè)病毒抗原的檢測(cè):ELISA病毒核酸的檢測(cè)核酸雜交、PCR、基因芯片第48頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二病毒成分的檢測(cè)第49頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二（四）病毒抗體的檢測(cè)中和試驗(yàn)（NT）血凝抑制試驗(yàn)（HT）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）ELISA法蛋白印跡技術(shù)第50頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二小結(jié)細(xì)菌感染的微生物學(xué)檢查法病原體檢查核酸的檢測(cè)抗原、抗體的檢測(cè)病毒感染的微生物學(xué)檢查法電鏡及免疫電鏡病毒的分離培養(yǎng)和鑒定核酸的檢測(cè)抗原、抗體的檢測(cè)第51頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二小結(jié)抗細(xì)菌免疫固有免疫※獲得性免疫抗病毒免疫固有免疫干擾素※獲得性免疫第52頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二問題采集標(biāo)本的原則？病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的鑒定指標(biāo)？干擾素的概念及其抗病毒機(jī)制第53頁，共55頁，2023年，2月20日，星期二自檢內(nèi)容1.機(jī)體抗結(jié)核分枝桿菌的感染免疫主要依賴A.屏障結(jié)構(gòu)B.細(xì)胞免疫C.抗體的中和作用D.非特異性免疫分子E.吞噬細(xì)胞的吞噬作用2.滅活和清除游離病毒主要依靠A.干擾素B.抗體