離心機碩士研究生演示文稿

離心機碩士研究生演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有69頁\編輯于星期二（優(yōu)選）離心機碩士研究生現(xiàn)在是2頁\一共有69頁\編輯于星期二細胞培養(yǎng)EnzDNACellAbHybridoma融合瘤定點突變生物信息學蛋白組學Abzyme催化性抗體反義基因

DNA/RNA

基因轉移酶學工藝診斷試劑抗體治療基因治療細胞融合組織培養(yǎng)干細胞動物克隆基因工程生物芯片人類基因組計劃PCR聚合酶鏈放應現(xiàn)在是3頁\一共有69頁\編輯于星期二組織形態(tài)學實驗方法光學顯微鏡技術電子顯微鏡技術病理尸體解剖病理與組織學標本制作病理組織學制片技術組織病理學常規(guī)染色技術組織病理學特殊染色技術免疫組織化學與酶組織化學技術現(xiàn)在是4頁\一共有69頁\編輯于星期二組織器官生化代謝分析方法通過離心、電泳和層析方法來分離提取糖、蛋白、核酸等分子及其代謝產(chǎn)物。通過分光光度法來測量物質(zhì)含量。利用免疫學測定物質(zhì)含量。利用配體－受體親和力強的原理，來進行藥理學方面的研究。采用酶學方法來分析物質(zhì)。采用同位素標記、熒光標記等方法，來檢測物質(zhì)含量。采用質(zhì)譜技術檢測小分子物質(zhì)含量變化?，F(xiàn)在是5頁\一共有69頁\編輯于星期二四大經(jīng)典的生化技術分光光度法離心法層析法電泳現(xiàn)在是6頁\一共有69頁\編輯于星期二內(nèi)容提綱一、離心機的工作原理二、常用的離心方法三、離心機的分類與結構四、離心機的使用和維護現(xiàn)在是7頁\一共有69頁\編輯于星期二離心技術離心技術應用很廣，在生命科學和工業(yè)生產(chǎn)的各個領域都有相應的使用。生物學領域：分離出化學反應后的沉淀物，天然的生物大分子、無機物、有機物。醫(yī)學領域：主要用于分離、純化細胞、病毒、蛋白質(zhì)、酶和核酸?，F(xiàn)在是8頁\一共有69頁\編輯于星期二相關的幾個概念向心力：做圓周運動的物體所受的外力的合力。它的大小取決于外力的大小，方向是與速度的方向垂直，指向圓心。離心現(xiàn)象：物體遠離圓心運動的現(xiàn)象稱為離心現(xiàn)象，也叫離心運動?，F(xiàn)在是9頁\一共有69頁\編輯于星期二現(xiàn)在是10頁\一共有69頁\編輯于星期二離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：它的出現(xiàn)是因為物體所受的外力小于做圓周運動的向心力。離心力F可以表示為：

F=mω2rω:旋轉角速度(弧度／秒)r:旋轉體離旋轉軸的距離(cm)m:顆粒質(zhì)量現(xiàn)在是11頁\一共有69頁\編輯于星期二RCF(Relativecentrifugalforce）相對離心力：就是離心力場和重力場g的比值，即離心力場相當于多少個g。沉降系數(shù)(S):是指單位離心立場下的樣品的沉降速度。它與樣品的質(zhì)量和密度成正比。書98頁表3-6-2介紹了某些生物樣品的沉降系數(shù)及離心條件。rpm或者r/min:離心機轉速的表示方法，一般對于低速離心機通常用這個參數(shù)?，F(xiàn)在是12頁\一共有69頁\編輯于星期二離心機(centrifuge)實現(xiàn)離心技術的儀器。是生命科學研究的基本設備?，F(xiàn)在是13頁\一共有69頁\編輯于星期二二、離心機的工作原理（一）重力場中顆粒的分離顆粒靜置一段時間后，受重力場影響會開始沉降運動。粒子越重，下沉越快。反之密度比液體小的粒子就會上浮。沉降速度(sedimentationvelocity)：微粒在重力場中下降的速度。它的影響因素：微粒的大小、形態(tài)、密度、重力場的強度和液體的粘度。如紅血球大小的微粒，就可以在重力環(huán)境下觀察到它的沉降。如果重力場的強度（g)，則沉降速度，那么就可以實現(xiàn)生物大分子的分離?，F(xiàn)在是14頁\一共有69頁\編輯于星期二擴散現(xiàn)象：重力場中擴散現(xiàn)象是無條件的，絕對的。特別是對于病毒和蛋白質(zhì)類小分子物質(zhì)，擴散對物質(zhì)的沉降影響更大。如何克服？？離心機現(xiàn)在是15頁\一共有69頁\編輯于星期二

離心機即可以通過轉子的高速運動產(chǎn)生的強大的離心力，從而加快微粒在離心力場中的沉降速度，達到分離的目的。（二）離心力場中顆粒的分離：當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉下受到離心力作用時，離心力(F)的大小取決于離心轉頭的角速度(ω，r/min)和物質(zhì)顆粒距離心軸的距離(r，cm)?，F(xiàn)在是16頁\一共有69頁\編輯于星期二通常，F(xiàn)c常用相對離心力也就是地心引力的倍數(shù)表示。即把F值除以重力加速度g得到離心力是重力的多少倍，稱作多少個g?！癛CF”和轉速可以通過下列的公式進行換算：

RCF=1.119×10－5×(rpm)2r

例如：離心機轉頭平均半徑是6cm，當轉速是用60000

r/min表示時，離心力240000×g，表示此時作用在被離心物質(zhì)上的離心力是日常地心引力的24萬倍。

也可由下圖得出：

現(xiàn)在是17頁\一共有69頁\編輯于星期二現(xiàn)在是18頁\一共有69頁\編輯于星期二計算顆粒的相對離心力時，應注意離心管與旋轉軸中心的距離“r”不同，即沉降顆粒在離心管中所處位置不同，則所受離心力也不同。在報告超離心條件時，通?？偸怯玫匦囊Φ谋稊?shù)“×g”代替每分鐘轉數(shù)“rpm”，因為它可以真實地反映顆粒在離心管內(nèi)不同位置的離心力及其動態(tài)變化。科技文獻中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCFavg），即離心管中點的離心力。現(xiàn)在是19頁\一共有69頁\編輯于星期二離心機是分離細胞器及各種大分子基本手段。轉速10－25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉速>25000r/min，離心力>89Kg者稱為超速離心機。超速離心機的最高轉速可達100000r/min，離心力超過500kg。

現(xiàn)在是20頁\一共有69頁\編輯于星期二三、常用的離心方法制備離心方法：差速離心法密度梯度離心法分析離心方法：沉降速度法沉降平衡法等密度區(qū)帶分析離心法現(xiàn)在是21頁\一共有69頁\編輯于星期二原理：利用樣品中各種組分的沉降系數(shù)不同(S)而進行分批分離。通常兩個組分的沉降系數(shù)差在10倍以上。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器，僅僅適合粗提或者樣品濃縮。（一）差速離心法（differential

centrifugation）現(xiàn)在是22頁\一共有69頁\編輯于星期二其特點：介質(zhì)的密度均一速度由低向高，逐級離心分辨率不高，往往適合樣品的粗提對分離的細胞而言，沉降順序依次：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體。可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。現(xiàn)在是23頁\一共有69頁\編輯于星期二LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation現(xiàn)在是24頁\一共有69頁\編輯于星期二現(xiàn)在是25頁\一共有69頁\編輯于星期二現(xiàn)在是26頁\一共有69頁\編輯于星期二（二）密度梯度離心

(isodensitycentrifugation)用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。按照離心分離原理，密度梯度離心又可分為兩種類型：速率區(qū)帶離心法（rate-zonal)

等密度離心法（Isopyonic）

現(xiàn)在是27頁\一共有69頁\編輯于星期二優(yōu)點：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒。②適應范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒。③顆粒不會擠壓變形，能保持顆?；钚浴，F(xiàn)在是28頁\一共有69頁\編輯于星期二常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖、甘油。分離活細胞的介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細胞無毒。對于大多數(shù)離心來講，蔗糖是比較合適的梯度材料。盡管它在高密度（>30%W/N）時粘性較大，但綜合比較表明它可以廣泛應用。當蔗糖分離一些對滲透性敏感的生物體組份時，其高滲透性就會對樣品有影響，這時需要選擇其他梯度材料，如由pharmacia公司開發(fā)的Ficoll等等?，F(xiàn)在是29頁\一共有69頁\編輯于星期二1.速率區(qū)帶離心法

velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離?，F(xiàn)在是30頁\一共有69頁\編輯于星期二操作注意事項1.先在離心管中裝入密度梯度介質(zhì)。然后將預分離樣品混入一起離心。2.梯度液在離心過程中及離心完畢應該避免因為震動而引起的粒子再混合。3.離心的時間要嚴格控制，如果時間過長，所有樣品可能全部到達離心管的底部；離心時間不足，樣品則還沒有完全分離?，F(xiàn)在是31頁\一共有69頁\編輯于星期二用途：分離密度相近而沉降速度不等的細胞或細胞器。現(xiàn)在是32頁\一共有69頁\編輯于星期二2.等密度沉降法

isopycnicsedimentation原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。特點：介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速離心。用途：分離密度不等的顆?！，F(xiàn)在是33頁\一共有69頁\編輯于星期二操作注意事項預先配置介質(zhì)的密度梯度溶液，將介質(zhì)和預分離樣品混合或者是置于梯度溶液頂部。離心所需時間以最小顆粒到達等密度點（即平衡點）的時間為基準，有時長達數(shù)日。一旦達到了平衡，再延長離心時間也不能改變粒子的成帶位置。等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕（CSCl），其密度可達1.7g/cm3。此法可分離核酸、亞細胞器等，也可以分離復合蛋白質(zhì)，但簡單蛋白質(zhì)不適用?，F(xiàn)在是34頁\一共有69頁\編輯于星期二Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation現(xiàn)在是35頁\一共有69頁\編輯于星期二蔗糖密度梯度溶液的制備

將5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按濃度依次減小的順序逐個鋪入離心管中即制成不連續(xù)階梯密度梯度。此離心管于20-25℃靜置2--3h，通過重力作用即成接近線性的連續(xù)密度梯度液。若用細鐵絲輕敲離心管，靜置時間可以縮短至0.5-1h。溫度低時所需靜置時間較長，溫度高時則較短。為減少對流，靜置后應將離心管置冰浴中備用。

小鼠肝臟線粒體蛋白的制備現(xiàn)在是36頁\一共有69頁\編輯于星期二梯度離心

（1）在每個離心管內(nèi)的梯度溶液表面，分別加入1.0mL樣品溶液。加樣時，用注射器吸入樣品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。不允許自由滴落，也不允許針頭接觸梯度液面。（2）裝好樣品后，小心擰緊離心管帽，裝好套筒、轉頭，按使用程序啟動超速離心機，在0℃以25000r/min離心分離1～3h。

現(xiàn)在是37頁\一共有69頁\編輯于星期二梯度溶液的分部收集

離心后，取出離心管，置于冷室中。用No.22針頭將聚乙烯離心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。用小試管將流出的梯度溶液分部收集，每管25滴。現(xiàn)在是38頁\一共有69頁\編輯于星期二收集區(qū)帶的方法有許多種：

（1）用注射器和滴管由離心管上部吸出。

（2）有針刺穿離心管底部滴出。

（3）

用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。

（4）用一根細管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動部分收集器收集。

現(xiàn)在是39頁\一共有69頁\編輯于星期二離心方法的選擇1.根據(jù)實驗室固有的protocal進行離心條件的選擇。2.根據(jù)參考文獻進行離心條件的確定。3.依據(jù)離心機的型號、預離心物質(zhì)的理化性質(zhì)（沉降速度、密度大小等）來選擇離心條件，并不斷優(yōu)化以達到最佳的分離效果?，F(xiàn)在是40頁\一共有69頁\編輯于星期二例如：線粒體的分離現(xiàn)在是41頁\一共有69頁\編輯于星期二（三）分析離心法

分析性離心法：是為了研究生物大分子的沉降特性和結構的一種離心方法。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個離心場中的沉降過程。從而確定其物理性質(zhì)?，F(xiàn)在是42頁\一共有69頁\編輯于星期二沉降速度法：主要用于樣品純度檢查。沉降平衡法：常用的測量絕對分子量的方法。等密度區(qū)帶分析離心法：主要用在核酸的分析和研究中?，F(xiàn)在是43頁\一共有69頁\編輯于星期二超速離心機工作原理圖解光源轉軸轉頭樣品池光學系統(tǒng)液面沉降界面沉降物質(zhì)平衡池沉降界面峰濃度對距離的圖譜現(xiàn)在是44頁\一共有69頁\編輯于星期二三、離心機的分類與結構普通離心機：最大轉速6000rpm左右，容量為幾十毫升至幾升。轉子有角式和外擺式，其轉速不能嚴格控制，通常不帶冷凍系統(tǒng)，于室溫下操作，用于收集易沉降的大顆粒物質(zhì)，如紅血球、酵母細胞等?，F(xiàn)在是45頁\一共有69頁\編輯于星期二高速離心機：最大轉速為20000～25000rpm，最大容量可達3升。轉頭多樣。一般都有制冷系統(tǒng)，以消除高速旋轉轉頭與空氣之間摩擦而產(chǎn)生的熱量，離心室的溫度可以調(diào)節(jié)和維持在0～40C。通常用于微生物菌體、細胞碎片、大細胞器、免疫沉淀物等的分離純化工作，但不能有效地沉降病毒、小細胞器(如核蛋白體)或單個分子。

現(xiàn)在是46頁\一共有69頁\編輯于星期二超速離心機：轉速可達50000～80000rpm，相對離心力最大可達510000g，離心容量由幾十毫升至兩升，設有冷凍系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和安全保護系統(tǒng)。分離的形式是速率區(qū)帶離心和等密度區(qū)帶離心。最著名的生產(chǎn)廠商有美國的貝克曼公司和日本的日立公司等。現(xiàn)在是47頁\一共有69頁\編輯于星期二離心機的結構普通離心機：電動機、離心轉盤（轉頭）、調(diào)速器、離心套管與底座。高速、超速（冷凍）離心機：驅動電機、制冷系統(tǒng)、真空系統(tǒng)（超離有）、顯示系統(tǒng)、自動保護系統(tǒng)和控制系統(tǒng)組成。必要的配件為離心轉頭和離心管。

現(xiàn)在是48頁\一共有69頁\編輯于星期二離心轉頭角式轉頭：角式轉頭是指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉頭。蕩平式轉頭：這種轉頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶（離心套管）構成。垂直轉頭：其離心管是垂直放置。區(qū)帶轉頭：區(qū)帶轉頭無離心管，主要由一個轉子桶和可旋開的頂蓋組成。連續(xù)流動轉頭：可用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉頭與區(qū)帶轉頭類似?，F(xiàn)在是49頁\一共有69頁\編輯于星期二“轉速”的含義

離心機的最高轉速轉頭的最高轉速轉頭的最高允許轉速轉頭的允許轉速現(xiàn)在是50頁\一共有69頁\編輯于星期二離心機的最高轉速可以用于該離心機的轉頭中，轉速最高的這個轉速。即出廠時理想狀態(tài)下的離心機狀況。轉頭的最高轉速轉頭蓋上標明的轉速即轉頭的最高轉速，應注意，同一轉頭在不同離心機中使用，不一定都能達到轉頭的最高轉速使用現(xiàn)在是51頁\一共有69頁\編輯于星期二轉頭的最高允許轉速樣品密度不超過1.2克/ml的情況下，和以下因素有關：離心機型號離心管形狀、材料、厚度（注意，同樣的離心管在不同轉頭中使用，最高允許轉速也可能不同）離心管帽的材質(zhì)離心管是否裝滿是否用適配器

必須根據(jù)實際使用情況，從轉頭手冊和轉頭說明書中查詢現(xiàn)在是52頁\一共有69頁\編輯于星期二離心轉頭的注意事項每個轉頭各有其最高允許轉速和使用累積限時，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。每一轉頭都要有一份使用檔案，記錄累積的使用時間，若超過了該轉頭的最高使用限時，則須按規(guī)定降速使用。轉頭是離心機中須重點保護的部件，搬動時要小心，不能碰撞，避免造成傷痕，轉頭長時間不用時，要涂上一層上光臘保護?，F(xiàn)在是53頁\一共有69頁\編輯于星期二微機控制、觸摸面板、數(shù)字顯示、直流無刷電機、無碳粉污染?！艟哂凶詣幼R別轉子功能，防止超速使用◆具有電子門鎖，提高操作安全性◆具有10種程序存儲功能◆具有快速升速、快速降速功能，最快升速時間為20秒，最快降速時間為18秒。可以選擇不同的升、降速時間?！魰r間設定精確，以秒為單位◆自動計算RCF值◆具有點動功能（短時離心）

H-1650臺式高速離心機現(xiàn)在是54頁\一共有69頁\編輯于星期二TG16-WS臺式高速冷凍離心機型號ModelTG16-WS最高轉速Maxspeed16000r/min1號角轉子NO1anglerotor12×1.5ml(16000r/min)RCF:17800×g2號角轉子NO2anglerotor10×5ml(13000r/min)RCF:11400×g3號角轉子NO3anglerotor12×10ml(12000r/min)RCF:14800×g4號角轉子NO4anglerotor24×1.5/2.2ml(13000r/min)RCF:15100×g5號角轉子NO5swingrotor48×0.5ml(13000r/min)RCF:12810×g最大相對離心力MaxRCF17800×g定時范圍Timerange0～99min電機Motor直流無刷、微機控制BrushLessDCMotor電源PowersupplyAc220V50Hz5A整機噪聲Noise≤65dB(A)外形尺寸Dimension390×330×300mm(L×W×H)重量Weight25kg現(xiàn)在是55頁\一共有69頁\編輯于星期二儀器特點

■轉速高達70,000rpm。

■日備有兩種檢測器，可供選擇：

．紫外(XL-A)：190-800nm，高靈敏度

．干涉光(XL-I)：適用于沒有紫外吸收之樣品，如碳水化合物，高濃度樣品

(<50D值)

■專利橢圓形全息衍射光柵、及四倍光束系統(tǒng)，減少散射光干擾。

■采用光電倍增管，大大提高檢測靈敏度。

■精確可靠的控制軟件及數(shù)據(jù)處理。

應用范圍

■絕對／相對分子量測定

■樣品純度，濃度測定

■分子的聚和，解離分析

■熱動力學和流體力學參數(shù)確定

■核酸，蛋白及病毒測定與分析

■分子間之互相作用

■配合核磁共震應用

分析超速離心機

現(xiàn)在是56頁\一共有69頁\編輯于星期二現(xiàn)在是57頁\一共有69頁\編輯于星期二四、離心機的使用和維護離心方法的選擇一般是根據(jù)樣品顆粒的質(zhì)量和密度，選擇合適的離心方法。離心機的轉速和離心時間的確定：離心分離的效果除了與離心機種類、離心方法、離心介質(zhì)及密度梯度外，實際操作時，與離心機轉速、離心時間、離心介質(zhì)的pH值和溫度等條件有關。現(xiàn)在是58頁\一共有69頁\編輯于星期二離心事故離心機轉頭損壞的原因（操作或使用不當所造成的）過速腐蝕金屬疲勞不平衡現(xiàn)在是59頁\一共有69頁\編輯于星期二轉頭的維護和存放LubricateO-ringsandrotorassemblyregularlyReplaceoverspeeddiskwhendamagedRemoverotorlid/tubeplugsandinverttherotorduringstorage現(xiàn)在是60頁\一共有69頁\編輯于星期二正確的安裝轉頭LocktherotoronthespindleanddepressthebuttonduringinstallaitonCheckthebucketsarehookedproperlyontotherotor現(xiàn)在是61頁\一共有69頁\編輯于星期二使用前一定要先閱讀手冊RefertorotormanualsforoperationUselogbookstorecordhistoryofrotoruse現(xiàn)在是62頁\一共有69頁\編輯于星期二分子生物學操作注意事項克服畏懼心理。分子生物學涉及的知識領域廣泛，許多學科的新進展都很快與它聯(lián)系起來，故它具有一定的神秘性，所以還沒有進分子生物學這個門的人，都有一些畏懼心理。實際上分子生物學的基礎理論本身還是比較簡明具體，同時它的實驗操作也都有專門的書籍詳細介紹(如《分子克隆》)，讀上幾本基礎書，再到有經(jīng)驗的實驗室去實踐，在較短的時間內(nèi)是可以入門的。

現(xiàn)在是63頁\一共有69頁\編輯于星期二有些已具有部分分子生物學知識的人，從各個公司的產(chǎn)品介紹書、專業(yè)文獻中看到，很多實驗的實驗步驟經(jīng)過前人的不斷改進，變得十分的簡便，有些大的實驗在幾天內(nèi)即可完成，便認為基因工程實驗簡單，產(chǎn)生輕視心理，這種心理同樣也是有害的。因為基因工程實驗的操作是精細而微量的，本身中間步驟多且用直觀方法難以檢測，實驗中的每一種試劑，每一個步驟出錯都可能是致命的，可導致實驗完全失敗，所以基因工程實驗是不能完全按實驗流程來計算時間的?？朔p視心理現(xiàn)在是64頁\一共有69頁\編輯于星期二在基因工程實驗中，試劑的用量往往很少，液體常?？捎玫?微升，而普通的一滴水就有20～100微升；固體物質(zhì)可用到微克甚至納克級，這是平常肉眼看不見的。所以剛剛接觸基因工程實驗的人，總是擔心要取的東西能否取到，準不準確，操作的樣品是不是會丟失。