天津大學(xué),生物化學(xué),第十二章4-5節(jié)-1課件

第四節(jié)RNA的生物合成一、DNA指導(dǎo)下的RNA合成－轉(zhuǎn)錄二、RNA指導(dǎo)下的RNA合成－RNA復(fù)制三、RNA指導(dǎo)下的DNA合成－逆轉(zhuǎn)錄一、DNA指導(dǎo)下的RNA合成－轉(zhuǎn)錄1轉(zhuǎn)錄：在DNA指導(dǎo)下RNA的合成。此過程包括RNA鏈的起始、延伸、終止等步驟。轉(zhuǎn)錄要涉及兩方面：一是RNA合成的酶學(xué)過程；二是RNA合成的起始信號和終止信號。模板鏈：轉(zhuǎn)錄的模板DNA鏈，也叫反義鏈或負鏈。編碼鏈：與模板鏈對應(yīng)的鏈，也叫有義鏈或正鏈。轉(zhuǎn)錄的起始是由DNA的啟動子（promter）區(qū)控制的，而控制終止的部位則稱為終止子(ferminafor)。一、DNA指導(dǎo)下的RNA合成－轉(zhuǎn)錄2（一）大腸桿菌RNA聚合酶（二）RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過程（三）RNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）大腸桿菌RNA聚合酶1ACPTPCPGAPP-P-POH5’3’CPGPPPPOHUDNA指導(dǎo)下的RNA合成（二）RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過程1．RNA聚合酶與模板DNA結(jié)合2．起始3．延伸4．終止1．RNA聚合酶與模板DNA結(jié)合1RNA聚合酶結(jié)合到模板DNA的特定位置上1．RNA聚合酶與模板DNA結(jié)合2這一特定部位有RNA聚合作用的起動基因，即啟動子TTGACAAACTGTTATAATATATTA－35（識別位）－10（Pribnow框）＋1起始部位DNA5’3’原核生物啟動子結(jié)構(gòu)2．起始1磷酸二酯鍵的形成12．起始2ACPTPCPGAPP-P-POH5’3’CPGPPPPOHU磷酸二酯鍵的形成23．延伸2延長階段2解鏈區(qū)到達基因終端4．終止1終止階段1RNA和RNA聚合酶從DNA上脫落4．終止2終止階段2：原核生物轉(zhuǎn)錄中止信號及產(chǎn)物AGCCCGCTCGGGCGGCGGGCTCGCCCGATTTTTTTTAAAAAAAA反義鏈有義鏈DNAAAAAAAAATTTTTTTTUUUUUUUCGGGCGGCCCGCA5’反義鏈有義鏈DNARNA產(chǎn)物（三）RNA的轉(zhuǎn)錄后加工在細胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄物往往需要經(jīng)過一系列的變化，包括鏈的裂解、5’端與3’端的切除和特殊結(jié)構(gòu)的形成，堿基修飾和糖苷鍵的改變，以及拼接等過程。使其能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子，此過程總稱為RNA的成熟或轉(zhuǎn)錄后加工。（三）RNA的轉(zhuǎn)錄后加工1．原核生物RNA的轉(zhuǎn)錄后加工2．真核細胞RNA的轉(zhuǎn)錄后加工1．原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工1（mRNA）原核生物的mRNA大多不需加工，一經(jīng)轉(zhuǎn)錄即可直接進行翻譯。1．原核細胞RNA轉(zhuǎn)錄后加工2（rRNA2）P16SP23SP5S16S23S5S細菌rRNA的形成1．原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工3（tRNA1）大腸桿菌染色體基因組共有tRNA基因約60個，這個數(shù)字遠大于按變偶假說所要求的反密碼子數(shù)。即：某些反密碼子可能不只一個tRNA分子，或某些tRNA基因不是一個拷貝。tRNA基因大多成簇存在。tRNA轉(zhuǎn)錄時首先成為tRNA前體。1．原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工3（tRNA2）5’ppp轉(zhuǎn)錄tRNA前體tRNAOH3’5’pppOH3’OH3’+核苷酸降解產(chǎn)物降解至單核苷酸p成熟的tRNAU→φG→m2GA→i6A等修飾tRNA的形成2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工2（rRNA2）18S5.8S28S45S甲基化作用核酸內(nèi)切酶18SRNA5.8SRNA28SRNA真核生物rRNA前體的加工2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工3（rRNA3）真核生物rRNA的生成與成熟45S5S41S→32S5S20S32S5S細胞核核仁細胞質(zhì)28S5.8S18S5S28S5.8S18S核蛋白體2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工6（mRNA1）①兩者都為不均一分子②兩者堿基組成上有部分相似③兩者3’末端都有多聚腺苷酸尾部；5’端連接有GMTP（7-甲基鳥苷）的帽子（1）細胞核中的不均一核RNA（HnRNA）可能是mRNA的前體,因為：2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工7（mRNA2）①5’端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)（M7G5’PPP5’NmpNp-）②在鏈的3’端切斷并加上多聚腺苷酸（polyA）尾巴③通過拼接除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄來的序列④鏈內(nèi)部核苷被甲基化（2）HnRNA轉(zhuǎn)變成mRNA的加工過程：2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工8（mRNA3）卵清蛋白基因產(chǎn)生mRNA的過程：轉(zhuǎn)錄1234567ABCDEFG卵清蛋白基因(7700個核苷酸)1234567ABCDEFGLL5’3’加帽子和尾巴1234567ABCDEFGL5’3’內(nèi)含子RNA的除去和拼接作用1234567LCAPPolyA尾成熟的mRNA1872個核苷酸2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工9（mRNA4）2．真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后加工10

（帽子結(jié)構(gòu)形成過程）GTPPipppN1N2N3…G5’ppp5’N1N2N3…pppN1N2N3…RNA三磷酸酶PiimRNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶S-腺苷甲硫氨酸m7G5’ppp5’N1N2N3…S-腺苷高半胱氨酸mRNA(鳥嘌呤-7-)甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA(核苷-2’-)甲基轉(zhuǎn)移酶S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸m7G5’ppp5’N1

mN2N3…S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷高半胱氨酸m7G5’ppp5’N1

mN2mN3…mRNA(核苷-2’-)甲基轉(zhuǎn)移酶二、RNA指導(dǎo)下的RNA合成－RNA復(fù)制病毒正鏈（具mRNA功能）pppG5’3’OH5’5’pp3’OH復(fù)制中間體5’3’3’新合成的負鏈病毒正鏈為模板復(fù)制酶5’三、依靠反轉(zhuǎn)錄的DNA生物合成11970年Temin和Baltimore同時分別從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。由于它催化遺傳信息從RNA流向DNA，與轉(zhuǎn)錄作用正好相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒感染細胞后，通過逆轉(zhuǎn)錄酶生成與病毒RNA堿基序列互補的DNA，并整合到宿主細胞的染色體DNA中。此后，在宿主細胞內(nèi)，這段插入的DNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成相應(yīng)的mRNA，再轉(zhuǎn)譯成病毒專一的蛋白質(zhì)。三、依靠反轉(zhuǎn)錄的DNA生物合成2RNA3’5’依賴于RNA的DNA聚合酶RNA3’5’核糖核酸酶H5’3’5’3’cDNA依賴DNA的DNA聚合酶cDNA雜種分子3’5’5’3’雙鏈DNA新合成的雙鏈DNA整合到寄主染色體DNA中第五節(jié)基因的重組與DNA“克隆”DNA重組技術(shù)是指將不同的DNA片段按人們的設(shè)計方案定向地連接起來，并在特定的受體細胞中，與載體一起得到復(fù)制與表達，使受體細胞獲得新的遺傳特性。從某種意義上來說，DNA重組技術(shù)也可理解為基因工程，也是使生物基因結(jié)構(gòu)得到改造的技術(shù)。第五節(jié)基因的重組與DNA“克隆”2一、DNA重組技術(shù)的用途

二、重組中所用的酶和載體三、重組的大致步驟一、DNA重組技術(shù)的用途1．利用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)一些在正常組織代謝中產(chǎn)量很低的多肽物質(zhì)，如多肽激素、多肽抗生素、酶類、抗體及各種肽類。2．定向地改造生物基因組結(jié)構(gòu)，使其具有的某些有經(jīng)濟價值的功能得以成百倍地提高。3．將DNA重組技術(shù)應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。如在基因組結(jié)構(gòu)及基因組功能調(diào)節(jié)的研究。二、重組中的酶及載體（一）DNA體外重組中常用的酶

（二）載體（一）DNA體外重組中常用的酶1

1．限制性內(nèi)切酶2．T4DNA連接酶3．大腸桿菌DNA聚合酶I4．大腸桿菌DNA聚合酶大片段（klenow片段）5．T4DNA聚合酶6．T4多核苷酸激酶7．反轉(zhuǎn)錄酶8．細菌堿性磷酯酶9．核酸酶S110．脫氧核糖核酸酶I11．polyA聚合酶（一）DNA體外重組中常用的酶2

由同一個限制性內(nèi)切酶切斷得到的任何兩個DNA片段的粘性末端都可以互相配對，然后每條DNA鏈的斷開部分再通過DNA連接酶所產(chǎn)生的磷酸二酯鍵連接起來。1.限制性內(nèi)切酶1（一）DNA體外重組中常用的酶2

1.限制性內(nèi)切酶2

酶（產(chǎn)生平頭末端）限制和修飾部位來源

HindII5’-G-T-Py-Pu-A-C-3’3’-C-A-Pu-Py-T-G-5’流感嗜血菌

HindI5’-G-T-T-A-A-C-3’3’-C-A-A-T-T-G-5’副流感嗜血菌**（一）DNA體外重組中常用的酶2

酶（產(chǎn)生粘性末端）限制和修飾部位來源

EcoRI5’-G-A-A-T-T-C-3’3’-C-T-T-A-A-G-5’流感嗜血菌EcoRII5’-N-C-C-N-G-G-N-3’3’-N-G-G-N-C-C-N-5’大腸桿菌EcoRIII5’-A-A-G-C-T-T-3’3’-T-T-C-G-A-A-5’流感嗜血菌******（一）DNA體外重組中常用的酶2

1.限制性內(nèi)切酶3（一）DNA體外重組中常用的酶3

2．T4DNA連接酶：是從噬菌體T4感染過的大腸桿菌中分離出來的。此酶由一條肽鏈組成，分子量6800，催化DNA上的3’-OH與5’-P末端之間的磷酸二酯鍵的形成，既可催化粘性末端又可催化平頭末端間的連接。催化過程需ATP和Mg2+3．大腸桿菌DNA聚合酶I：5’-3’聚合酶活力4．大腸桿菌DNA聚合酶大片段（klenow片段）：將大腸桿菌DNA聚合酶用枯草桿菌素來降解，形成的產(chǎn)物中有一個分子量為76,000的多肽，即為此酶。它失去了5’-3’外切酶活力，其它功能與DNA聚合酶相同，此酶用途很廣。（一）DNA體外重組中常用的酶4

5．T4DNA聚合酶：它存在于噬菌體T4中，與klenow片段相似，5’-3’聚合酶活力比大腸桿菌DNA酶多200倍。6．T4多核苷酸激酶：此酶是從T4感染過的大腸桿菌中分離出來的，它催化ATP上的γ-P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’-OH上，所以可用來標(biāo)記DNA或RNA。7．反轉(zhuǎn)錄酶：合成cDNA的第一條鏈，具有5’-3’DNA聚合酶活力。（一）DNA體外重組中常用的酶5

8．細菌堿性磷酯酶：十分耐熱，可將DNA或RNA的5’-P除去，反應(yīng)常在600C以上進行，以抑制反應(yīng)中其他內(nèi)切酶。9．核酸酶S1：催化單鏈DNA降解，產(chǎn)生5’-P結(jié)尾的單核苷酸或寡核苷酸，用以切除雙鏈cDNA上的發(fā)夾形結(jié)構(gòu)上的單鏈凸環(huán)。10．脫氧核糖核酸酶I：是一種內(nèi)切酶，降解雙鏈或單鏈DNA，產(chǎn)生以5’-P結(jié)尾的單核苷酸及寡核苷酸的混合物。11．polyA聚合酶：催化將AMP加到RNA的3’-OH末端，形成3’-polyA的反應(yīng)。（二）載體（總）

1．定義2．載體必須具備的條件

3．目前常用的載體1．定義

外源DNA片段要進入受體細胞，并在其中進行復(fù)制與表達，必須有一個適當(dāng)?shù)倪\載工具將其帶入細胞內(nèi)，并載著外源DNA一起進行復(fù)制與表達，這種運載工具稱為載體。2．載體必須具備如下條件

（1）在受體細胞中，可以獨立進行復(fù)制，所以其本身必須是一個復(fù)制單位，而且插入外源DNA后不會影響其本身的復(fù)制能力。（2）易于鑒定、篩選。即易將帶有外源DNA的重組體與正常的載體區(qū)別開。（3）易于引入受體細胞。3．目前常用的載體1（總）

（1）質(zhì)粒：是比較小的雙鏈DNA環(huán)形分子，在細菌和酵母中都存在。（2）噬菌體：包括λ噬菌體、裝配型質(zhì)粒（λ噬菌體改造）及M13噬菌體（是一種含有單鏈DNA的噬菌體）。3．目前常用的載體1（總）

3．目前常用的載體2（λ噬菌體為載體）

λDNA用限制酶除去中間一段太小不能被包裝與外源DNA連接重組DNA分子的體外包裝帶有外源DNA的λ噬菌體三、重組的步驟1（1）外源DNA與載體的連接，形成重組DNA（2）通過轉(zhuǎn)化（或感染）將重組DNA引入受體細胞（3）篩選出含有重組體的陽性克隆三、重組的步驟1DNA與載體相連接簡明P235圖12－13、12－14載體外源基因三、重組的步驟2轉(zhuǎn)化與篩選含有不同插入DNA片斷的質(zhì)粒細菌細胞轉(zhuǎn)化并置于有抗生素的介質(zhì)帶有抗藥性質(zhì)粒的細菌才生長鑒定攜有DNA片斷克隆的的菌落，并擴大培養(yǎng)質(zhì)粒DNA純化三、DNA表達的一般步驟11．目的基因的取得2．外源DNA與載體的連接，形成重組DNA3．將重組DNA引入受體細胞4．重組體的篩選5．表達三、DNA表達的一般步驟2待插入的外源DNA質(zhì)粒載體＋連接重組體DNA經(jīng)轉(zhuǎn)化作用或病毒感染引入宿主細胞宿主染色體篩選出具有重組體DNA的細胞克隆DNA重組體的構(gòu)建和克隆1．目的基因的取得－分離法、合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌體或質(zhì)粒從宿主細胞中將目的基因攜出（3）使用相應(yīng)的mRNA分離基因2．外源DNA與載體連接形成重組DNA1（1）粘性末端連接（2）平頭末端連接（3）在DNA片斷末端加上均聚寡核苷酸后連接，在3’-OH端由末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶添加單核苷酸的反應(yīng)（4）用接頭連接：適用于粘端與平端DNA之間的連接外源DNA與載體的DNA之間的連接方式：2．外源DNA與載體連接形成重組DNA2（1）粘性末端連接TGCATGCAACGTGCATE.coli質(zhì)粒限制酶TGCAACGTTGCAACGT限制酶ACGTGCATGCAT混合、退火DNA連接酶連接重組體DNATGCATGCATGCATGCA2．外源DNA與載體連接形成重組DNA3（2）平頭末端連接＋T4DNA連接酶（DNA濃度低）T4DNA連接酶（DNA濃度很高）T4DNA連接酶（DNA濃度低）2．外源DNA與載體連接形成重組DNA4（3