第三章酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第三章酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第1頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容?重要（1）底物濃度（2）酶濃度（3）抑制劑（4）溫度（5）

pH影響因素（6）激活劑酶促反應(yīng)速度目的和意義

找到適宜的反應(yīng)條件提高或抑制酶催化反應(yīng)效率

了解酶在生理代謝過(guò)程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等定義：酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。第2頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1酶催化反應(yīng)速率與酶活力的測(cè)定酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可以用在一定條件下該酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度（reactionvelocity）來(lái)表示，酶活力的高低和化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度的大小兩者呈線(xiàn)性關(guān)系。第3頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.1酶催化反應(yīng)速率隨時(shí)間的變化酶催化的反應(yīng)速度可用在單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或者產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。如圖3-1所示的曲線(xiàn)圖。酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低。圖3-1酶促反應(yīng)的速度曲線(xiàn)第4頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度增加從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行；（2）產(chǎn)物對(duì)酶的抑制作用；（3）隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶的部分失活等。引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低的原因？測(cè)定反應(yīng)初速度的方法來(lái)測(cè)定相關(guān)制劑中酶的含量（活性）。如何避免影響？第5頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.2酶活力的測(cè)定原理酶蛋白的含量很低，很難直接測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量，且常與其他各種蛋白質(zhì)混合存在，將其提純耗時(shí)費(fèi)力。故不能直接用重量或體積等指標(biāo)來(lái)衡量。分光光度法熒光法同位素法電化學(xué)方法其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等測(cè)定酶活力常用的方法：測(cè)定酶活力的基本原理測(cè)定底物減少量測(cè)定產(chǎn)物增加量第6頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.3酶活力測(cè)定時(shí)需注意：（1）選擇反應(yīng)的最適溫度，根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。（2）速度要快，取反應(yīng)的初速度（3）底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反映待測(cè)酶的活力第7頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響第8頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.1中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)最早是由Henri和Wurtz兩位科學(xué)家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶濃度不變時(shí)，可以測(cè)出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度，以該反應(yīng)速度對(duì)底物濃度作圖，可得到如圖3-2所示的曲線(xiàn)。

圖3-2底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響第9頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Henri和Wurtz提出了酶促化學(xué)反應(yīng)的酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為：當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，酶(E)首先需要和底物(S)結(jié)合生成酶底物中間絡(luò)合物即中間復(fù)合物(ES)，然后再生成產(chǎn)物(P)，同時(shí)釋放出酶。該學(xué)說(shuō)可以用下面的化學(xué)反應(yīng)方程式來(lái)表示：酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)E+S

k1k2k3ESE+P第10頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)酶還未被底物所飽和酶已全部被底物所飽和第11頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.2酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten兩位科學(xué)家在前人工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)，推導(dǎo)出一個(gè)數(shù)學(xué)方程式，用來(lái)表示底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的量化關(guān)系，通常把這個(gè)數(shù)學(xué)方程式稱(chēng)為米氏方程：[S]：底物濃度

V：不同[S]時(shí)的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)第12頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一米氏常數(shù)Km的含義Km值就代表著反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。

。2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]Km＝[S]Km值的推導(dǎo)：第13頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一米氏常數(shù)的應(yīng)用價(jià)值Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)：也就是說(shuō)Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。Km值還可以用于判斷酶的專(zhuān)一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱(chēng)為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的—個(gè)度量指標(biāo)，用來(lái)表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個(gè)酶的Km值，就可以計(jì)算出在某一底物濃度條件下，其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vmax的百分比。

Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應(yīng)才會(huì)在競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)。第14頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一米氏方程的雙倒數(shù)作圖雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱(chēng)為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法

Vmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數(shù)-1/Km1/[S]1/V0第15頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響當(dāng)[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比關(guān)系式為：

V=K3[E]0

V

[E]

當(dāng)[S]>>[E]時(shí)，Vmax=k3[E]酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響E+S

k1k2k3ESE+P第16頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響區(qū)別于酶的變性抑制劑對(duì)酶有一定選擇性引起變性的因素對(duì)酶沒(méi)有選擇性酶的抑制劑(inhibitor)：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱(chēng)為酶的抑制劑。第17頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制以及闡明機(jī)體代謝途徑的基本手段。（2）可以為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中設(shè)計(jì)新藥物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中設(shè)計(jì)新農(nóng)藥提供重要的理論依據(jù)。（3）在食品生產(chǎn)和保鮮中控制酶的催化效率。研究抑制劑的意義第18頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.1抑制作用的類(lèi)型及鑒別根據(jù)抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆，我們可以將抑制作用分為兩大類(lèi)，即：不可逆的抑制作用(irreversibleinhibition)可逆的抑制作用(reversibleinhibition)第19頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一鑒別不可逆抑制作用抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失。是不可逆的。本質(zhì)上來(lái)說(shuō)就是酶的修飾抑制可逆抑制作用由于抑制劑與酶以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失。是可逆的。鑒別方法（1）能否用透析、超濾和凝膠過(guò)濾等物理方法除去抑制劑？（2）化學(xué)動(dòng)力學(xué)的方法（見(jiàn)下圖）如何鑒別？第20頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一圖3-4可逆抑制劑與不可逆抑制劑的區(qū)別（一）曲線(xiàn)1，無(wú)抑制劑；曲線(xiàn)2，不可逆抑制劑；曲線(xiàn)3，可逆抑制劑第21頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.2不可逆的抑制作用根據(jù)不可逆抑制劑選擇性的差異，通常把不可逆抑制劑分為兩種類(lèi)型，即非專(zhuān)一性不可逆抑制劑和專(zhuān)一性不可逆抑制劑。第22頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一①非專(zhuān)一性不可逆抑制劑有機(jī)磷化合物有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物重金屬鹽烷化劑硫化物、氰化物和CO非專(zhuān)一性青霉素與絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合與半胱氨酸的巰基共價(jià)結(jié)合使酶蛋白變性與酶多個(gè)必須基團(tuán)結(jié)合與酶中金屬離子形成穩(wěn)定絡(luò)合物機(jī)理與糖肽轉(zhuǎn)肽酶絲氨酸羥基結(jié)合第23頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一舉例1：有機(jī)磷化合物對(duì)羥基酶的抑制

有機(jī)磷化合物羥基酶解毒------解磷定(PAM)第24頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一路易士氣失活的酶巰基酶失活的酶酸BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物舉例2：有機(jī)砷對(duì)巰基酶的抑制砷化合物巰基酶解毒------二巰基丙醇(BAL)第25頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一②專(zhuān)一性不可逆抑制劑a) Ks型不可逆抑制劑：具有與底物相類(lèi)似的結(jié)構(gòu)例如：對(duì)甲苯磺酰-L-賴(lài)氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶的底物對(duì)甲苯硫磺-L-賴(lài)氨酰甲酯（TLME）具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)b) Kat型不可逆抑制劑：不但具有與天然底物相類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，而且抑制劑本身也是酶的底物，專(zhuān)一性極高，因此也被稱(chēng)為自殺性底物。例如：β-鹵代-D-Ala是丙氨酸消旋酶的不可逆抑制劑第26頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4.3可逆的抑制作用根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系，我們將可逆抑制作用分為三種類(lèi)型。競(jìng)爭(zhēng)性抑制1非競(jìng)爭(zhēng)性抑制2反競(jìng)爭(zhēng)性抑制3第27頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一①競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)：是最常見(jiàn)的一種可逆抑制作用。大多數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心，從而阻礙酶底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。其抑制程度取決于底物和抑制劑的相對(duì)濃度，可以通過(guò)增加底物濃度的方法來(lái)解除這種抑制作用。第28頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)模式在競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，底物(S)或抑制劑(I)與酶(E)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：[S]>>[I]：高濃度的底物可解除抑制第29頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一圖3-5競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線(xiàn)⑴Vm值不變，(表觀）Km值增大；⑵Km隨抑制劑濃度[I]的增加而增加；⑶雙倒數(shù)作圖所得直線(xiàn)相交于縱軸；⑷抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除。特點(diǎn)：第30頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸合成酶舉例：磺胺類(lèi)藥物的抑菌機(jī)制第31頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(noncompetitiveinhibition)：非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(I)和底物(S)可以同時(shí)與酶(E)結(jié)合，兩者之間不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。但是在酶與抑制劑結(jié)合后，還可以進(jìn)一步與底物結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI；酶與底物結(jié)合后，也可以進(jìn)一步與抑制劑結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。第32頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)模式在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑(I)與酶(E)或酶-底物復(fù)合物(ES)以及底物(S)與酶-抑制劑復(fù)合物(EI)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：+

S－S+

S－S+ESIEIEESEP第33頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一圖3-6非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線(xiàn)⑴Vm值降低，Km值不變；Vm隨[I]的增加而降低；⑵雙倒數(shù)作圖所得直線(xiàn)相交于橫軸；⑶抑制劑對(duì)酶與底物的結(jié)合無(wú)影響，故底物濃度的改變對(duì)抑制程度無(wú)影響；抑制程度取決于抑制劑的濃度。特點(diǎn)：第34頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一這類(lèi)抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。有某些重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等對(duì)酶的抑制作用也屬于這一類(lèi)。EDTA對(duì)金屬酶的抑制。舉例：第35頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一③反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(uncompetitiveinhibition)：這類(lèi)抑制作用的特點(diǎn)是只有在酶(E)與底物(S)結(jié)合后，才能與抑制劑(I)結(jié)合，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI，與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制相似，這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。第36頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一反競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)模式反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)是，酶(E)必須先與底物(S)結(jié)合，然后才與抑制劑(I)結(jié)合，即抑制劑(I)與酶-底物復(fù)合物(ES)的結(jié)合是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：++ESESESIEP第37頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一圖3-7反競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線(xiàn)⑴Vm值和Km值都隨[I]的增加而降低；⑵雙倒數(shù)作圖所得為一組平行線(xiàn)；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加。特點(diǎn)：第38頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一舉例：這種抑制作用在單底物反應(yīng)中比較少見(jiàn)，而常見(jiàn)于多底物反應(yīng)中。目前已經(jīng)證明，肼類(lèi)化合物對(duì)胃蛋白酶的抑制作用、氰化物對(duì)芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多種氨基酸對(duì)堿性磷酸酶的抑制作用都屬于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。第39頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一為了方便理解和記憶，我們現(xiàn)將無(wú)抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結(jié)歸納在表3-1中?？偨Y(jié)：第40頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5其它因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響其它各種影響酶促反應(yīng)速度的因素主要包括：溫度、pH和激活劑等。第41頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.1溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響溫度對(duì)酶促反應(yīng)的雙重影響：一、當(dāng)溫度升高時(shí)，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度加快（Q10一般等于2）。二、溫度升高隨著溫度逐漸升高，酶蛋白會(huì)因逐漸變性而失活）。第42頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一圖3-9溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響酶在固體狀態(tài)下比在溶液中對(duì)溫度的耐受力更高。酶的冰凍干粉制劑通常在冰箱中可存放幾個(gè)月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存數(shù)周。所以酶制劑以固體保存為佳。第43頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的酶最適溫度一般為35～40℃，植物細(xì)胞中的酶最適溫度較動(dòng)物細(xì)胞中稍高，通常在40～50℃之間，而微生物中的酶最適溫度差別則較大，如用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶的最適溫度可高達(dá)70℃。第44頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5.2pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響通常在一定pH下，酶會(huì)表現(xiàn)出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就會(huì)降低，我們把表現(xiàn)出酶最大活力時(shí)的pH稱(chēng)為該酶的最適pH。在不同pH條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng)，然后將所測(cè)得的酶促反應(yīng)速度相對(duì)于pH來(lái)作圖，即可得到如圖3-10所示的鐘罩形曲線(xiàn)。圖3-10pH對(duì)酶活力的影響第45頁(yè)，共50頁(yè)，2023年，2月20日，星期一pH影響酶活力的原因可能包括以下3個(gè)方面：(1)過(guò)酸或過(guò)堿使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起酶變性從而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變、酶活性隨之喪失。(2)pH影響了底物的解離狀態(tài)或酶分子活性部