凝血講義2011-10-28課件

血栓與止血檢測血栓與止血檢測一、止血、凝血和纖溶機制

二、凝血及纖溶實驗室檢測進展

三、血凝質(zhì)控

四、目前開展血凝項目的臨床意義

五、常見分析錯誤的原因分析

血栓與止血檢測一、止血、凝血和纖溶機制

（一）血管壁的作用1.血管的收縮（神經(jīng)反射；內(nèi)皮素、血管緊張素；TXA2、5-HT）。2.血小板的激活（表達并釋放血管性血友病因子vWf，導(dǎo)致血小板在損傷部位黏附和聚集）。3.啟動內(nèi)、外源凝血（因子Ⅻ的激活和組織因子TF的釋放）。4.局部血黏度增高。血栓與止血檢測（二）血小板的作用1.形成血小板血栓(白色血栓)，機械性修復(fù)受損血管。2.血管受損→GPⅠb→經(jīng)vWf→粘附3.釋放血小板第三因子（PF3）直接參與凝血反應(yīng)。4.活化血小板在前激肽釋放酶及高分子量激肽原存在的條件下，直接激活FⅫ及FⅪ。5.ADP(來自紅細(xì)胞)、凝血酶、膠原→血小板→GPⅡb/Ⅲa→結(jié)合Fg血栓與止血檢測（三）凝血因子的作用1.外源性凝血途徑2.內(nèi)源性凝血途徑3.凝血共用途徑注意①12個凝血因子除FⅢ、FⅣ、和部分FⅧ外，主要產(chǎn)生于肝臟。②FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ是維生素K依賴因子③血友?。?、乙、丙）三種分別缺少FⅧ、FⅨ、FⅪ，均影響內(nèi)源性凝血途徑。IntrinsicXII,XI,IX,VIII(APTT)Extrinsic-VII(PT)ProthrombinThrombinFibrinogenFibrinCommonPath(TT)FXFXaXIIIaXIIIThrombinFibrin(strong)FibrinogenFibrin(weak)IXXIXIaIXaXaVaXIIaProthrombinTF-VIIa(Prothrombinase)PLPL(Tenase)VIIIaPLXIntrinsicPathwayHKaExtrinsicPathwayTFPathwayProteinC,ProteinS,AntithrombinIII血栓與止血檢測（四）抗凝血系統(tǒng)的作用1.細(xì)胞抗凝作用：包括單核巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞2.體液抗凝作用抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）肝素介導(dǎo)下滅活凝血酶、FⅨa、FⅩa、FⅪa、FⅫa滅活TF/Ⅶa、FⅩaTFPI蛋白C和蛋白S滅活FⅤa、FⅧa激活纖溶系統(tǒng)二、凝血及纖溶實驗室檢測進展血液凝固是一個復(fù)雜的生理生化代謝過程實質(zhì)是通過一系列酶促反應(yīng)，使血漿中呈液態(tài)的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成固態(tài)的纖維蛋白絲，因而凝血是屬于生理生物化學(xué)范疇的課題涉及血液學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)等諸多領(lǐng)域由于這些相關(guān)學(xué)科研究的日益深入，不斷地給凝血的理論和實踐注入新的內(nèi)容，因此，在測定方法學(xué)上也由過去精密度低的方法過渡到精密度高的方法。凝血及纖溶檢測方法凝血及纖溶檢測項目越來越多，目前應(yīng)用的實驗大體分為：篩篩選試驗和確證試驗方法學(xué)上又可分為三大類：功能測定免疫學(xué)測定化學(xué)測定功能測定PT測定是檢測凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的過篩試驗，要用統(tǒng)一標(biāo)有國際敏感指數(shù)(ISI)的凝血活酶試劑，在抗凝治療監(jiān)控和決定用藥劑量時，一定要用國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)報告APTT是公認(rèn)較好的檢測“內(nèi)源性”凝血因子缺陷的過篩試驗，基本上可用于代替了過去的凝血時間測定，凝血時間的測定不管是玻片法還是試管法，都過于粗糙，敏感性太差。以前用于個別凝血因子缺乏的一些“糾正”試驗以及所謂的“凝血活酶生成”試驗，都因操作繁瑣，敏感性不高，已經(jīng)淘汰免疫學(xué)測定

是近年來發(fā)展最快的檢測方法，其原理是以純化的被檢物質(zhì)為抗原，制備相應(yīng)的抗體，然后用抗原抗體反應(yīng)原理對被檢物質(zhì)進行定性或定量測定其方法采用ELISA、膠乳微粒凝集、火箭電泳等方法。對許多新發(fā)現(xiàn)的抗凝因子，纖溶和纖溶抑制因子，纖維蛋白原裂解，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物，凝血酶原活化等過程中被切下的小肽，如我們目前開展的FDP、D-二聚體等的測定，基本上都用免疫學(xué)方法檢測免疫學(xué)測定從理論上講，免疫學(xué)測定不可能全部取代功能測定。因為免疫學(xué)測定的僅是該因子的抗原性，只能表明體內(nèi)存在該因子，但卻不能說明其是否有生物活性，而功能測定則是測該因子在凝血或纖溶中的生理生化功能。三、凝血及纖溶實驗質(zhì)控

質(zhì)量是醫(yī)學(xué)檢驗工作的生命線，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)檢驗工作中的關(guān)鍵問題凝血與纖溶檢驗質(zhì)量，關(guān)鍵在于診斷試劑。以往，大量凝血檢測試劑由于各實驗室自行制備，手工操作難以達到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和全國、全球標(biāo)準(zhǔn)化，也難以達到室內(nèi)、室間質(zhì)控的要求為此WHO和血栓和止血委員會（ICTH）制定了一些標(biāo)準(zhǔn)或提供少數(shù)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品供各國校準(zhǔn)各種試劑和方法。國內(nèi)市場上能購到的商品試劑來源，國外主要有美國、法國；國內(nèi)有天津、上海、北京、福建等。凝血及纖溶實驗質(zhì)控我們臨床檢驗工作者都要從方法學(xué)與試劑的標(biāo)準(zhǔn)化等方面嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，全面系統(tǒng)地掌握新的知識動態(tài)，進一步提高質(zhì)量意識，使我國在凝血與纖溶測定總體水平上進一步提高，與國際接軌。凝血及纖溶實驗質(zhì)控良好的檢測結(jié)果靠三方面來獲得:精確度儀器：靠保養(yǎng)、靠校準(zhǔn)可靠的試劑：合格，優(yōu)質(zhì)規(guī)范的操作：嚴(yán)格按SOP文件凝血及纖溶實驗質(zhì)控準(zhǔn)確性：是儀器、試劑、消耗品、操作人員的綜合體現(xiàn)包括：儀器的計算公式、標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑的保存、制備、存放效期試劑污染來源的控制質(zhì)控—不規(guī)范洗針問題高濃度清洗液洗針—腐蝕樣品針導(dǎo)致重復(fù)性下降次氯酸鈉殘留導(dǎo)致干擾結(jié)果低濃度清洗液洗針—不能有效滅活凝血酶，造成交叉污染結(jié)果不準(zhǔn)針容易堵塞、半堵塞造成樣本、試劑加樣不準(zhǔn)

日常工作中應(yīng)注意的問題（一）血標(biāo)本應(yīng)注意的問題

1.采血后標(biāo)本在低溫保存時間范圍：有報道在32℃保存血漿6、12、24hⅧ因子活性可分別消失50%、60%、95%，即使保存在4℃也分別消失5%、55%、70%。V因子活性在32℃分別消失25%、40%、80%，而在4℃則僅損失0%、5%、10%。因此測定APTT的血漿在-80℃至少可保存1個月、4℃為6h、20℃為4h、而32℃僅為2h。測定PT的血漿，在4℃為24h、20℃為6h、32℃為2h。（二）實驗操作應(yīng)注意的問題

許多試驗誤差都來源于技術(shù)的錯誤。在實驗技術(shù)、試劑、溫度及pH值上很微小的變化都會導(dǎo)致試驗結(jié)果明顯的變化離心因素。APTT、PT需乏血小板血漿，一般3000r/min離心10min后分離血漿。離心前注意標(biāo)本量，離心后注意血漿的量（Hct）以保證抗凝劑與標(biāo)本量最適比例試驗前檢查血漿是否有溶血、黃疸、脂血和出現(xiàn)凝塊。紅細(xì)胞膜含有磷脂，溶血標(biāo)本具有與血小板第Ⅲ因子（磷脂）相似的凝血活性，這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標(biāo)本中如果出現(xiàn)凝塊，無論凝塊多么小，均會影響試驗結(jié)果。

四、開展出凝血檢測的內(nèi)容與臨床意義意義：：1．出血性疾病進行診斷與分型(血友病，血小板病)2．血栓性疾病的診斷與分型(易栓癥，高凝狀態(tài))3．DIC診斷與分期，療效觀察4．藥物治療監(jiān)測(抗凝、抗血小板、溶栓治療)5．術(shù)前常規(guī)檢查INR值：國際標(biāo)準(zhǔn)化比率計算公式：INR=（測量PT/正常PT）ISI意義：它不但建立了測量值與正常人的對照，而且，排除了不同實驗室、不同試劑之間的差異，使它的值更具有臨床統(tǒng)一的意義。在口服抗凝劑的監(jiān)測中更有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的臨床意義。血栓與止血檢測活化部分凝血活酶時間（APTT）原理參考值

該測定是在受檢血漿中加入APTT試劑（接觸因子激活劑和部分磷脂）和鈣離子后，觀察其凝固時間。

本試驗是反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)各凝血因子總的凝血狀況的篩選試驗。手工法：28—40秒，較正常對照值延長10秒以上為異常。APTT

臨床應(yīng)用：活化部分凝血活酶時間（APTT）是檢查內(nèi)源性凝血因子的一種過篩試驗，是用來證實先天性或獲得性凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的缺陷或是否存在它們相應(yīng)的抑制物，同時，APTT也可用來激肽釋放酶原(PK)和高分子量激肽釋放酶原(HMWK)是否缺乏，由于APTT的高度敏感性和肝素的作用途徑主要是內(nèi)源性凝血途徑，所以APTT成為監(jiān)測普通肝素首選指標(biāo)，前后之比1.5-2.5為佳。

APTT縮短：DIC高凝期，血栓性疾病等。

EXIIXICa++Ca++Ca++IVIIIIXVIXVIIICa++

纖維蛋白原（Fg）測定

正常凝血反應(yīng)的最終結(jié)果為纖維蛋白原反應(yīng)生成纖維蛋白，所以，纖維蛋白原的檢測也十分重要。參考值：2-4g/L增高見于糖尿病、急性心肌梗塞、急性感染、結(jié)締組織病、急性腎炎、燒傷、多發(fā)性骨髓瘤、休克、大手術(shù)、妊高癥、惡性腫瘤、血栓前狀態(tài)、放射治療２.減低見于DIC、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎和肝硬化、先天性纖維蛋白原缺乏癥（二）抗凝血功能檢測1.凝血酶時⑴檢查Fg有無異常間測定(TT)⑵檢查循環(huán)血中有無抗凝物⑶共同途徑異常標(biāo)志2.抗凝血酶ⅢAT-Ⅲ活性增高→出血AT-Ⅲ活性降低→血栓形成3.血漿蛋白細(xì)胞抗原測定(PC)必須轉(zhuǎn)換成活化的蛋白細(xì)胞(APC)才發(fā)揮抗凝作用減低:見于先天或獲得性PC缺乏癥，后者鑒于DIC、肝病血栓與止血檢測血漿凝血酶時間參考值16～18s，受檢TT值延長超過正常對照3s以上為延長臨床意義延長見于:低（無）纖維蛋白原血癥和異常纖維蛋白原血癥；血中FDP增高（如DIC）；血中有肝素或類肝素物質(zhì)存在（如肝素治療中、SLE和肝臟疾病等。）

縮短：①高FIB血癥②鈣離子存在時或標(biāo)本有微小凝結(jié)塊及PH呈酸性

抗凝血酶-3（AT-Ⅲ）

AT-Ⅲ是一種單鏈糖蛋白，屬于α2球蛋白，主要由肝臟合成。AT-Ⅲ是依賴肝素的絲氨酸蛋白酶抑制物，故肝素作用于AT-Ⅲ的賴氨酸殘基，可使AT-Ⅲ的抗凝血酶作用增強1000倍。AT-Ⅲ除對凝血酶有抑制作用外，對Xa、Ⅸa、Ⅺa、Ⅶa、纖溶酶（血漿素），胰蛋白酶也有抑制作用，而且它對因子Ⅹa的親和力大于凝血酶，所以對因子Ⅹ抗凝血酶-3（AT-Ⅲ）AT-Ⅲ活性增高：見于某些出血性疾病，如血友病、再生障礙性貧血、心瓣膜?。ㄐ牧λソ吒文[大者）AT-Ⅲ活性增高。腎臟疾病尿毒癥腎移植后1～2年內(nèi)個別AT-Ⅲ活性不增高者可因肺栓塞而死亡。服肝素類抗凝藥物后，AT-Ⅲ的活性會增高，停藥后即可恢復(fù)正常AT-Ⅲ活性減低：見于彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）、肝硬化、敗血癥、血栓形成性疾?。ㄐ募」Ｈ?，靜脈血栓形成等），先天性AT-Ⅲ缺陷，口服避孕藥.

動態(tài)觀察血中AT-Ⅲ含量的變化對監(jiān)護治療效果及了解預(yù)后情況均是有力的依據(jù)

（三）纖維蛋白溶解功能檢測1.纖溶酶原測定(PLG)增高表示纖溶活性見于血栓前狀態(tài)和血栓降低表示纖溶活性見于原發(fā)繼發(fā)纖溶和PLG缺乏2.纖溶酶—纖溶酶抑制物復(fù)合體(PIC)能較快地反映纖溶活性(PIC半衰期6h)，體內(nèi)纖溶情況的指標(biāo)3.血漿硫酸魚精蛋白副凝試驗(3p試驗)了解血中FDP.FM.尤其是X片段存在4.D二聚體測定(D-dimer)鑒別原發(fā)性、繼發(fā)性纖溶癥重要指標(biāo)5.纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)纖溶亢進的標(biāo)志D-dimers檢測臨床應(yīng)用①深靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)活動性深靜脈血栓形成肺栓塞時，血漿D-D顯著升高；而陳舊性靜脈血栓，D-D往往不增高；動脈血栓性疾病，如冠心病，動脈硬化等，D-D增高不如靜脈血栓顯著。排除肺栓塞（PE）D-D總體敏感性90-95%，特異性(45%–68%),值得納入診斷標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)D-D陰性,臨床上中低度可疑PE，并且V/Q造影不確定的患者，可不再進一步檢查。D-dimers檢測臨床應(yīng)用②彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)和凝血因子消耗③繼發(fā)的纖溶(與膿血癥，腫瘤，燒傷，先兆子癇等相關(guān)）④纖溶治療D-dimers檢測臨床應(yīng)用D-二聚體不增高見于：原發(fā)性纖溶癥時，D-二聚體不增高，是與繼發(fā)性纖溶亢進的鑒別要點。陳舊性血栓形成時，D-二聚體不增高。短時間內(nèi)的D-二聚體改變，常見于藥物應(yīng)用后。血栓與止血檢測血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定參考值小于5mg/L臨床意義增高見于:原發(fā)性纖溶癥、DIC、惡性腫瘤、急性早幼粒細(xì)胞白血病、肺梗塞、DVT、肝臟疾病等。

判定纖溶發(fā)展的階段監(jiān)測外科手術(shù)是否使器官陷于纖溶酶原活化的高風(fēng)險狀態(tài)D-dimers與FDP聯(lián)合應(yīng)用的意義

1）DIC的診斷：原發(fā)性纖溶亢進時，由于無血栓形成，F(xiàn)DP顯著升高，D-D一般不增高；繼發(fā)性纖溶亢進時，血漿D-D顯著升高，二者聯(lián)合檢測有利于提高DIC實驗室診斷的靈敏度和特異性，尤其對早期DIC的診斷更有意義2）溶栓治療的監(jiān)測：溶栓治療深靜脈血栓或急性腦梗后2天內(nèi)D-dimers增高2～3倍，但FDP升高10～13倍，以后逐漸下降；到7天時，D-D已低于溶栓前水平，但FDP仍比溶栓前高5倍。（四）凝血和抗凝血功能篩選指標(biāo)1、凝血時間測定（CT）2、活化部分凝血活酶時間測定（APTT）3、血漿凝血酶原時間測定（PT）4、血漿纖維蛋白原測定(Fbg)5、復(fù)鈣交叉試驗（CRT)

輕癥時過篩試驗可陰性（五）纖溶活性檢查的篩選試驗1、優(yōu)球蛋白溶解試驗（ELT)2、血漿凝血酶時間（TT)3、血漿硫酸魚精蛋白副凝集試驗（3P)4、血漿纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定（FDP）5、D-二聚體檢測血栓與止血檢測血小板檢測（一）血小板計數(shù)（PC或plt）參考值（100～300）×109/L臨床意義1。血小板減少：PC低于100×109/L稱為血小板減少。常見于：①血小板生成障礙②血小板破壞或消耗過多③血小板分布異常血栓與止血檢測2。血小板增高：PLT高于400×109/L稱為血小板增多。常見于：①原發(fā)性增多②反應(yīng)性增多（二）血小板相關(guān)免疫球蛋白測定（PAIg）血小板相關(guān)免疫球蛋白測定包括：血小板相關(guān)免疫球蛋白G（PAlgG）、PAIgM和PAIgA測定。參考值PAlgG0～78.8ng／107血小板；PAlgM0～7.0ng／107血小板；PAIgA0～2.0ng／107血小板。血栓與止血檢測臨