核酸化學(xué)3的教案

核酸化學(xué)3的教案第1頁/共75頁一、核酸的水解(一)酸水解糖苷鍵比磷酸酯鍵更易水解，特別是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵很容易水解。(二)堿水解通常用于RNA水解，DNA的堿水解比較困難。第2頁/共75頁HydrolysisofRNAunderalkalineconditions.The2′hydroxylactsasanucleophileinanintramoleculardisplacement.The2′,3′-cyclicmonophosphatederivativeisfurtherhydrolyzedtoamixtureof2′-and3′-monophosphates.DNA,whichlacks2hydroxyls,isstableundersimilarconditions.第3頁/共75頁Cleavageinpolynucleotidechains:acleavageyields5'-phosphateproducts,whereasbcleavagegives3'-phosphateproducts.第4頁/共75頁(三)酶水解Snakevenomphosphodiesteraseandspleenphosphodiesteraseareexonucleasesthatdegradepolynucleotidesfromoppositeends.第5頁/共75頁Anexampleofnucleasespecificity:ThespecificityofRNAhydrolysisbybovinepancreaticRNase.ThisRNasecleavesbat3'-pyrimidines,yieldingoligonucleotideswithpyrimidine3'-PO4ends.第6頁/共75頁第7頁/共75頁

DNA與限制性內(nèi)切酶雙鏈DNA分子可以被上千種從微生物中分離得到的限制性內(nèi)切酶（restrictionenzyme）切斷,又可以再連接起來。切斷的過程不需要能量，而連接的起來的過程卻需要2個分子的ATP。這就是分子克隆和DNA重組技術(shù)的基礎(chǔ)。大部分限制性內(nèi)切酶識別的堿基序列為4~6個堿基的palindrome順序。它們在微生物細胞內(nèi)發(fā)揮的是防御外來DNA入侵的國防軍的作用。第8頁/共75頁第9頁/共75頁第10頁/共75頁第11頁/共75頁二、核酸的酸堿性質(zhì)

堿基配對時堿基一般以酮式存在，而不是醇烯式。堿基中的H原子一般不移動，因此很少有亞氨基團。在中性pH條件下，參與氫鍵的-NH2基均不帶電荷，這是雜環(huán)電子共軛以及氫鍵共同作用的結(jié)果，否則雙螺旋結(jié)構(gòu)不會穩(wěn)定。第12頁/共75頁堿基adenine4.15,9.8cytosine4.5,12.2guanine3.2,9.6thymine9.9,>13核苷adenosine3.5,12.5deoxyadenosine3.8cytidine4.15,12.5deoxycytidine4.3,>13guanosine1.6,9.2deoxyguanosine2.5uridine9.2,12.5deoxythymidine9.8,>13核苷酸AMP3.7,6.1:dAMP4.4ADP3.9,6.3:---------CMP4.5,6.3:dCMP4.6GMP2.4,6.1,9.4:dGMP2.9,9.7UMP6.4,9.5:dTMP10.0堿基、核苷、核苷酸的pK值第13頁/共75頁[HCl][NaOH]不存在自由的第二磷酸基亞氨基緩沖區(qū)烯醇式羥基緩沖區(qū)由雙鏈變?yōu)閱捂溣蓡捂溩優(yōu)殡p鏈第14頁/共75頁三、核酸的紫外吸收

在光徑為1cm時，若A260為1，則溶液中核酸的含量為：dsDNA50g；ssDNA37g；RNA40g，或者說，測得某核酸溶液的A260后，計算其核酸濃度的公式為：DAN(μg/mL)=A260

/0.020RAN(μg/mL)=A260

/0.025第15頁/共75頁DNA分子的變性四、核酸的變性，復(fù)性及雜交（一）變性變性和復(fù)性的含義第16頁/共75頁HeatdenaturationofDNA.(a)Thedenaturation,ormelting,curvesoftwoDNAspecimens.Thetemperatureatthemidpointofthetransition(Tm)isthemeltingpoint;itdependsonpHandionicstrengthandonthesizeandbasecompositionoftheDNA.(b)RelationshipbetweentmandtheGCcontentofaDNA.第17頁/共75頁影響Tm的因素

1.DNA的均一性越高,Tm的溫度范圍越小。

2.G-C含量越高,Tm的值越大，若GC的含量上升1%，則Tm上升0.4℃。馬默多蒂（Marmur-Doty）關(guān)系式：

Tm=69.3+0.41(G+C)%，或GC%=（Tm-69.3）×2.443.介質(zhì)的離子強度較高時,Tm的值較大。

4.酸性條件下,核酸容易脫嘌呤,堿性條件下,核酸容易變性,通常加NaOH降低Tm的值。

5.尿素,甲酰胺等化學(xué)試劑可以降低Tm的值,稱作變性劑。

第18頁/共75頁HeatdenaturationofDNAfromvarioussources,so-calledmeltingcurves.Themidpointofthemeltingcurveisdefinedasthemeltingtemperature,Tm.第19頁/共75頁SSC溶液，常用于DNA的溶解。Thedependenceofmeltingtemperatureonrelative(G+C)contentinDNA.NotethatTmincreasesifionicstrengthisraisedatconstantpH(pH7);0.01Mphosphate+0.001MEDTAversus0.15MNaCl/0.015MNacitrate.In0.15MNaCl/0.015MNacitrate,duplexDNAconsistingof100%A:Tpairsmeltsatlessthan70oC,whereasDNAof100%G:ChasaTmgreaterthan110oC.第20頁/共75頁第21頁/共75頁第22頁/共75頁(二)復(fù)性StepsinthethermaldenaturationandrenaturationofDNA.Thenucleationphaseofthereactionisasecond-orderprocessdependingonsequencealignmentofthetwostrands.Thisprocesstakesplaceslowlybecauseittakestimeforcomplementarysequencestoencounteroneanotherinsolutionandthenalignthemselvesinregister.Oncethesequencesarealigned,thestrandszipperupquickly.第23頁/共75頁影響復(fù)性速度的因素

1.DNA的片段越大，復(fù)性的速度越慢；

2.DNA的濃度越高，復(fù)性的速度越快；

3.DNA的重復(fù)序列越多，復(fù)性的速度越快；

4.溶液的pH過高或過低，復(fù)性的速度均會降低；

5.適當(dāng)增高溶液的離子強度，復(fù)性的速度會增高。第24頁/共75頁T1/2×C＝constDNA濃度與復(fù)性時間的關(guān)系第25頁/共75頁第26頁/共75頁Thesec0tcurvesshowtheratesofreassociationofdenaturedDNAfromvarioussourcesandillustratehowtherateofreassociationisinverselyproportionaltogenomecomplexity.TheDNAsourcesareasfollows:poly+polyU,asyntheticDNAduplexofpolyAandpolyUpolynucleotidechains;mousesatelliteDNA,afractionofmouseDNAinwhichthesamesequenceisrepeatedmanythousandsoftimes;MS-2dsRNA,thedouble-strandedformofRNAfoundduringreplicationofMS-2,asimplebacteriophage;T4DNA,theDNAofamorecomplexbacteriophage;E.coliDNA,bacterialDNA;calfDNA(nonrepetitivefraction),mammalianDNA(calf)fromwhichthehighlyrepetitiveDNAfraction(satelliteDNA)hasbeenremoved.Arrowsindicatethegenomesize(inbp)ofthevariousDNAs.第27頁/共75頁DNA復(fù)性與Cot分析當(dāng)C/C0=1/2時，k=1/C0t1/2第28頁/共75頁

哺乳動物的DNA一般均呈右圖的曲線，這是因為它們的基因組DNA中插入了大量的重復(fù)序列，如人的DNA中就插入了長度為350bp的Alu序列達50萬份拷貝之多。人DNA的Cot曲線第29頁/共75頁(三)DNA的分子雜交技術(shù)

分子雜交是將不同來源的核酸分子分別變性，再混合后復(fù)性，使不同來源的單鏈的互補區(qū)形成雙鏈的技術(shù)。通常將其中的一方用放射性同位素或特定的基團(如生物素,地高辛)標(biāo)記，稱作探針，現(xiàn)時的探針多為人工合成的短片段。若將雜交的另一方直接點到膜上進行雜交，稱作點雜交。對組織切片或菌落進行處理后再雜交稱作原位雜交。分子雜交的廣泛應(yīng)用是將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，進行變性凝膠電泳，將凝膠電泳形成的DNA區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再進行雜交，這種技術(shù)稱作Southern雜交。將RNA凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再進行雜交稱作Northern雜交。將蛋白質(zhì)凝膠電泳形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再與酶標(biāo)抗體進行特異反應(yīng)稱作Western印跡技術(shù)。將蛋白質(zhì)等點聚焦形成的區(qū)帶轉(zhuǎn)移到膜上再與酶標(biāo)抗體進行特異反應(yīng)稱作Eastern印跡技術(shù)。

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分子雜交技術(shù)在現(xiàn)代生命科學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。將人工合成的探針用點樣機點到玻璃或塑料基片上形成高密度的陣列，將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一定大小的片段，變性后用熒光基團標(biāo)記，再進行分子雜交操作，這就是DNA芯片技術(shù)的基本原理。用類似的技術(shù)可以制成蛋白質(zhì)芯片。按指令在基片上合成探針，可以制成密度特別高的芯片。生物芯片技術(shù)有非常廣闊的應(yīng)用前景。第31頁/共75頁第32頁/共75頁第33頁/共75頁TheSouthernblottingtechniqueinvolvesthetransferofelectrophoreticallyseparatedDNAfragmentstoanitrocellulosesheetandsubsequentdetectionofspecificDNAsequences.ApreparationofDNAfragments[typicallyarestrictiondigest,(1)]isseparatedaccordingtosizebygelelectrophoresis(2).TheseparationpatterncanbevisualizedbysoakingthegelinethidiumbromidetostaintheDNAandthenilluminatingthegelwithUVlight(3).EthidiumbromidemoleculesintercalatedbetweenthehydrophobicbasesofDNAarefluorescentunderUVlight.ThegelissoakedinstrongalkalitodenaturetheDNAandthenneutralizedinbuffer.Next,thegelisplacedonasheetofnitrocellulose(orDNA-bindingnylonmembrane),andconcentratedsaltsolutionispassedthroughthegel(4)tocarrytheDNAfragmentsoutofthegelwheretheyareboundtightlytothenitrocellulose(5).Incubationofthenitrocellulosesheetwithasolutionoflabeled,single-strandedprobeDNA(6)allowstheprobetohybridizewithtargetDNAsequencescomplementarytoit.Thelocationofthesetargetsequencesisthenrevealedbyanappropriatemeansofdetection,suchasautoradiography(7).第34頁/共75頁生物素標(biāo)記探針檢測核酸過程示意圖第35頁/共75頁Southern印跡雜交過程第36頁/共75頁DNAmicroarray.AmicroarraycanbepreparedfromanyknownDNAsequence,fromanysource,generatedbychemicalsynthesisorbyPCR.TheDNAispositionedonasolidsurface(usuallyspeciallytreatedglassslides)withtheaidofaroboticdevicecapableofdepositingverysmall(nanoliter)dropsinprecisepatterns.UVlightcross-linkstheDNAtotheglassslides.OncetheDNAisattachedtothesurface,themicroarraycanbeprobedwithotherfluorescentlylabelednucleicacids.Here,mRNAsamplesarecollectedfromcellsattwodifferentstagesinthedevelopmentofafrog.ThecDNAprobesaremadewithnucleotidesthatfluoresceindifferentcolorsforeachsample;amixtureofthecDNAsisusedtoprobethemicroarray.GreenspotsrepresentmRNAsmoreabundantatthesingle-cellstage;redspots,sequencesmoreabundantlaterindevelopment.Theyellowspotsindicateapproximatelyequalabundanceatbothstages.第37頁/共75頁EnlargedimageofaDNAmicroarray.EachglowingspotinthismicroarraycontainsDNAfromoneofthe6,200genesoftheyeast(S.cerevisiae)genome,witheverygenerepresentedinthearray.ThemicroarrayhasbeenprobedwithfluorescentlylabelednucleicacidderivedfromthemRNAsobtained(1)whenthecellsweregrowingnormallyincultureand(2)fivehoursafterthecellsbegantoformspores.Thegreenspotsrepresentgenesexpressedathigherlevelsduringnormalgrowth;theredspots,genesexpressedathigherlevelsduringsporulation.Theyellowspotsrepresentgenesthatdonotchangetheirlevelsofexpressionduringsporulation.Thisimageisenlarged;themicroarrayactuallymeasuresonly1.8×1.8cm.第38頁/共75頁原位合成法制作DNA芯片的過程第39頁/共75頁基本要求1.熟悉核酸的水解方法及水解產(chǎn)物。2.掌握核酸的酸堿性質(zhì)。（重點）3.掌握核酸的紫外吸收。（重點）4.掌握核酸變性、復(fù)性及雜交的有關(guān)知識及應(yīng)用。（重點、難點）第40頁/共75頁

第15章核酸的研究方法

第41頁/共75頁一、核酸的分離、提純和定量測定

(一)DNA的分離

用1mol/L的NaCl制備組織勻漿,離心除去組織殘渣,多次用苯酚處理使蛋白質(zhì)變性,每次處理后離心取上層水相,最后加2倍體積的乙醇沉淀出DNA。(二)RNA的分離

由于RNA酶存在廣泛,且十分穩(wěn)定,破碎細胞時要加入胍鹽破壞RNA酶,試劑要用0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）配制,器皿要高壓滅菌或用0.1%的DEPC處理,多次用苯酚或氯仿處理使蛋白質(zhì)變性,每次處理后離心取上層水相,mRNA可用寡聚dT-纖維素親和層析從總RNA中分離。第42頁/共75頁(三)核酸含量的測定法

常用的方法是測定260nm的消光度,用公式計算核酸的含量。核酸的含量也可以用定磷法測定。

DNA的含量可以用二苯胺顯色法測定。

RNA的含量可以用地衣酚顯色法測定。第43頁/共75頁（四）核酸的超速離心(圖15-2)

超速離心可以分離超螺旋DNA（密度大）,線性DNA（密度?。┖烷]環(huán)DNA（密度居中）。也可以分離RNA。Densitygradientcentrifugationisacommonmethodofseparatingmacromolecules,particularlynucleicacids,insolution.AcellextractismixedwithasolutionofCsCltoafinaldensityofabout1.7g/cm3andcentrifugedathighspeed(40,000rpm,givingrelativecentrifugalforcesofabout200,000g).ThebiologicalmacromoleculesintheextractwillmovetoequilibriumpositionsintheCsClgradientthatreflecttheirbuoyantdensities.第44頁/共75頁Therelationshipofthedensities(ing/mL)ofDNAsfromvarioussourcesandtheirG:Ccontent.第45頁/共75頁（五）核酸的凝膠電泳(圖15-3)松弛型，OC,OpencircularDNA超螺旋,CCC,covalently-closedcircularDNA從細菌抽提得到的質(zhì)粒DNA樣品中不含線狀DNA第46頁/共75頁二、核酸的核苷酸序列測定和化學(xué)合成(一)DNA的酶法（末端終止法）測序

DNA的序列測定目前多采用Sanger提出的酶法（末端終止法），和Gilbert提出的化學(xué)法。其中酶法經(jīng)不斷改進，使用日益廣泛。酶法的技術(shù)基礎(chǔ)主要有：（1）用凝膠電泳分離DNA單鏈片斷時，小片斷移動快，大片斷移動慢，用適當(dāng)?shù)姆椒煞蛛x分子大小僅差一個核苷酸的DNA片斷。（2）用合適的聚合酶可以在試管內(nèi)合成單鏈DNA模板的互補鏈。反應(yīng)體系中除單鏈模板外，還應(yīng)包括合適的引物，4種脫氧核苷三磷酸和若干種適量的無機離子。第47頁/共75頁

如果在4個試管中分別進行合成反應(yīng)，每個試管的反應(yīng)體系能在一種核苷酸處隨機中斷鏈的合成，就可以得到4套分子大小不等的片段，如新合成的片斷列為-CCATCGTTGA-，在A處隨機中斷鏈的合成，可得到-CCA和-CCATCGTA兩種片斷，在G處中斷合成可得到-CCATCG和-CCATCGTTG兩種片斷。在C和T處中斷又可以得到相應(yīng)的2套片斷。用同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記這4套新合成的鏈，在凝膠中置于4個泳道中電泳，檢測這4套片斷的位置，即可直接讀出核苷酸的序列。第48頁/共75頁在特定堿基處中斷新鏈合成最有效的辦法，是在上述4個試管中按一定比例各加一種相應(yīng)的3′位無-OH的雙脫氧核苷酸，由于不可能形成磷成磷酸二酯鍵，故合成自然中斷。上述在A入中斷的試管內(nèi)，既有dATP，又有ddATP，新合成的-CCA鏈中的A如果是ddAMP,則鏈的合成中斷，如果是dAMP，則鏈仍可延伸。因此，鏈中有幾個A，就能得到幾種大小不等的片斷。如果用放射性同位素標(biāo)記新合成的鏈，則4個試管中新合成的鏈在凝膠的4個泳道電泳后，經(jīng)放射自顯影要檢測帶子的位置，由帶子的位置可以直接讀出核苷酸的序列。采用測序酶時，一次可讀出400多個核苷酸的序列。蛋白質(zhì)序列測定：1958化學(xué)獎DNA序列測定：1980化學(xué)獎第49頁/共75頁DNApolymerasecopiesssDNAinvitrointhepresenceofthefourdeoxynucleotidemonomers,providedadoublestrandedregionofDNAisartificiallygeneratedbyaddingaprimer,anoligonucleotidecapableofformingashortstretchofdsDNAbybasepairingwiththessDNA.Theprimermusthaveafree3-OHendfromwhichthenewpolynucleotidechaincangrowasthefirstresidueisaddedintheinitialstepofthepolymerizationprocess.第50頁/共75頁ThechainterminationordideoxymethodofDNAsequencing.(a)DNApolymerasereaction.(b)Structureofdideoxynucleotide.(c)Fourreactionmixtureswithnucleosidetriphosphatesplusonedideoxynucleosidetriphosphate.(d)Electrophoretogram.NotethatthenucleotidesequenceasreadfromthebottomtothetopofthegelistheorderofnucleotideadditioncarriedoutbyDNApolymerase.第51頁/共75頁DNAsequencingbytheSangermethod.ThismethodmakesuseofthemechanismofDNAsynthesisbyDNApolymerases.DNApolymerasesrequirebothaprimer(ashortoligonucleotidestrand),towhichnucleotidesareadded,andatemplatestrandtoguideselectionofeachnewnucleotide.Incells,the3-hydroxylgroupoftheprimerreactswithanincomingdeoxynucleosidetriphosphate(dNTP)toformanewphosphodiesterbond.TheSangersequencingprocedureusesdideoxynucleosidetriphosphate(ddNTP)analogstointerruptDNAsynthesis.(TheSangermethodisalsoknownasthedideoxymethod.)WhenaddNTPisinsertedinplaceofadNTP,strandelongationishaltedaftertheanalogisadded,becauseitlacksthe3-hydroxylgroupneededforthenextstep.TheDNAtobesequencedisusedasthetemplatestrand,andashortprimer,radioactivelyorfluorescentlylabeled,isannealedtoit.ByadditionofsmallamountsofasingleddNTP,forexampleddCTP,toanotherwisereactionsystem,thesynthesizedstrandswillbeprematurelyterminatedatsomelocationswheredCnormallyoccurs.第52頁/共75頁GiventheexcessofdCTPoverddCTP,thechancethattheanalogwillbeincorporatedwheneveradCistobeaddedissmall.However,ddCTPispresentinsufficientamountstoensurethateachnewstrandhasahighprobabilityofacquiringatleastoneddCatsomepointduringsynthesis.Theresultisasolutioncontainingamixtureoflabeledfragments,eachendingwithaCresidue.EachCresidueinthesequencegeneratesasetoffragmentsofaparticularlength,suchthatthedifferent-sizedfragments,separatedbyelectrophoresis,revealthelocationofCresidues.ThisprocedureisrepeatedseparatelyforeachofthefourddNTPs,andthesequencecanbereaddirectlyfromanautoradiogramofthegel.BecauseshorterDNAfragmentsmigratefaster,thefragmentsnearthebottomofthegelrepresentthenucleotidepositionsclosesttotheprimer(the5'end),andthesequenceisread(inthe5→3direction)frombottomtotop.Notethatthesequenceobtainedisthatofthestrandcomplementarytothestrandbeinganalyzed.第53頁/共75頁Aphotographoftheautoradiogramfromanactualsequencinggel.AportionoftheDNAsequenceofnit-6,theNeurosporageneencodingtheenzymenitritereductase.第54頁/共75頁(二)DNA的化學(xué)法測序第55頁/共75頁第56頁/共75頁第57頁/共75頁DNA酶法測序自動化使用4種熒光素標(biāo)記的雙脫氧核苷酸，毛細管電泳和激光掃描技術(shù)使測序自動化，一個泳道一次可測大約700個核苷酸，測序已成為可以快速完成的常規(guī)技術(shù)。人類基因組測序已經(jīng)完成，多態(tài)性的研究和功能基因組學(xué)已經(jīng)成為研究的熱點。第58頁/共75頁StrategyforautomatingDNAsequencingreactions.EachdideoxynucleotideusedintheSangermethodcanbelinkedtoafluorescentmoleculethatgivesallthefragmentsterminatinginthatnucleotideaparticularcolor.AllfourlabeledddNTPsareaddedtoasingletube.TheresultingcoloredDNAfragmentsarethenseparatedbysizeinasingleelectrophoreticgelcontainedinacapillarytube(arefinementofgelelectrophoresisthatallowsforfasterseparations).Allfragmentsofagivenlengthmigratethroughthecapillarygelinasinglepeak,andthecolorassociatedwitheachpeakisdetectedusingalaserbeam.TheDNAsequenceisreadbydeterminingthesequenceofcolorsinthepeaksastheypassthedetector.Thisinformationisfeddirectlytoacomputer,whichdeterminesthesequence.第59頁/共75頁SchematicdiagramofthemethodologyusedinfluorescentlabelingandautomatedsequencingofDNA.Fourreactionsaresetup,oneforeachbase,andtheprimerineachisend-labeledwithoneoffourdifferentfluorescentdyes;thedyesservetocolor-codethebase-specificsequencingprotocol(auniquedyeisusedineachdideoxynucleotidereaction).Thefourreactionmixturesarethencombinedandruninonelane.Thus,eachlaneinthegelrepresentsadifferentsequencingexperiment.Asthedifferentlysizedfragmentspassdownthegel,alaserbeamexcitesthedyeinthescanarea.Theemittedenergypassesthrougharotatingcolorfilterandisdetectedbyafluorometer.Thecoloroftheemittedlightidentifiesthefinalbaseinthefragment.第60頁/共75頁由于測序儀在一個泳道只能準(zhǔn)確測出幾百個核苷酸，對于長DNA,只能將其切成小段再測序，為了組裝，需要確定足夠多的標(biāo)記位點。常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標(biāo)簽位點(STS)、表達序列標(biāo)簽(EST)等方法確定標(biāo)記位點。限制性酶切位點分析是繪制物理圖的常用方法第61頁/共75頁(三)RNA的測序

1.RNA的測序可以用4種特異性的酶切割（從胰臟提取的RNaseA水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的RNaseT1水解鳥苷酸的磷酸二酯鍵，黑粉曲霉中提取的RNaseU2水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的RNasePhyΙ水解A、U、G三種核苷酸的磷酸二酯鍵）,凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。

2.也可以用化學(xué)試劑斷裂RNA鏈，用類似DNA化學(xué)測序的方法推斷核苷酸序列。

3.最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DNA測序的方法推斷核苷酸序列。第62頁/共75頁（四）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）原理

polymerasechainreaction(PCR)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板DNA的含量依指數(shù)方式增加，可用來快速在體外擴增DNA,PCR技術(shù)在臨床檢驗和分子生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。第63頁/共75頁第64頁/共75頁PCR技術(shù)的擴展

典型的PCR經(jīng)過一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴展到分子生物學(xué)的各個方面，較常用的技術(shù)擴展有：1.“巢式”PCR(nestedPCR)

先用一對引物對模板進行擴增，然后再用另一對引物擴增第一對引物擴增的產(chǎn)物，這一PCR技術(shù)即巢式PCR。第一次擴增所用引物稱外引物(outer-primer)，第二次擴增作用的引物稱內(nèi)引物(inter-primer)。進行“巢式”PCR可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長一些，且用量較少，用外引物進行時，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴增。經(jīng)過若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進行內(nèi)引物的PCR擴增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進退式”PCR(drop-in-drop-outPCR)。

“巢式”及“中途進退式”PCR主要用于極少量模板的擴增。

第65頁/共75頁2.復(fù)合PCR(multiplexPCR)

在同一反應(yīng)中用多組引物同時擴增幾種基因片段的方法稱復(fù)合PCR。復(fù)合PCR主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。3.不對稱PCR(asymmetricPCR)

兩種引物比例相差較大的PCR稱不對稱PCR。不對稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交的探針等。4.反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)

由于Taq酶只能以DNA為模板，當(dāng)待擴增模板為RNA時，需先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行PCR擴增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR，在分子生物學(xué)和臨床檢驗等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。第66頁/共75頁5.實時定量PCR(real-timequangtitativePCR)每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到熒光域值所需的循環(huán)數(shù)稱循環(huán)域值（Ct)，模板的拷貝數(shù)越多，則循環(huán)域值越小。要有高質(zhì)量的mRNA及cDNA;要有合適的內(nèi)標(biāo)基因，如β-actin；絕對定量要有合適的標(biāo)準(zhǔn)品；相對定量的依據(jù)：Xt=X0×(1+Ex)Ctx，Ex為擴增效率若目標(biāo)基因河內(nèi)標(biāo)基因的Ex相同，分別解出二者的X0，可求出二者的比值。第67頁/共75頁6.涂片PCR(slide-PCR)

直接對載玻片上細胞涂片或組織切片進行PCR擴增的方法稱涂片PCR。涂片PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測。7.反向PCR(inversePCR)

擴增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進行酶切和環(huán)化，然后直接進行PCR，也可將已知序列酶切后再進行PCR。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴增。8.錨定PCR(anchoredPCR)

用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA3′端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA進行PCR擴增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。第68頁/共75頁9.修飾引物PCR

為達到某些特殊應(yīng)用目的如定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位點、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析物結(jié)合位點等，這種PCR技術(shù)稱為修飾引物PCR。此外，還可將一些信號分子如熒光素、生物素等連接于引物的5′末端，當(dāng)PCR完成后可對產(chǎn)物直接進行檢測。

PCR在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，如獲取目的基因、引入點突變、檢測病源體、DNA特定片段的多態(tài)性研究等，已有不少專著可供讀者參考。第69頁/共75頁（五）DNA的化學(xué)合成固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的3′-OH與固相載體成共價鍵，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護，下一個核苷酸的5′-OH亦被DMTr保護，3′-OH上的磷酸基上有-N(C3H7)2和-OCH3兩個基團，3′-OH因此被活化。第70頁/共75頁Solidphas