細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)操作

本文格式為Word版，下載可任意編輯——細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)操作細(xì)胞培養(yǎng)常用操作方法

1細(xì)胞復(fù)蘇

事先調(diào)理水浴箱至37°C，并將操作所需培養(yǎng)基、PBS溶液等放置于水浴箱。待以上試劑完全溶解，將其取出，置于細(xì)胞間密閉交換窗口。更換衣物鞋帽，穿工作服（已經(jīng)紫外照射消毒），佩戴無菌帽子、口罩后進(jìn)入細(xì)胞間，以75%醫(yī)用酒精噴灑超凈臺(tái)，將試驗(yàn)所需物品從密閉交換窗口取出，放入超凈工作臺(tái)，再次噴灑75%醫(yī)用酒精，并照射紫外燈消毒超凈臺(tái)和物品30min以上，細(xì)胞間也要紫外燈消毒。

從-80℃超低溫冰箱中取出細(xì)胞凍存管，快速放置于37\水浴箱中，充分搖動(dòng)，盡量使細(xì)胞在Imin內(nèi)快速解凍。

細(xì)胞凍存管經(jīng)75%醫(yī)用酒精消毒后放入超凈臺(tái)，瓶蓋充分過火焰開啟，用滴管將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液移至含5ml1640完全培養(yǎng)液的15ml離心管中，反復(fù)吹打，1000rpm常溫離心3-5min。

離心完畢后，防備棄去離心管上清液，取5ml1640完全培養(yǎng)液參與15ml離心管中輕輕打勻，以制備單細(xì)胞懸液，將懸液防備移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，參與適量1640完全培養(yǎng)液（以充分浸沒細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底為宜），十字搖勻，放置于37℃，含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2細(xì)胞傳代

依照前述方法常規(guī)消毒超凈工作臺(tái)

旋開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將瓶中培養(yǎng)液防備棄入廢液缸。向瓶中參與適量PBS沖洗，旋緊瓶蓋左右水平晃動(dòng)，要求動(dòng)作輕柔，PBS洗漆兩次后，參與3ml胰酶消化液，以剛好覆蓋瓶底為宜，消化時(shí)間為90s。期間應(yīng)隨時(shí)注意觀測(cè)顯微鏡下的細(xì)胞狀態(tài)，并輕輕水平晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待到目測(cè)約有70%細(xì)胞脫落時(shí)，參與6ml1640完全培養(yǎng)液中和胰酶，劑量剛好為胰酶的兩倍，以滴管反復(fù)吹打瓶底細(xì)胞，注意變換不同角度和位置以使吹打范圍覆蓋瓶底每個(gè)角落，直至所有細(xì)胞完全脫落。

將瓶中細(xì)胞懸液移至15ml離心管中，1200rpm離心3min，防備取出離心管，不可震蕩，棄去上清，參與適量新鮮培養(yǎng)液，滴管充分吹打，制備成單細(xì)胞懸液，將懸液分別移入兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，十字搖勻，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3細(xì)胞凍存

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，要求事先經(jīng)顯微鏡下觀測(cè)確認(rèn)無細(xì)菌或支原體污染，且細(xì)胞形態(tài)良好，胞質(zhì)透亮明了。需要注意，凍存細(xì)胞前24小時(shí)之內(nèi)需進(jìn)行細(xì)胞換液，以保證細(xì)胞處于最正確生長(zhǎng)狀態(tài)。

計(jì)數(shù)：依照細(xì)胞常規(guī)傳代方法將細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，使用計(jì)數(shù)板將細(xì)胞密度調(diào)整到5×106個(gè)/ml。一般狀況下，對(duì)于250cm2的大號(hào)培養(yǎng)瓶，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，剛好可供凍滿四個(gè)1.8ml的凍存管。

凍存液：凍存所用培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清的無藥無抗1640培養(yǎng)液，所用細(xì)胞凍存管及甘油均已事先高壓滅菌，先向每支細(xì)胞凍存管中參與200^1甘油，再分別參與1.6ml的單細(xì)胞懸液，輕柔吹打，使甘油與單細(xì)胞懸液充分混勻，力度不宜過大，否則會(huì)導(dǎo)致液體溢出管口。

保存：管口充分過火后拉緊并用封口膠封嚴(yán)，以免細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)造成污染。依次對(duì)各管分別標(biāo)記，凍存管先于4°C冰箱放置20min，后移入-20°C繼續(xù)放置2小時(shí)，最終置于-80℃超低溫冰箱中。一般狀況下可保存3個(gè)月，如需長(zhǎng)期保存

則需放入液氮耀。

4細(xì)胞計(jì)數(shù)法

按前述細(xì)胞常規(guī)傳代方法將長(zhǎng)滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)算懸液中的細(xì)胞數(shù)量時(shí)，單位尋常為細(xì)胞個(gè)數(shù)/ml，便于觀測(cè)細(xì)胞增殖和調(diào)整懸液中細(xì)胞密度。

用酒精棉球?qū)⒂?jì)數(shù)板及蓋玻片擦拭清白，將蓋玻片輕柔的蓋在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的小室上，并將它移向一側(cè)，使其稍稍露出計(jì)數(shù)板臺(tái)面，以便于滴加細(xì)胞懸液。用吸管充分打勻離心管中的細(xì)胞懸液，之后用移液器吸取8μl細(xì)胞懸液，將懸液打入蓋玻片和計(jì)數(shù)板的交界處邊緣，打入時(shí)槍頭與計(jì)數(shù)板大約呈30°傾斜角，通過毛細(xì)管虹吸作用，細(xì)胞懸液最終充滿蓋玻片及計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能有懸液流入旁邊槽中，否則都會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的確鑿度。

計(jì)數(shù)：將計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡低倍鏡下細(xì)心觀測(cè)，調(diào)整視野后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。依照象限分布，順時(shí)針觀測(cè)并記錄計(jì)數(shù)板四角方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)需遵循原則：細(xì)胞完整才可計(jì)數(shù)，若有殘缺不可計(jì)數(shù)，若細(xì)胞存在聚集成團(tuán)現(xiàn)象，則細(xì)胞數(shù)計(jì)為細(xì)胞團(tuán)數(shù)。若有個(gè)別細(xì)胞位于方格邊線，計(jì)數(shù)時(shí)需遵循原則：計(jì)上邊線細(xì)胞，不計(jì)下邊線細(xì)胞；計(jì)左邊線細(xì)胞，不計(jì)右邊線細(xì)胞。

計(jì)算：計(jì)完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0.1cm2，高為0.01cm，因此方格空間體積為0.0001cm3即0.1mm3。由于1ml=1000mm3，所以每一方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×104=細(xì)胞數(shù)/ml,故可按下式計(jì)算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)/ml=4個(gè)方格總數(shù)/4×104。如計(jì)算前已稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。

5細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞株置于37°C，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的1640雙抗培養(yǎng)液，為有效維持細(xì)胞的耐藥性，依照