生物芯片與高通量篩選技術(shù)

生物芯片與高通量篩選技術(shù)第1頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一主要內(nèi)容生物芯片

基因芯片（DNA芯片）

蛋白質(zhì)芯片（ProteinChips）

細(xì)胞芯片 組織芯片高通量篩選第2頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一生物芯片生物芯片(biochip)是指采用微量點(diǎn)樣等方式,將核酸片段、多肽分子、組織切片和細(xì)胞等生物樣品有序地固定于支持物(如玻片、硅片、尼龍膜等載體)的表面,組成密集二維陣列,然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子進(jìn)行雜交、或用免疫組織化學(xué)、原位雜交等技術(shù)使待檢分子可視化,最后通過(guò)特定的儀器如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)(CCD)對(duì)可視化信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析,從而判斷樣品中靶分子的相對(duì)數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物,且在制備過(guò)程模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù),所以稱之為生物芯片技術(shù)。第3頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一生物芯片根據(jù)芯片上固定的生物物質(zhì)的不同,生物芯片分為基因芯片(Genechip)、蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)、細(xì)胞芯片(cellchip)、組織芯片(tissuechip);如芯片上固定的是寡核苷酸或DNA,就稱為基因芯片或DNA微陣列(DMAMicroarray);又如芯片上固定的是組織,就稱為組織芯片。第4頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因芯片（GeneChips）定義：就是按特定的排列方式固定有大量基因探針/基因片段的硅片、玻片、塑料?；蛐酒夹g(shù)是高效地大規(guī)劃獲取相關(guān)生物信息的重要手段。應(yīng)用領(lǐng)域:

主要有基因表達(dá)譜分析、新基因發(fā)現(xiàn)、基因突變及多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖、疾病診斷和預(yù)測(cè)、藥物篩選、基因測(cè)序。第5頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因芯片作用原理采用高速打印或光刻合成技術(shù)可在硅片、玻璃或尼龍膜上制造DNA微陣列即基因芯片；樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子,與微陣列雜交后通過(guò)熒光掃描儀器掃描及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息。第6頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一FlowchartofcDNAmicroarray第7頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因制備方法分為兩大類:一類是原位合成;一類是直接點(diǎn)樣；原位合成適用于寡核苷酸;直接點(diǎn)樣多用于大片段DNA,有時(shí)也用于寡核苷酸,甚至mRNA。原位合成有兩種途徑。一是光刻法;一是壓電打印法。光刻法可以合成30nt左右,打印法可以合成40250nt,光刻法每步縮合率較低,一般說(shuō)噴印法特異性應(yīng)比光刻法高。此外,噴印法不需特殊的合成試劑。與原位合成法比較點(diǎn)樣法較簡(jiǎn)單,只需將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA等樣品通過(guò)自動(dòng)點(diǎn)樣裝置點(diǎn)于經(jīng)特殊處理的玻離片或其它材料上即可。第8頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一芯片的種類電子芯片：帶有陽(yáng)電荷的硅芯片、芯片經(jīng)熱氧化,制成1mm×1mm的陣列、每個(gè)陣列含多個(gè)微電極,在每個(gè)電極上通過(guò)氧化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將連接鏈親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上,在電場(chǎng)作用下生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上。三維芯片：三維生物芯片實(shí)質(zhì)上是一塊顯微鏡載玻片,其上有10,000個(gè)聚乙烯酰胺凝膠條,每個(gè)凝膠條可用于靶DNA,RNA和蛋白質(zhì)的分析。先把已知化合物加在凝膠條上,再用3cm長(zhǎng)的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。每個(gè)毛細(xì)管能把小到012nl的體積打到凝膠上。第9頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因芯片應(yīng)用基因表達(dá)譜分析新基因發(fā)現(xiàn)基因突變及多態(tài)性分析基因組文庫(kù)作圖疾病診斷和預(yù)測(cè)藥物篩選基因測(cè)序第10頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因表達(dá)譜分析基因芯片技術(shù)可清楚地直接快速地檢測(cè)出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA,且易于同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)的基因。Lockhart等人對(duì)芯片技術(shù)定量檢測(cè)基因表達(dá)及其敏感性、特異性進(jìn)行了研究。在陣列的雜交實(shí)驗(yàn)中,從克隆cDNA文庫(kù)或直接從細(xì)胞mRNA制備標(biāo)記RNA靶,用于雜交的RNA靶通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)摻入熒光素標(biāo)記的核糖核苷酸制備,然后隨機(jī)地將該RNA靶裂解為平均50—100個(gè)堿基大小的片段,樣品與陣列雜交30分鐘到22小時(shí),陣列的熒光影像用特制的掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。第11頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一新基因發(fā)現(xiàn)定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療靶等方面是很有價(jià)值的。如該技術(shù)在炎癥性疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎癥性腸病(IBD)的基因表達(dá)研究中,由RAIBD組織制備探針,用Cy3和Cy5熒光素標(biāo)記,然后與靶cDNA微陣列雜交,可檢測(cè)出炎癥疾病誘導(dǎo)的基因如TNF－或粒細(xì)胞集落刺激因子,同時(shí)發(fā)現(xiàn)一些以前未發(fā)現(xiàn)的基因如HME基因和黑色素瘤生長(zhǎng)刺激因子。第12頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一DNA序列分析人類基因組計(jì)劃的實(shí)施促進(jìn)了更高效率的、能夠自動(dòng)化操作的測(cè)序方法的發(fā)展。芯片技術(shù)中雜交測(cè)序(SBH)技術(shù)及鄰堆雜交(CSH)技術(shù)一種新的高效快速測(cè)序方法。用含65，536個(gè)8聚寡核苷酸的微陣列,采用SBH技術(shù),可測(cè)定200bp長(zhǎng)DNA序列,采用67,108,864個(gè)13個(gè)聚寡核苷酸的微陣列,可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA測(cè)序。SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高,但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性,降低了雜交準(zhǔn)確性。CSH技術(shù)彌補(bǔ)了SBH技術(shù)存在的弊端,CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長(zhǎng)度,加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性,可進(jìn)行較長(zhǎng)的DNA測(cè)序。第13頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一突變體和多態(tài)性的檢測(cè)SHB技術(shù)可大規(guī)模地檢測(cè)和分析DNA的變異及多態(tài)性。Guo等人利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)微陣列建立了簡(jiǎn)單快速的基因多態(tài)性分析方法。將ASOs共價(jià)固定于玻璃載片上,采用PCR擴(kuò)增基因組DNA,其一條引物用熒光素標(biāo)記,另一條引物用生物素標(biāo)記,分離兩條互補(bǔ)的DNA鏈,將熒光素標(biāo)記DNA鏈與微陣列雜交,通過(guò)熒光掃描檢測(cè)雜交模式,即可測(cè)定PCR產(chǎn)物存在的多種多態(tài)性,該方法對(duì)人的酪氨酸酶基因第4個(gè)外顯子內(nèi)含有的5個(gè)單堿基突變進(jìn)行分析,結(jié)果顯示單堿基錯(cuò)配與完全匹配的雜交模式非常易于區(qū)別。這種方法可快速、定量地獲得基因信息。第14頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一疾病診斷和預(yù)測(cè)CancerArray

腫瘤基因芯片

生長(zhǎng)因子基因芯片

腫瘤轉(zhuǎn)移基因芯片染色體穩(wěn)定和DNA修復(fù)基因芯片雄性激素信號(hào)通路與前列腺癌基因芯片腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因芯片

腫瘤藥物耐受和代謝基因芯片血管生成基因芯片乳腺癌和雌激素受體信號(hào)通路基因芯片癌通路發(fā)現(xiàn)者基因芯片第15頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因芯片－狀況自從1996年美國(guó)Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)用的生物芯片。美國(guó)的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte公司及日本、歐洲各國(guó)都積極開(kāi)展DNA芯片研究工作；摩托羅拉、惠普、IBM等跨國(guó)公司也相繼投以巨資開(kāi)展芯片研究。預(yù)計(jì)在今后五年內(nèi)生物芯片銷售可達(dá)200-300億美元；據(jù)《財(cái)富》雜志預(yù)測(cè)(97.3)，在21世紀(jì)，生物芯片對(duì)人類的影響將可能超過(guò)微電子芯片。第16頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基因芯片－狀況我國(guó)在生物芯片研究方面剛剛起步，98年10月，中科院將基因芯片列為“”九五”特別支持項(xiàng)目，利用中科院在微電子技術(shù)、生化技術(shù)、物理檢測(cè)技術(shù)方面的優(yōu)勢(shì)，組織跨所、跨學(xué)科合作?，F(xiàn)在在微陣列芯片和基于MEBS的芯片方面有大的突破，在DNA芯片設(shè)計(jì)、基片修飾、探針固定、樣品標(biāo)記、雜交和檢測(cè)等方面的技術(shù)都有較大的進(jìn)展，已研制出肝癌基因差異表達(dá)芯片、乙肝病毒多態(tài)性檢測(cè)芯片、多種惡性腫瘤病毒基因芯片等有一定實(shí)用意義的基因芯片和DNA芯片檢測(cè)儀樣機(jī)。第17頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是指把制備好的蛋白質(zhì)樣品固定于經(jīng)化學(xué)修飾的玻片、硅片等載體上,蛋白質(zhì)與載體表面結(jié)合,同時(shí)仍保留蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)和生物活性。蛋白質(zhì)芯片是高通量、微型化和自動(dòng)化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片主要分兩種: 1）一種類似于ＤＮＡ芯片,即在固相支持物表面高密度排列的探針蛋白點(diǎn)陣,可特異地捕獲樣品中的靶蛋白,然后通過(guò)檢測(cè)器對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性或定量分析。

2）另一種就是微型化的凝膠電泳板。在電場(chǎng)作用下,樣品中的蛋白質(zhì)通過(guò)芯片上的孔道分離開(kāi)來(lái),經(jīng)噴霧直接進(jìn)入質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測(cè),以確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量及種類。第18頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一抗體蛋白質(zhì)芯片原理第19頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一原理蛋白質(zhì)芯片是將已知蛋白點(diǎn)印在固定于不同種類支持介質(zhì)上,制成由高密度的蛋白質(zhì)或多肽分子的微陣列組成蛋白微陣列,其中每個(gè)分子的位置及序列為已知,并將待測(cè)蛋白質(zhì)與該芯片進(jìn)行孵育反應(yīng),再將熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)與芯片蛋白質(zhì)復(fù)合物反應(yīng),當(dāng)熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的分子結(jié)合后,可通過(guò)激光掃描系統(tǒng)或電荷偶聯(lián)照像系統(tǒng)(ＣＣＤ）,對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行量化分析,檢測(cè)蛋白質(zhì)的存在情況。第20頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第21頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用第22頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用疾病診斷和療效判定研究蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)現(xiàn)藥物或毒物作用靶位和作用機(jī)制第23頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一發(fā)展日開(kāi)發(fā)出廉價(jià)蛋白質(zhì)芯片：開(kāi)發(fā)成功可迅速檢測(cè)癌癥等疾病的廉價(jià)蛋白質(zhì)芯片。把目前數(shù)十萬(wàn)日元一個(gè)的蛋白質(zhì)芯片價(jià)格降到了僅為幾千日元。預(yù)計(jì)這種芯片在4年內(nèi)可以使用。光學(xué)蛋白質(zhì)芯片是一種基于橢圓偏振光原理，利用抗原和抗體以及受體與配體特異性的結(jié)合，將分子間的相互作用轉(zhuǎn)換為可直接讀取的灰度值，對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。它由于無(wú)須對(duì)探針?lè)肿舆M(jìn)行標(biāo)記，因此有利于對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行活性分析。應(yīng)用后冠心病檢測(cè)加速。第24頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一發(fā)展中國(guó)科學(xué)家研制的丙型肝炎蛋白質(zhì)芯片獲國(guó)家藥監(jiān)局頒發(fā)的生物制品一類新藥證書。這不僅是我國(guó)的第一個(gè)獲新藥證書的硅基材料蛋白質(zhì)芯片，也是迄今為止世界上惟一得到政府藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)頒發(fā)新藥證書的蛋白質(zhì)芯片。兩英寸大小的蛋白質(zhì)芯片已由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司投產(chǎn)。只需要２微升（一滴血的十分之一）血清或血漿，１小時(shí)后就能檢測(cè)出結(jié)果。而每次的檢測(cè)費(fèi)用只有１００元左右。第25頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞芯片新型的細(xì)胞芯片,其原理是應(yīng)用細(xì)胞膜表面不同的抗原物質(zhì),與結(jié)合在玻片上的不同抗體發(fā)生特異性結(jié)合,通過(guò)自動(dòng)捕獲能力將所獲細(xì)胞固定在特定區(qū)域,以此對(duì)淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行診斷和分類。細(xì)胞芯片的制作:每種抗體與pH10－12的Tris2HCl緩沖液等體積稀釋,通過(guò)生物芯片點(diǎn)樣儀自動(dòng)點(diǎn)樣,將8種抗體分別點(diǎn)在醛基玻片上的各自區(qū)域,每一抗體點(diǎn)4個(gè)點(diǎn),直徑約2mm左右,形成4×8微陣列。點(diǎn)樣后迅速將玻片置于濕盒中,4℃冰箱水化,過(guò)夜。第26頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞芯片應(yīng)用疾病診斷胸腔液中淋巴瘤細(xì)胞檢測(cè)第27頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一發(fā)展最近出現(xiàn)了一種細(xì)胞微陣列芯片，他是將不同的質(zhì)粒DNA點(diǎn)在玻璃片上做成質(zhì)粒DNA芯片，接著在脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理好的芯片上培養(yǎng)細(xì)胞，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞因此獲得了外源DNA賦予的新性狀，因此也稱為反向轉(zhuǎn)染(reversetransfection).這種技術(shù)不但可以用于cDNA、融合肽或RNA分子的分析，而且還可以用于研究一些細(xì)胞因子、化學(xué)抑制劑或放射性標(biāo)記對(duì)基因表達(dá)的影響.第28頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一組織芯片Kononen等(1998)年在《自然》雜志上首次報(bào)道了組織芯片這一高通量的技術(shù)。組織芯片技術(shù)可以將數(shù)十個(gè)甚至上千個(gè)不同個(gè)體的臨床組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在一張玻片進(jìn)行分析研究，是一種高通量、多樣本的分析工具。它使科研人員第一次有可能同時(shí)對(duì)幾百甚至上千種正?；蚣膊∫约凹膊“l(fā)展不同階段的自然病理生理狀態(tài)下的組織樣本，進(jìn)行某一個(gè)或多個(gè)特定的基因，或與其相關(guān)的表達(dá)產(chǎn)物的研究。第29頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一應(yīng)用如Kononen等使用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化方法利用組織芯片技術(shù)研究了645例各種乳腺癌組織標(biāo)本，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)病理切片相應(yīng)研究結(jié)果完全一致；同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)有關(guān)p53等6種基因的檢測(cè)結(jié)果表明，新鮮與石蠟包埋的組織標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有差異。Hedenfalk等結(jié)合組織芯片技術(shù)和基因芯片技術(shù)檢測(cè)了原發(fā)性乳腺癌及組織標(biāo)本。Hoos等用組織芯片技術(shù)對(duì)59例成纖維細(xì)胞瘤進(jìn)行免疫表型分析。Mucci等用組織芯片證實(shí)了神經(jīng)內(nèi)分泌因素與前列腺癌進(jìn)展的關(guān)系。第30頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一高通量篩選（HighThroughputScreen，HTS）第31頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一新藥發(fā)現(xiàn)第32頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞分析平臺(tái)HTS第33頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一HTS90年代初期,一個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用傳統(tǒng)的方法,借助20余種藥物作用靶位,一年內(nèi)僅能篩選75000個(gè)樣品;到了1997年HTS發(fā)展的初期,采用100余種靶位,每年可篩選1000000個(gè)樣品;而到1999年,由于HTS的進(jìn)一步完善,每天的篩選量就高達(dá)100000種化合物[2],因而,稱之為超高通量篩選(ultrahigh-throughputscreening)。這種新的飛躍,將大大加速新藥發(fā)現(xiàn)的速度。第34頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期一HTS高通量藥物篩選技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一種用于尋找新藥的高新技術(shù),由于該技術(shù)的快速、高效等特點(diǎn),受到國(guó)際藥物研究機(jī)構(gòu)的極大重視。高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系,它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ),以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體,以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)