生物反應工程試驗

本文格式為Word版，下載可任意編輯——生物反應工程試驗生物反應工程試驗

（試用教材）

江西師范大學生命科學學院

二〇〇八年七月

江西師范大學生命科學學院生物反應工程試驗試用教材

序言

本書是根據(jù)生物工程專業(yè)教學培養(yǎng)計劃的要求進行編寫。目的是使生物工程專業(yè)的學生，在學完本專業(yè)基礎課生物化學、微生物學、化工原理的基礎上，針對本專業(yè)的工科培養(yǎng)目標，學習生物反應工程的基礎知識、基本概念、基本理論及基本方法，接受微生物或酶進行培養(yǎng)和反應的綜合操作訓練，為今后從事工業(yè)生產(chǎn)和科學研究打下堅實的基礎。

江西師大生命科學學院生物反應工程教學組

2023年7月

—I—

江西師范大學生命科學學院生物反應工程試驗試用教材

生物反應工程試驗須知

一、

每次試驗前必需預習試驗內(nèi)容，了解試驗的基本原理、操作步驟，阻止不預習就做試驗。

二、三、

進入試驗室，需著工作服，防止藥品傷及衣物與身體。

每次試驗必需認真操作，并做好試驗記錄，每次試驗完成后，根據(jù)記錄寫出試驗報告。

四、

試驗室應經(jīng)常保持整齊、桌面上不要亂放與本次試驗無關的書籍、儀器、藥品。火柴頭、廢紙、廢液等應放入廢液桶中。倒入水槽中的廢液（無污染的）馬上放水沖掉。

五、六、

愛護儀器、儉約藥品。儀器損壞后應馬上報損，并按規(guī)定賠償。

試驗、藥品、公用器具使用后應馬上放回原處，注意不要調錯試劑瓶塞或滴管,以免污染藥品。

七、八、九、

試驗室必需恬靜，不得做與本次試驗無關的事情：阻止吸煙及吃食物。根據(jù)試驗記錄，及時完成試驗報告，不按時交報告者，不予記錄試驗成績。試驗完畢，值日生應將試驗室清潔清白，關好水、電、門、窗，離開試驗室時，檢查一遍，以免發(fā)生事故，確保安全。

—II—

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目錄

序言………………I生物反應工程試驗須知…………………II試驗一微生物生長及其動力學參數(shù)測定……………1試驗二試驗三試驗四試驗五試驗六試驗七試驗八試驗九試驗十試驗十一附錄底物濃度對酶促反應速度的影響……………2亞硫酸鹽氧化法測定傳質系數(shù)KLa…………5機械攪拌罐混合特性參數(shù)的測定（1）………7機械攪拌罐混合特性參數(shù)的測定（2）………9機械攪拌罐混合特性參數(shù)的測定（3）………10溶液粘度的測定………………115L發(fā)酵罐發(fā)酵L-乳酸…………15糖化酶的發(fā)酵（一）……………18糖化酶的發(fā)酵（二）……………19糖化酶的發(fā)酵（三）……………21…………………22

—III—

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—IV—

江西師范大學生命科學學院生物反應工程試驗試用教材

試驗一微生物生長及其動力學參數(shù)測定

（1）了解細菌生長曲線特點及測定原理（2）學習用比濁法測定細菌的生長曲線（3）把握微生物生長動力學參數(shù)的測定

將少量細菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適合的條件下進行培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量的對數(shù)作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個時期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解各菌的生長規(guī)律，對于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導意義。

測定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和試驗室條件選用。本試驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的OD值與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，此法快捷、簡便。比濁法是在濁度計或比色計上進行測定培養(yǎng)液中微生物的數(shù)量。某一波長的光線，通過混濁的液體后，其光強度將被減弱。入射光與透過光的強度比與樣品液的濁度和液體的厚度相關。A(OD?)??lg(It/I0)?KLC其中，A(OD?)：吸光度；It：透過光的強度；I0：入射光的強度；K：吸光系數(shù)；L：液層厚度，光徑；C：樣品液的濁度；It／I0稱為透光度（transmittance）。假使樣品液層厚度一定，則OD值與樣品的濁度相關，根據(jù)此原理，可通過測定樣品中的OD值來代表培養(yǎng)液中的濁度即微生物量。本法主要適用于菌體分散良好的非絲狀單細胞微生物的測定，具有簡便、省時、省力等優(yōu)點。微生物的生長性能可用比生長速率?表示。??則dXXdt?i?(Xi?1?XiXi?Xi?1?)/2Xiti?1?titi?ti?1或者X?f(t)—1—

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則有?(t)?dXdX?()/X?f'(t)/f(t)Xdtdt

（一）儀器

7200型可見分光光度計，比色杯，恒溫搖床，無菌吸管，試管，三角瓶。（二）菌種及培養(yǎng)基1）菌種大腸桿菌2）培養(yǎng)基

肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

（1）種子液制備

取大腸桿菌斜面菌種1支，以無菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，靜止

培養(yǎng)18h作種子培養(yǎng)液。（2）標記編號

取盛有50mL無菌肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的250mL三角瓶11個，分別編號為0、1、2、3、

4、5、6、8、10、12、14h。（3）接種培養(yǎng)

用5mL無菌吸管分別確鑿吸取5mL種子液參與已編號的11個三角瓶中，于37℃下振

蕩培養(yǎng)。然后分別按對應時間將三角瓶取出，測定其OD600值。（4）生長量測定方法

a）事先把比色計的波長調整到600nm，開機預熱10～15min。

b）將未接種的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調

節(jié)零點，作為空白對照。

c）并對不同時間培養(yǎng)液從0h起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的牛肉膏

蛋白胨液體培養(yǎng)基適當稀釋后測定，使其OD600值在0.10.～0.60之間，經(jīng)稀釋后測得的OD600值要乘以稀釋倍數(shù)，才是培養(yǎng)液實際的OD600值。

d）測定后把比色杯中的菌液傾入容器中，用水沖洗清白比色杯，倒置于吸水紙上晾干。

（1）將測定的OD值填入下表：培養(yǎng)時間OD6000h1h2h3h4h5h6h8h10h12h14h（2）以上述表格中的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。

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（3）繪制出大腸桿菌的?曲線和計算指數(shù)期的td值。

（1）用本試驗方法測定微生物生長曲線，有何優(yōu)點？（2）計算?時應注意什么問題？

試驗二底物濃度對酶促反應速度的影響——米氏常數(shù)的測定

（1）了解底物濃度對酶促反應的影響（2）把握測定米氏常數(shù)Km的原理和方法

酶促反應速度與底物濃度的關系可用米氏方程來表示：

v?Vm??S?Km??S?

式中，v──反應初速度（微摩爾濃度變化/min）；

Vm──最大反應速度（微摩爾濃度變化/min）；[S]──底物濃度（mol/L）；Km──米氏常數(shù)（mol/L）。

這個方程說明當已知Km及Vm時，酶反應速度與底物濃度之間的定量關系。Km值等于酶促反應速度達到最大反應速度一半時所對應的底物濃度，是酶的特征常數(shù)之一。不同的酶Km值不同，同一種酶與不同底物反應Km值也不同，Km值可近似的反應酶與底物的親和力大?。篕m值大，說明親和力?。籏m值小，說明親合力大。測Km值是酶學研究的一個重要方法。大多數(shù)純酶的Km值在0.01～100mmol/L。

Linewaeaver―Burk作圖法（雙倒數(shù)作圖法）是用試驗方法測Km值的最常用的簡便方法：

1Km11???vVm[S]Vm于是試驗時可選擇不同的[S]，測對應的v；以1/v對1/[S]作圖，得到一個斜率為Km/Vm的直線，其截距為－1/Km，由此可以求得Km和Vm。

本試驗以胰蛋白酶消化酪蛋白為例。以蛋白酶催化蛋白質中堿性氨基酸（L-精氨酸和L-賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判斷自由氨基增加的數(shù)量而跟蹤反應，求得初速度。

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一、試劑

(1)10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）：

分別?。?0）20、30、40g酪蛋白溶于約900ml水中，加20ml1mol/L的NaOH連續(xù)振蕩，微熱直至溶解，以1NHCl或1NNaOH調pH至8.5，定容至1L，即生成四種不同[S]的酪蛋白標準溶液。(2)中性甲醛溶液：

50ml分析純甲醛加10ml0.25%酚酞乙醇溶液，以0.1mol/L的NaOH滴至微紅，密閉于玻璃瓶中。

(3)0.25%酚酞加50%乙醇溶液：

2.5g酚酞以50%乙醇溶解，定容至1L。(4)標準0.1mol/LNaOH溶液。(5)胰蛋白酶溶液：

稱取2g胰蛋白酶溶于50ml蒸餾水中，放入冰箱保存。

二、器材

50ml三角燒瓶（×12），150ml三角燒瓶（×4）；吸管5ml（×1），10ml（×5）；量筒100ml（×4）；25ml堿式滴定管及滴定臺，蝴蝶夾；恒溫水浴；滴管。

（1）取50ml三角瓶3個，參與5ml甲醛與1滴酚酞，以0.1mol/L標準NaOH滴定至微紅

色，3個瓶顏色應當一致，編號。

（2）量取40g/L酪蛋白50ml，參與一150ml三角瓶，37℃保溫10分鐘，同時胰蛋白酶液

也在37℃保溫10分鐘，然后吸取5ml酶液加到酪蛋白液中。（同時計時?。┏浞只旌虾篑R上取出10ml反應液（定為0時樣品）參與一含甲醛的小三角瓶中（1號）加10滴酚酞；以0.1mol/LNaOH滴定至微弱而持續(xù)的微紅色。在接近終點時，按耗去的NaOH毫升數(shù)，每ml加一滴酚酞，再繼續(xù)滴至終點，記錄下來耗去的0.1mol/L標準NaOH毫升數(shù)。

（3）在4分鐘、8分鐘時，分別取出10ml反應液，參與2號、3號小三角瓶，同上操作，

記錄下來耗去NaOH毫升數(shù)。

（4）以滴定度（即耗去的NaOH毫升數(shù)）對時間作圖，得一直線，其斜率即初速度為V40

（相對于40g/L的酪蛋白濃度）。

（5）然后分別量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重復上述操作，分別測出V30、V20、V10。

（6）利用上述結果，即求出Vm與Km值。

（1）試驗說明，反應速度只在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著反應時間的延長，酶促反應

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（1）根據(jù)試驗結果填寫下表

表1淀粉溶液粘度測量記錄表

______年_________月________日室溫________℃

流出時間t（s）待測液水0.2％淀粉溶液0.4％0.6％0.8％1.0％（1）（2）（3）平均相對粘度增比粘度實際粘度?r?sp?(Pa·s)（2）根據(jù)上表，繪制c??曲線。

（1）粘度計測量確鑿性的關鍵是什么？（2）影響溶液粘度的主要因素有哪些？

試驗八5L發(fā)酵罐發(fā)酵L-乳酸

5L發(fā)酵罐發(fā)酵L-乳酸試驗涉及微生物學，生物工程原理，有機酸工藝學，發(fā)酵工廠設備，工業(yè)發(fā)酵分析等多門課程內(nèi)容。希望同學們復習這些相關知識，了解從生產(chǎn)菌種到發(fā)酵法制備大宗化工原料的全過程。

（1）學習把握利用發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的原理和工藝操作（2）熟練把握5L發(fā)酵罐的結構和使用方法（3）把握L-乳酸、殘?zhí)呛途w濃度的測定方法

乳酸分子式為：CH3CH2OCOOH，分子量90.08，由于乳酸分子內(nèi)含有一個不對稱的C原子，從而具有D-型和L-型兩種構型。L-乳酸為右旋，D-乳酸是左旋的，當L(+)-乳酸和D（-）-乳酸等比例混合時，即成為消旋的DL-乳酸。

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乳酸生產(chǎn)有三種方法：化學合成法，酶法和微生物發(fā)酵法。發(fā)酵法制備乳酸是以淀粉、葡萄糖、等糖類或牛乳為原料，接種微生物經(jīng)發(fā)酵而生成乳酸。乳酸發(fā)酵機理主要有:Ⅰ.同型乳酸發(fā)酵，Ⅱ.異型乳酸發(fā)酵，Ⅲ.雙歧桿菌發(fā)酵。

本試驗用菌為嗜熱乳酸桿菌(T-1)，發(fā)酵方式為同型乳酸發(fā)酵。發(fā)酵機理如下：葡萄糖經(jīng)EMP途徑降解為丙酮酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸。發(fā)酵方式如下：

經(jīng)過這種途徑，1mol葡萄糖可以生成2mol乳酸，理論轉化率為100％。但由于發(fā)酵過程中微生物有其他生理活動存在，實際轉化率不可能達到100％。一般認為轉化率在80％以上者，即認為是同型乳酸發(fā)酵。工業(yè)上較好的轉化率可達96％。

（一）器材

（1）全自動式5L發(fā)酵罐（2）手提式壓力蒸汽滅菌鍋（3）紫外可見分光光度計（4）生化培養(yǎng)箱（5）電熱鼓風枯燥機（6）電子天平

（7）GH801型超凈工作臺（8）TGL－16G臺式高速離心機

（9）HZQ－Q恒溫振蕩器（10）其他：量桶、燒杯、離心管、移液管、酒精等、接種環(huán)、PH試紙、玻璃棒等（二）試劑

（1）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）30、酵母膏5、蛋白胨5、CaCO310（2）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖（玉米糖化液）100，酵母膏5、蛋白胨5、豆粉3（3）8mol/lNaOH溶液（4）消泡劑

（1）分析方法

a．葡萄糖和L-乳酸的測定

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葡萄糖的測定采用費林試劑滴定法（附3）。

乳酸的定性測定：取酸乳上清液的10mL于試管中，參與10%H2SO41mL，再加2%KMnO41mL，此時乳酸轉化為乙醛，把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的濾紙條搭在試管口上，微火加熱試管至沸，若濾紙變黑，則說明有乳酸存在，這里由于加熱使乙醛揮發(fā)的結果。b．菌體濃度的測定

發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，用0.1moL/L鹽酸溶液洗滌沉淀除去剩余CaCO3，離心兩次后，棄上清液，將菌體懸浮于10mL蒸餾水中，用分光光度計測定A580值。（2）操作方法a．玉米糖化液的制備

把500g玉米粉參與到2000ml水中，每100g玉米參與1mlα-淀粉酶，先參與75%，攪拌均勻，在85～90℃保溫1小時，加熱煮沸，待溫度再降至90℃時，參與另外的25%的α-淀粉酶，降溫到50～60℃，加5ml糖化酶保溫6～8小時，得到玉米粉水解糖液。b．種子培養(yǎng)

取新鮮斜面菌種一環(huán)，接入種子培養(yǎng)基中，于轉速150r/min搖床中，50℃培養(yǎng)16-18h。c．5L發(fā)酵罐發(fā)酵①空消：空罐滅菌。

②實消：將發(fā)酵培養(yǎng)基2.7L從進樣口倒入5L發(fā)酵罐中，蓋上蓋子。檢查發(fā)酵罐安裝完好后，蓋上滅菌罩，105℃滅菌15分鐘。

③校正：校正pH電極、溶氧電極（校正方法參考5L罐使用說明書）

④接種與發(fā)酵：在接種圈的火焰保護下，將種子培養(yǎng)液300mL倒入發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度50℃，pH為6.0,溶氧:0～20h通風60L/h，發(fā)酵罐攪拌100r/min，20～72h中止通風和攪拌。以NaOH為中和劑。

⑤測量：每隔4h取樣，測菌體濃度、葡萄糖和L-乳酸濃度。

（1）使用SBA～40C生物傳感分析儀要嚴格依照使用說明進行，進樣針使用完畢后要

用蒸餾水清洗，以防進樣針堵塞。

（2）使用蒸汽發(fā)生器滅菌時注意蒸汽發(fā)生器壓力不要太高，以免發(fā)生危險。

（1）發(fā)酵培養(yǎng)時，依照一定的時間間隔取樣測定并記錄，結果如下表。時刻12：0016：0020：00時間／h048葡萄糖濃度/(g/L)菌體濃度A600L-乳酸濃度/(g/L)簽名—17—

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24：004：008：0012：0016：0020：0024：004：008：0012：0016：0020：0024：004：008：0012：0012162024283236404448525660646872(2)依照上表給出的相應數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標，表中數(shù)據(jù)為縱坐標繪圖，分析各量

的變化規(guī)律。

(3)計算糖酸轉化率(%)：生成L-乳酸的克數(shù)與消耗葡萄糖克數(shù)之比的百分數(shù)。

試驗九糖化酶的發(fā)酵（一）

（1）把握發(fā)酵的一般工藝流程（2）了解糖化酶發(fā)酵的基本方法和技術

糖化酶全稱葡萄糖淀粉酶，系統(tǒng)名為淀粉-α-1,4-葡聚糖水解酶。它對淀粉分子的水解作用是從非還原性末端切開α-1,4健，也能切開α-1,3健和α-1,6健，生成葡萄糖。生產(chǎn)糖化酶的菌種是黑曲霉，其在查氏培養(yǎng)基上生長呈擴散形，菌絲白色，有時出現(xiàn)黃色區(qū)域，絨狀，有明顯的輻射波紋，無滲出液，邊緣生長較薄，咖啡色，反面為淡黃色。將活化好的黑曲霉制成孢子懸液，轉接到三角瓶中直接進行糖化酶發(fā)酵。

（1）菌種：黑曲霉（2）裝置：搖床，三角瓶（3）培養(yǎng)基：

i.

種子培養(yǎng)基（查氏培養(yǎng)基）：NaNO32g；K2HPO41g；KCl0.5g；MgSO4

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0.5g；FeSO40.01g；蔗糖30g；水1000ml；PH自然ii.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：玉米粉60；豆餅粉25；酵母膏5

（一）培養(yǎng)基的配制

（1）種子培養(yǎng)：取依照種子培養(yǎng)基的配方配置培養(yǎng)基200ml，分裝于兩只250ml的三角瓶

中。用8層紗布包扎瓶口，再加牛皮紙包扎。置于滅菌鍋中，在0.1Mpa下滅菌40min。（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：依照發(fā)酵培養(yǎng)基的配方配置培養(yǎng)基300ml，分裝于三只250ml的三角瓶

中。同樣用8層紗布包扎瓶口，再加牛皮紙包扎，同樣條件下滅菌40min。（3）包扎10ml和5ml的移液管若干（每個組各準備2支）（二）種子培養(yǎng)

取5ml無菌水注入成熟的查氏培養(yǎng)基斜面，振蕩成孢子懸液。分別將孢子懸液接入種子培養(yǎng)基中，接重量為2ml，做好標記，將三角瓶固定在搖床上，轉速為200r/min，31℃，培養(yǎng)時間48小時。（三）發(fā)酵培養(yǎng)

依照10%的接種量將種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉速為250r/min，31℃培養(yǎng)96小時。每間隔12小時顯微鏡觀測菌絲形態(tài)。測定PH和酶活力。

記錄測定的測定PH和酶活力結果。

試驗十糖化酶的發(fā)酵（二）——酶活力的測定

（1）了解酶活的定義（2）把握酶活的測定方法

1g固體酶粉（或1ml液體酶），于55℃、PH4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為一個酶活力單位，以u/ml表示。

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解α-1,4糖苷鍵生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸鈉氧化，過量的次碘酸鈉酸化后析出碘，再用硫代硫酸鈉標準溶液滴定。計算酶活力。

（1）乙酸－乙酸鈉緩沖液（稱取乙酸鈉6.7g，溶于水中，冰乙酸2.6ml，用水定容至

1000ml，用PH計校正至pH4.6）

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（2）0.05mol/L的硫代硫酸鈉標準溶液，（3）0.1mol/L的碘溶液（4）0.1mol/L和5mol/L的氫氧化鈉溶液（5）2mol/L的硫酸溶液（6）20g/L的可溶性淀粉溶液，

（1）待測發(fā)酵液的制備：

吸取10ml發(fā)酵液，用乙酸緩沖液定容制度，搖勻。通過4層紗布過濾，濾液供待測定用。

（2）發(fā)酵液酶活的測定：

a）取兩只100ml的三角瓶，標記為甲乙兩管，分別在其中參與25ml的可溶性淀粉和5ml的緩沖液，搖勻后在55℃恒溫水浴鍋中預熱5分鐘。

b）在甲管中參與待測的酶液2ml，立刻搖勻，在此溫度下確鑿反應30分鐘，立刻參與5mol/L的氫氧化鈉溶液0.2ml，搖勻。將兩管取出迅速冷卻。c）在乙管中參與待測酶液2ml。

d）吸取上述反應液與空白液各5ml,分別置于碘量瓶中，確鑿的參與碘溶液10ml，再參與0.1mol/L氫氧化鈉溶液15ml，搖勻，密閉于暗處反應15分鐘。取出，參與硫酸溶液2ml，馬上用硫代硫酸鈉標準溶液滴定，直至藍色剛好消失為其終點。

（3）發(fā)酵液酶活的測定：

U＝（A-B）*C*90.05*32.2/5*1/2*n*2=579.9*(A-B)*C*n式中：U——樣品的酶活力

A——空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mlB——樣品消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mlC——硫代硫酸鈉標準溶液的濃度，mol/L

90.05——與1ml硫代硫酸鈉標準溶液相當?shù)囊钥吮硎镜钠咸烟堑馁|量；32.2——反應液的總體積，ml5——吸取反應液的體積，ml1/2——吸取酶液的體積，換算為1mln——稀釋倍數(shù)

2——反應30分鐘，換算成1h的酶活力系數(shù)所得的結果表示至整數(shù)。

1酶活力(u/ml)100ml23—20—

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pH菌體特征

試驗十一糖化酶的發(fā)酵（三）——糖化酶的提取

（1）把握糖化酶的提取方法（2）了解酶的一般提取方法

酶的提取首先要除去發(fā)酵液中的懸浮固形物獲得澄清的酶液；然后進行適當程度的濃縮；其次是根據(jù)需要將酶沉淀，然后收集沉淀，枯燥，磨粉，獲得粉狀制劑。黑曲霉糖化酶是一種胞外酶，因此，首先采用過濾法將菌體等雜質除去，繼而對濾液進行濃縮，最終將酶沉淀出來，對沉淀進行枯燥，加工成成品。糖化酶的沉淀可采用硫酸銨鹽析法，也可以采用有機溶劑如乙醇的沉淀。

糖化酶發(fā)酵液，鹽酸，無水酒精，硫酸銨，布氏漏斗。濾布，旋轉蒸發(fā)儀，枯燥箱，天平，三角瓶，量筒。

（1）過濾：取發(fā)酵液200ml，在漏斗中用濾布過濾除去菌體，菌體用100ml水洗滌、抽濾。

合并清夜，記錄總體積。

（2）濃縮和沉淀：將總濾液放入蒸發(fā)器中濃縮到1/3~1/5體積，將濃縮液一分為二。（3）一份用鹽酸調理pH到3.5，在10～20℃條件下參與3.5倍冷凍的無水酒精，邊加邊攪

拌，即可發(fā)現(xiàn)酶的沉淀現(xiàn)象。

（4）另一份按0.55g/ml加硫酸銨，靜止鹽析一個小時。沉淀物用布氏漏斗抽濾。稱酶泥的

質量。

（5）枯燥與加工：將上述步驟中得到的酶泥放入枯燥箱，在40℃下以熱風枯燥。將枯燥的

制品磨粉即得成品。將成品稱質量。

方法項目硫酸銨沉淀數(shù)據(jù)收率乙醇沉淀數(shù)據(jù)收率—21—

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發(fā)酵液總體積（ml）過濾液總體積（ml）濃縮液總體積（ml）酶泥濕重（g）酶泥干重（g）

附錄

附1：試驗常用培養(yǎng)基和試劑

（1）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

成分：

蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g氯化鈉5g瓊脂15-20g蒸餾水1000mL制法：

將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，參與15％氫氧化鈉溶液約2mL校正pH至7.2-7.4，參與瓊脂，加熱煮沸使瓊脂溶化，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。注:此培養(yǎng)基可供一般細菌培養(yǎng)之用，可傾注平板或制成斜面。如用于菌落計數(shù)，瓊脂量為1.5％；如作成平板或斜面，則應為2％。

（2）乳糖膽鹽發(fā)酵管

成分：

蛋白胨10g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g乳糖10g0.04％溴甲酚紫水溶液24mL蒸餾水1000mLpH7.4制法：

將蛋白陳、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，參與指示劑，分裝每管10mL，并放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。

注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。

（3）乳糖發(fā)酵管

成分：蛋白胨20g乳糖10g蒸餾水1000mL0.04％溴甲酚紫水溶液25mLpH7.4

—22—

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制法：

將蛋白陳及乳糖溶于水中，校正pH，參與指示劑，按檢驗要求分裝每管30mL、10mL或3mL，并放入一個小倒管，115℃高壓滅菌15min。注：①雙料乳糖發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。

②30mL和l0mL乳糖發(fā)酵管專供醬油及醬類檢驗用，3mL乳糖發(fā)酵管供大腸菌群證明試驗用。

（4）麥康凱瓊脂

成分：蛋白胨17g朊胨3g

豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g氯化鈉5g瓊脂17g蒸餾水1000mL乳糖10g

0.01％結晶紫水溶液10mL0.5%中性紅水溶液5mL制法：

①將蛋白胨、朊胨、膽鹽和氧化鈉溶解于400mL蒸餾水中，校正PH7.2，將瓊脂參與600mL蒸餾水中，加熱溶解，將兩液合并，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。

②臨用時加熱熔化瓊脂，趁熱參與乳糖，冷至50℃一55℃時，參與結晶紫相中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。

結晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。

（5）伊紅美藍瓊脂(EMB)

成分：

蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂17g

2％伊紅Y溶液20mL0.65％美藍溶液10mL蒸餾水1000mLpH7.1制法：

將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正pH，分裝于燒瓶內(nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。臨用時參與乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至50℃一55C，參與伊紅和美藍溶液，格

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搖勻，傾注平扳。

（6）三糖鐵瓊脂（TSI）

成分：蛋白胨20g牛肉膏5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g氯化鈉5g

硫酸亞鐵銨[Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O]0.2g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12g酚紅0.025g蒸餾水1000mLpH7.4制法：

將除瓊脂和酌紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH，參與瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂，參與0.2％酚紅水溶液12.5mL，搖勻，分裝于試管內(nèi)，裝量宜多些，以便得到較高的底層。l21℃高壓滅菌15min，放置高層斜面?zhèn)溆谩?/p>

（7）克氏雙糖鐵瓊脂（KI）

上層培并基成分：

血消化湯(pH7.6)500mL瓊脂6.5g硫代硫酸納0.1g硫酸亞鐵銨0.1g乳糖5g

0.3％酚紅溶液5mL下層培養(yǎng)基成分：

血消化湯(pH7.6)500mL瓊脂2g葡萄糖1g

0.2％酚紅镕液5mL制法:

①取血消化湯按上層和下層的瓊脂用量，分別參與瓊脂，加熱溶解。

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附3：費林試劑滴定法測定總糖和還原糖

1、測定方法

（1）總糖測定將發(fā)酵液通過枯燥濾紙過濾，取濾液1ml（如糖含量高則取0.5ml）于

250ml三角瓶中，加蒸餾水10ml，6NHCl5ml,在石棉網(wǎng)上煮沸3分鐘（從開始沸騰算起，確鑿計時），置于冷水中冷卻至室溫，加6NNaOH5ml。以后步驟同還原糖測定。（2）還原糖測定將發(fā)酵液通過枯燥濾紙過濾，取濾液1ml（如糖含量高則取0.5ml）加

蒸餾水10ml，搖勻后確鑿參與費林試劑20ml，再煮沸3分鐘（從開始沸騰算起，確鑿計時），冷卻后加6NHCl10ml，馬上以0.1NNa2S2O3標準溶液滴定到淡黃色，加淀粉指示劑1ml，繼續(xù)滴定到藍色褪去即為終點，讀取毫升數(shù)。（3）以蒸餾水10ml，確鑿參與費林試劑20ml,加熱煮沸3分鐘，作空白試驗，同樣以Na2S2O3

標準溶液滴定，得空白硫代硫酸鈉毫升數(shù)。取空白與樣品所消耗Na2S2O3標準溶液體積的差數(shù)，查表求得殘?zhí)呛俊?、標準曲線繪制：

確切稱取60℃一小時，80℃一小時，烘烤至恒重（2小時）的AR標準葡萄糖（含量在99%以上）0.5克于100ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度搖勻，分別吸取0.5，1，1.5，2.5，5ml按糖法測之。以糖的百分含量為橫坐標，以0.1NNa2S2O3標準溶液滴定毫升數(shù)為縱坐標，作一曲線列表備用。3、試劑

（1）費林試劑

費林A：取CuSO4.5H2048克加水溶解，稀釋至800ml。

費林B：取酒石酸鉀鈉150克，NaOH100克，加水溶解，并稀釋至800ml。30%KI：稱取60克KI加水溶解，稀釋至200ml。

同時將A,B各取400ml等量混合均勻，再參與30%KI200ml，即得費林試劑。（2）6N鹽酸

取濃鹽酸500ml于已有100ml蒸餾水的1000ml的試劑瓶中，加水稀釋至1000ml。（3）6N氫氧化鈉

取NaOH240克溶解于水，稀釋至1000ml。（4）0.5%淀粉指示劑

稱取可溶性淀粉0.5克于清白的小燒杯中，加蒸餾水少量，調成漿狀倒入已沸騰的100ml蒸餾水中，再沸騰1-2分鐘即可。（5）1NNa2S2O3溶液

?。∟a2S2O3）C.P250克及Na2CO32克溶于1000ml已煮沸冷卻的蒸餾水中，放置8-14天后進行標定。置于暗處保存?zhèn)溆?。?）0.1NNa2S2O3溶液Na2S2O3

取上述儲存液100ml，以新鮮蒸餾水稀釋至1000ml，配制標準的0.1N溶液后以0.1NKIO3標準溶液滴定，近終點時加2ml淀粉指示劑，由藍色至無色為終點。同時作一空白試驗。

（7）標準的0.1N溶液Na2S2O3濃度的計算：

CNa2S2O3?4、本卷須知：

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WKIO3(g)(樣品-空白)ml數(shù)?0.03567

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（1）費林試劑混合時，費林A、B必需充分混合均勻，然后才能參與KI，否則KI遇

CuSO4生成CuI沉淀。費林混合液參與量要確鑿，空白誤差不能超過0.05ml。（2）費林于試樣要充分搖勻，不能使其殘留壁上。

（3）發(fā)酵液加酸水解后，須用堿中和，并將溶液搖勻，否則參與費林試劑后將析出I2。

假使加費林試劑后呈綠色，說明溶液未搖勻，局部呈酸性至I2析出，這是試驗須重做。

（4）用HCl酸化后，滴定前必需沿壁振蕩均勻，用Na2S2O3滴定時速度必需快。（5）淀粉指示劑溶液應在滴定至淡黃色才可參與，過早參與I2和淀粉形成絡合物，消

耗過量的Na2S2O3，引起較大誤差。

（6）Na2S2O3的水溶液遇酸和空氣中的氧以及水中細菌極易起分解作用。Na2S2O3+H2CO3NaHCO3+S+NaHSO3Na2S2O3+H2SO4Na2SO4+SO2+S+H2O

Na2S2O3+1/2O2Na2SO4+S

水中含有的銅離子也能使其分解：2Cu2++2S2O32-2Cu++S4O62-

因此，在配制Na2S2O3時蒸餾水必需先煮沸并冷卻成新鮮的蒸餾水。配成較濃溶液應放置數(shù)日后濃度可穩(wěn)定，使用溶液時間不能太久，否則濃度易變化。

附4：0.1mol/L硫代硫酸鈉標準溶液的配制和標定

1.配制：稱取26g硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）或16g無水硫代硫酸鈉，及0.2g無水碳酸鈉，參與適量新煮沸過的冷水使之溶解，并稀釋至1000ml，混勻，放置一個月后過濾備用。

2.標定：確鑿稱取0.15g在120℃枯燥至恒量的基準重鉻酸鉀