細胞生物學試驗指導_第1頁
細胞生物學試驗指導_第2頁
細胞生物學試驗指導_第3頁
細胞生物學試驗指導_第4頁
細胞生物學試驗指導_第5頁
已閱讀5頁,還剩13頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

本文格式為Word版,下載可任意編輯——細胞生物學試驗指導

細胞物學試驗指生導

細胞生物學試驗指導目錄

一.顯微鏡的使用

試驗一、幾種光學顯微鏡的使用

試驗二、參觀電子顯微鏡及生物超薄切片標本制備

二.細胞形態(tài)結構

試驗三、細胞大小的形態(tài)觀測——測微尺的使用試驗四、細胞活體染色技術

試驗五、植物細胞骨架光學顯微觀測試驗六、胞間連絲觀測

三.細胞化學

試驗七、鑒定RNA的細胞化學方法——Branchet反應

試驗八、DNA顯色的觀測——Feulgen反應

試驗九、固綠染色法鑒定細胞內酸性蛋白與堿性蛋白試驗十、多糖及過氧化酶的顯示

試驗十一、核仁組成區(qū)的銀染顯示與觀測

四.細胞生理

試驗十二、細胞膜的通透性試驗十三、細胞電泳

五.細胞和組織培養(yǎng)技術

試驗十四、植物原生質體的分開和融合

試驗十五、植物細胞的培養(yǎng)與觀測試驗十六、動物細胞融合

試驗十七、動物細胞的培養(yǎng)與觀測

六.細胞化學成分的分開

試驗十八、細胞器的分開、純化——細胞分級分開試驗十九、熒光的細胞化學測定試驗二十、細胞活力的鑒別

試驗一幾種光學顯微鏡的使用

2

一、試驗目的

了解幾種光學顯微鏡的結構、工作原理、主要用途和使用方法;把握使用普通顯微

鏡提高分辯力的方法。

二、試驗原理

(一)基本原理

一般試驗室經常使用的光學顯微鏡都是由物鏡、目鏡、聚光器和光闌組成,普通顯

微鏡它們的放大原理及光路圖如下:

A2A1BB2AO2O1F1F2B1AB物體.A1Bl第一次成像,A2B2其次次成像,Ol目鏡.O2物鏡,F1為Ol的前焦點,F2為O2的前焦點

各種光學顯微鏡的光學放大原理基本一致,各種特別用途的光鏡不過只是在光源、物鏡、聚光器等方面作了改動,或在其它方面增設了某些特別的設備。(二)幾種光學顯微鏡

l、普通光學顯微鏡:

普通光學顯微鏡也叫復式顯微鏡,是最常見,最簡單的顯微鏡。它適于觀測一般固定的,有色的透明度較高的標本。其最大分辯力一般為0.2微米,從構造上可分光學、機械和電子三大系統(tǒng)。2、暗視野顯微鏡:

暗視野顯微鏡是以丁達爾現象(Tyndallphenomenon)(即光的微粒散射現象)為基礎

設計的,它使用了特別的聚光器進行斜射照明,因光源中心束不直入物鏡,所以視野黑暗,而被檢細胞器因斜射照明發(fā)生衍射和反射,所以發(fā)亮可見。暗視野顯微鏡可用增加光照方法增加物體與背景的反差,因而可觀測到0.2—0.004微米直徑的微小粒子,但它分不清被檢物的微弱構造,它常用于觀測物體的存在與運動。而暗視野顯微鏡與普通光學顯微鏡的區(qū)別,主要在于聚光器的不同,致使照明方法有別。確鑿地說,稱暗視野顯微鏡為暗視野照明更為貼切。它是照明光線僅照亮被檢樣品而不進入物鏡。使視野背景暗黑,樣品敞亮的照明方法。3、相差顯微鏡:

相差是指同一光線經過折射率不同的介質其相位發(fā)生變化并產生的差異。相位是指在某一時間上,光的波動所達到的位置。

3

一般由于被檢物體(如不染色的細胞)所能產生的相差的區(qū)別太小,我們的眼睛是很難分辯出這種區(qū)別的,只有在變相差為振幅差(明暗之差)之后,才能被分辯。相差顯微鏡是以光的干擾現象為基礎設計的。與普通光學顯微鏡比較,它在聚光器和物鏡上作了改動。用裝有環(huán)狀光闌的聚光器造成的空心光線柱,使直射光(背景)和衍射光(樣品)分開。同時在物鏡的后焦面上裝有相板,使直射光和衍射光發(fā)生干擾,從而把我們肉眼不能見的相位差變?yōu)榭梢姷恼穹?,同時相板上裝有吸收膜,吸收部分直射(或衍射)光以增加反差,使人們能夠看清更加微弱的結構。所以相差顯微鏡一般用于觀測活細胞的微弱結構。4、熒光顯微鏡:

熒光是指某些物質經波長較短的光線照射后,分子被激活吸收能量后呈激發(fā)態(tài),其能量部分轉化為熱量或用于光化學反應外,相當一部分則以波長較長的光能形式輻射出來,這種波長長于激發(fā)光的可見光稱作熒光。

熒光顯微鏡是以紫外線(3650A)或蘭紫光(4200A)照射某些物質,可激發(fā)其產生熒光的原理為基礎設計的,利用一個高發(fā)光效率的光源,經過一個濾光系統(tǒng)得到紫外光(或蘭紫外光),直接照射標本中的自然熒光物質,使其產生自發(fā)熒光,再加以鏡檢?;蛞詿晒馊玖舷葘吮具M行染色,然后使之在上述光源照射下產生次生熒光,再加以鏡檢。這種顯微鏡主要用于觀測熒光(或次生熒光)物質在細胞內分布狀況,以及測定細胞器的生理活性。

(三)如何提高分辯力

顯微鏡的能力是質量和性能的標志。能力包括分辯率、放大率、焦點深度和視場寬度等。其中最重要的是分辯率。各種能力都有一定的限界,既相互作用,又相互制約,改善和提高了某種能力,同時降低了某些能力,只能顧其主要,兼顧其它,綜合籌統(tǒng)。1、數片孔徑(numerialaperture)

數片孔徑(N.A.)也叫鏡口率,是物鏡和被檢樣品之間的介質的折射率(n)與物鏡所接受的光錐頂角(亦稱孔徑角)的一半α(半孔徑角)正弦的乘積。其公式如下:N.A.=n·sinα

物鏡的數值孔徑愈大,顯微鏡的能力愈強,數值孔徑與分辯率成正比,與焦點深度成反比.物鏡的數值孔徑的N.A.值刻在物鏡殼上,如40/0.65表示40倍的物鏡,數值孔徑為0.65。物鏡的數值孔徑隨前透鏡直徑的減少而增大。顯微鏡物鏡的前透鏡口徑愈小,數值孔徑愈大,放大倍數愈高,價格愈高。2、分辯率(resolvingpower)

物鏡分辯力是指分辯被檢樣品微細結構的能力。尋常以能明了地分辯兩個物體點的最短距離來表示。其公式如下:R=0.61×λ/N.A.

R:分辯率;λ:照射光線波長;N.A.:物鏡數值孔徑

分辯率以分辯兩個點的最短距離表示,R值愈小,分辯能力愈大。物鏡的分辯率與照明光線的波長成反比,與物鏡的數值孔徑成正比。

照明光線波長愈短,物鏡的數值孔徑愈大,顯微鏡的分辯率亦愈大。

物鏡的分辯力即顯微鏡的分辯率,目鏡與顯徽鏡的分辯力無關,它只把物像其次次放大,使眼睛便于觀測。目鏡只能將物鏡已經分辯的影像進行放大,無法觀測到未被物鏡分辯的細節(jié)。在光學成像過程中,目鏡不起初始造像作用,僅作放大而已。3、放大率(magnification)

顯微鏡最終形成的物體放大影像,對被檢物體的大小比例稱為放大率,即像高比物高。放大倍數以長度計算,而不是以面積或體積計算。

4

顯微鏡的總放大率(Mt)應為:

Mt=Mob×Me×Mph

Mt:總放大率;Mob:物鏡放大率;Me:目鏡放大率;Mph:攝影透鏡放大率

一般鏡檢觀測時,攝影附加透鏡的放大倍率不計算在內,因它未參予造像,顯微鏡分辯微細結構的能力,不取決于總放大率,而歸于物鏡的分辯率。顯微鏡的總放大率,絕非愈高愈好,有其適量范圍:最低和最高界限。適合的總放大率是所用物鏡數值孔徑的500~1000倍。在此范圍稱作有效放大率。例如:使用40/0.65物鏡時,應選配適合的目鏡倍數范圍。

首先計算出有效放大倍率:

0.65×500~0.65×1000=325—650再用物鏡放大倍率除以有效放大率:325÷40~650÷40=8~16

求得的數值是應選配的目鏡放大倍率的范圍,即要選用8×~16×的目鏡。

總之,總放大率超過物鏡數值孔徑的1000倍時,微細結構分辯不清,為空的放大,低于500倍時由于放大率過低,肉眼難以分辯。4、焦點深度(depthoffocus)

當顯微鏡對被檢樣品的某一點或平面準焦時,影像的明了范圍,不局限于這一點或面,在某上下的一定距離或深度內也是明了的。這段明了的距離或深度,就叫做焦點深度,簡稱焦深,焦深長表示明了的上下范圍或深度大,焦深短,明了的上下限界短。顯微鏡的焦深可變,它與物鏡的數值孔徑和總放大率相關。焦深與物鏡的數值孔徑和總放大率成反比,收縮孔徑。影像的焦深加大,提高物鏡的數值孔徑,明了深度變小,總放大率提高,焦深度小,總放大率降低,焦深加大。使用同一物鏡,配用倍率的目鏡,其焦深隨目鏡倍率加大而減少。

三、試驗用品:

(一)材料:草履蟲,洋蔥內表皮,紫鴨趾草等花粉,菠菜葉。

(二)用品:普通光學顯微鏡,暗視野顯微鏡。相差顯微鏡,熒光顯微鏡,載玻片,蓋玻片,吸管,鑷子,剪刀等。

四、試驗方法:

l、觀測草履蟲的外形、運動、纖毛、食物泡等。

取少許棉花纖維或擦鏡紙纖維,放于載玻片上,在其上滴一滴草履蟲懸液,然后加蓋玻片觀測。

2、洋蔥表皮細胞和菠菜葉的細胞核、葉綠體的觀測在載玻片上滴一滴水,撕洋蔥鱗莖內表皮或菠菜下表皮一小塊放于其中,使其展開,然后加蓋片觀測。

3、紫鴨趾草花粉外形、表面突起的觀測

在載玻片上滴一滴水,取紫鴨趾草雄蕊在其中沾幾下,然后蓋片觀測。

五、作業(yè):

1、談談如何提高顯微鏡的分辯力。

2、根據試驗結果,把所能觀測到內容的材料符號填在表內適當的位置。

5

其形態(tài)、大小如何、分布位置。

(二)線料體的活體染色

l、用植物細胞觀測線粒體的活體染色

(1)用鑷子撕取洋蔥鱗莖內表皮一小塊(約lcm2),放在載玻片上用1/5000詹納斯

綠B染色約30分鐘。

(2)吸出染液,滴加Ringer氏液,蓋片、鏡檢,注意觀測線粒體分布及所呈形

狀。

2、用動物細胞觀測線粒體的活體染色。

(1)取鼠肝邊緣較薄的肝組織一小塊,放入盛有Ringer氏液的表面皿中洗去血液。(2)將肝組織洗凈后吸去血液,參與1/5000詹納斯綠B染液染色30分鐘,注意不

可將組織塊完全吞噬。

(3)染色后撕開組織塊,這樣溶液中就會有一些細胞或細胞群。

(4)用吸管吸取溶液,放在載玻片的Ringer氏液中。墊兩根短頭發(fā),加蓋玻片,即

可鏡檢。

(5)用油鏡觀測活染色的線粒體標本,要不斷地來回轉動細調焦螺旋,使蓋玻片上

下漸漸移動。使材料總是得到氧氣,線粒體的染色才顯得十明顯了。3、人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色觀測(1)取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上,滴2滴1/5000詹納斯綠B溶

液。

(2)用牙簽取口腔上皮細胞,將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中,染色10一15分鐘(注意不能枯燥),蓋上蓋片,吸去多余的溶液,即可鏡檢。(三)臺盼藍染色鏊別死活細胞。

抽取小鼠腹腔水細胞涂于清白載玻片上,滴加l%臺盼藍1滴,蓋上蓋玻片于顯微鏡下觀測。

五、作業(yè):

l、所觀測到的液泡大小是否有區(qū)別,染色深度是否一樣,并繪圖加以說明。

2、所觀測到線粒體分布在細胞何處.呈什么顏色,其形狀如何,繪圖加以說明。3、比較線粒體在動、植物中的分布、顏色,其形狀如何?

11

試驗五植物細胞骨架的光學顯微觀測

一、試驗目的:

觀測光學顯微鏡下細胞骨架的結構,了解顯示植物細胞骨架的方法及其原理。

二、試驗原理:

細胞骨架是指在細胞中支持和連接細胞各組分,以及與細胞運動有關的結構,它包括微管、中間纖維、微絲。當用適當濃度的TritonX一100處理時,可將細胞內大部分蛋白質抽提掉,但細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質卻仍被保存,經過固定和考馬斯亮藍R250染色,從而在光鏡下觀測到細胞骨架的網狀結構。

三、試驗用品:

(一)器材:顯微鏡、50ml燒杯、滴管、容量瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子。(二)試劑:

1、M一緩沖液:50mmol/L瞇唑,50mmol/LkCl:,0.5mmol/LMgCl2,

lmmol/LEGTA(乙二醇雙(a一氨基乙酸)醚四乙酸)0.1mmoL/LEDTA,lmmol/L巰基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇)。2、6mmol/LPH6.8磷酸緩沖液。

3、1%TritonX一100,用M一緩沖液配。

4、0.2%考馬斯亮藍R250,其溶劑是甲醇46.5ml,冰乙酸7ml,蒸餾水46.5ml。5、3%戊二醛,用6mmol/L磷酸緩沖液(PH6.8)配制。6、5%、7%、95%乙醇。

7、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、樹膠。(三)材料:洋蔥鱗莖。

四、試驗方法:

(一)取洋蔥鱗莖內表皮細胞(約lcm2大小)若干片溫于裝有PH6.8磷酸緩沖液

的50ml燒杯中,使其下沉。

(二)吸去磷酸緩沖液,用1%TritonX一100處理20—30分鐘。(三)吸去TritonX—loo,用M一緩沖液洗3次,,每次10分鐘。.(四)3%戊二醛固定0.5—1小時,(對照組開始處理)。(五)PH6.8磷酸緩沖液洗3次,每次10分鐘。(六)用0.2%考馬斯亮藍R250染色20—30分鐘。

(七)用蒸餾水洗1—2次,材料置于載玻片上,加蓋玻片,即可鏡檢。

(八)如作永久制片,可使樣品,順序通過如下試劑:50%乙醇,70%乙醇。95%

乙醇,95%乙醇和叔丁醇混合液(1:1),每次5一10分鐘,或正丁醇→正丁醇二→甲苯二→甲苯,每次5—10分鐘。然后撈取樣品,平展于載玻片上,中性樹膠封固。

五、作業(yè)

I、比較對照組和處理組的細胞骨架結構有何不同?2、繪制細胞骨架圖。

12

試驗六胞間連絲的觀測

一、試驗目的:

觀測植物細胞的胞間連絲,了解其意義。

二、試驗原理:

高等植物細胞之間通過胞間連絲相互連接,完成植物細胞間的通訊連結,胞間連絲穿越細胞壁,由相互連接的相鄰的細胞質膜共同組成的直徑為20—40nm的管狀結構,中央是由內質網延伸形成的鏈管結構,胞間連絲的形成是在細胞分裂時由GB內質網小泡形成胞間層,內質網穿過胞間層形成胞間連絲,在細胞生長過程中胞間連絲的數目還會增加。

三、試驗用品:

(一)器材:顯微鏡,載玻片,蓋玻片,解剖刀,刀片,鑷子,剪刀。(二)試劑:0.5%的蕃紅水溶液。

(三)材料:紅辣椒,玉米籽粒,洋蔥。

四、試驗方法:

(一)紅辣椒表皮細胞臨時制片。

取一小塊紅辣椒,用刀片防備刮除果肉,留下一層極薄的表皮,放于載玻片上,封片觀測、鏡檢時光線不要太亮。(二)玉米種子糊粉層臨時制片

將玉米種子在水中浸泡一天,用鑷子剝去表皮露出糊粉層,這時可以用攝子輕撕糊粉層放于水中,或制作徒手切片。刀口與糊粉層平行,切極薄片,封片觀測。(三)洋蔥內表皮細胞觀測

撕洋蔥內表皮一小塊,0.5%番紅染色2—3分鐘,沖洗,封片觀測,多余的水用吸水紙吸干。

五、作業(yè)

繪各種材料的胞間連絲圖。

13

試驗七鑒定RNA的細胞化學方法一Branchet反應

一、試驗目的:

通過試驗了解Branchet反應的原理及操作方法,觀測DNA、RNA在細胞內分布的主要位置。

二、試驗原理:

Branchet反應是鑒定細胞內的RNA的一種標準方法,主要是利用核酸分子上的負電荷(PO43-)與帶正電荷的堿性染料結合形成鹽鍵而在原位沉淀顯色,所以它可以同時染出RNA和DNA。

Unna試劑中的甲基綠(methylgreen)和DNA親和力高,派若寧(Pyroin)和RNA親合力高。因此DNA可被染成蘭綠色,而RNA被染成紅色,通過觀測細胞內不同顏色所分布的位置,可初步判斷DNA和RNA在細胞內的分布狀況。

三、試驗用品:

(一)材料:蠶豆根尖石臘切片(二)試劑:

l、Unna染色劑:

甲液:5%Pyronin水溶液6ml2%methglgreen水溶液6ml蒸餾水16ml乙液:1M醋酸鹽緩沖液(PH4.8)16ml

甲乙兩液分別置4~C冰箱備用,用時兩液混勻。2、5%三氯醋酸

3、0.1%RNase的醋酸緩沖液(PH4.8)4、二甲苯

5、乙醇(70%,85%,95%,100%)

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論