白細(xì)胞抗原檢測

白細(xì)胞抗原檢測第1頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一人類白細(xì)胞抗原(HLA)HLA抗原分布相當(dāng)廣泛，見于所有的有核細(xì)胞上，但在淋巴細(xì)胞上的密度最高血小板上的HLA抗原是血小板膜表面的固有結(jié)構(gòu)成分，主要是HLA-I類的A、B位點(diǎn)的抗原HLA-I類抗原是引起血小板同種免疫和血小板輸注無效的主要抗原，約占80%第2頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一HLA抗原檢測技術(shù)人類白細(xì)胞抗原檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于器官移植前的組織配型檢測方法：血清學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法和基因分型方法與臨床輸血的關(guān)系—HLA抗原可引起免疫應(yīng)答→HLA抗體→發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)和血小板輸注無效第3頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一HLA血清學(xué)方法血清學(xué)方法：是用一系列已知的抗HLA抗原的標(biāo)準(zhǔn)血清來檢測未知淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原型別。第4頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一原理：淋巴細(xì)胞膜表面具有HLA抗原，而分型血清中含有抗特定HLA抗原的細(xì)胞毒抗體，該抗體與淋巴細(xì)胞膜上的相應(yīng)的HLA抗原結(jié)合后在補(bǔ)體的參與下?lián)p傷細(xì)胞膜，經(jīng)染料染色后，通過觀察細(xì)胞是否被染色來判斷待測細(xì)胞是否損傷或死亡，進(jìn)而判斷抗原、抗體反應(yīng)的強(qiáng)度。微量淋巴毒實(shí)驗(yàn)第5頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)記分死細(xì)胞（%）記分意義0～101陰性11～202可疑陰性反應(yīng)21～404可疑陽性反應(yīng)41～806陽性反應(yīng)0～＞808強(qiáng)陽性反應(yīng)第6頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一抗血清的來源和標(biāo)準(zhǔn)①通過妊娠、輸血和同種器官移植等免疫作用產(chǎn)生HLA同種抗體②使用純化的HLA抗原免疫動(dòng)物，可產(chǎn)生HLA異種抗體③使用雜交瘤技術(shù)，可獲得單克隆抗體④少數(shù)存在的天然抗體第7頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.血清特異性程度（FP《3%，F(xiàn)N《14%）2.血清的強(qiáng)度，采用強(qiáng)度指數(shù)SI表示，SI》70%第8頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一HLA細(xì)胞學(xué)方法①純合細(xì)胞分型方法②預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)③混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)第9頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一純合細(xì)胞分型方法該方法的原理為帶有A/A純合抗原的細(xì)胞（HTC）作為刺激細(xì)胞，帶有未知抗原X/X的檢測細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞，在兩種細(xì)胞組成的單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)（MLC）中，如果發(fā)生刺激反應(yīng)，表明受檢細(xì)胞能夠識別A抗原當(dāng)成外來抗原，所以受檢細(xì)胞不具有A抗原，反之受檢細(xì)胞可能是A抗原的雜合子或純合子第10頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)在應(yīng)答細(xì)胞A與刺激細(xì)胞B的初次混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)(MLC)中，經(jīng)過9-12天培養(yǎng)，應(yīng)答細(xì)胞A增生為淋巴細(xì)胞后變成小淋巴細(xì)胞，即為預(yù)致敏淋巴細(xì)胞（PL）第11頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)兩個(gè)無關(guān)個(gè)體的淋巴細(xì)胞，在體外適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下混合培養(yǎng)后可以互相激發(fā)，使細(xì)胞活化并向母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生分裂增生現(xiàn)象，即為混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法（MLC）?，F(xiàn)MLC主要用于實(shí)體器官移植前的快速相容性檢測。分雙向MLC和單向MLC第12頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一HLA基因分型方法PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）序列特異性引物PCR（PCR-SSP）PCR序列特異性寡核苷酸探針分型技術(shù)（PCR-SSO）PCR單核苷酸序列分析（PCR-SBT）基因芯片流式細(xì)胞術(shù)第13頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一粒細(xì)胞抗原、抗體檢測血清學(xué)方法①粒細(xì)胞凝集試驗(yàn)（GAT）②粒細(xì)胞免疫瑩光試驗(yàn)（GIFT）③單克隆抗體特異性粒細(xì)胞抗原捕獲試驗(yàn)（MAIGA）④ELISA方法⑤流式細(xì)胞術(shù)第14頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一基因分型技術(shù)主要方法為PCR-RFLP PCR-SSPPCR-SSO等1、PCR序列特異性引物2、PCR限制性片段長度多態(tài)性第15頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板血型抗原血小板血型抗原主要有兩大類：血小板相關(guān)抗原血小板特異性抗原。第16頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板相關(guān)抗原：血小板表面存在的與其他細(xì)胞或組織共有的抗原血小板特異性抗原（HPA）：通常將血小板表面由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板特有的遺傳多態(tài)性，并且不存在于其他細(xì)胞和組織上的抗原。第17頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板相關(guān)抗原1、紅細(xì)胞血型抗原：血小板上的ABH抗原物質(zhì)，包括機(jī)體所產(chǎn)生的以及由血漿中黏附在血小板表面的兩類抗原構(gòu)成。2、HLA系統(tǒng)血型抗原：血小板表面主要存在HLA-Ⅰ類抗原，如HLA-A、HLA-B、HLA-C位點(diǎn)等第18頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板特異性抗原血小板特異性抗原(HPA)是由血小板特有的抗原決定簇組成，表現(xiàn)出血小板獨(dú)特的遺傳多態(tài)性，不存在于其它細(xì)胞和組織中，目前已發(fā)現(xiàn)的血小板特異性抗原已有8個(gè)系統(tǒng)16個(gè)抗原國際命名原則是：①在系統(tǒng)前冠以HPA，即人類血小板抗原的英文縮寫。②各抗原系統(tǒng)以公布日期的順序編號。③對偶抗原按人群中頻率由高至低用字母命名(例如HPA-1a,HPA-2b)

第19頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板特異性抗原在白種人中HPA-1b表現(xiàn)頻率是26.5%，是引起白種人血小板輸注無效發(fā)生的主要血小板特異抗原在亞洲人中HPA－2b抗原頻率約為26％，是引起亞洲人血小板輸注無效發(fā)生的主要血小板特異抗原。第20頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板血型的臨床應(yīng)用一、血小板輸注無效定義：血小板輸注無效-指患者輸注一定量的血小板后其增加值明顯低于預(yù)期值

第21頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板輸注無效是由于患者反復(fù)輸注血小板而產(chǎn)生了血小板同種抗體，導(dǎo)致再次輸入血小板時(shí)，發(fā)生免疫反應(yīng)。主要是由血小板HLA抗原（HLA-A，-B，-C）以及少數(shù)HPA抗原引起的，第22頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一HLA抗體在所有病人中達(dá)到50%-90%，同時(shí)，也有17%-25%的HPA抗體出現(xiàn)，縮短輸注血小板的壽命。在黃種人中，HPA-2b是引起血小板輸注無效的主要原因之一。治療方法：輸注"配合"的濃縮血小板。第23頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一觀察血小板效果的指標(biāo)校正的血小板上升數(shù)（CorrectedCountIncrement,CCI）血小板回收率（percentageplateletrecovery,PPR）第24頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一計(jì)算公式CCI=（輸注后血小板計(jì)數(shù)-輸注前血小板計(jì)數(shù)）×體表面積/輸注血小板總數(shù)×1011PPR=（輸血后血小板計(jì)數(shù)-輸血前血小板計(jì)數(shù)）×血容量/輸入的血小板總數(shù)×1011×100%第25頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一診斷標(biāo)準(zhǔn)輸注血小板后1小時(shí)CCI低于7500，或24小時(shí)CCI低于4500說明血小板輸注無效。（血小板計(jì)數(shù)單位為1ul,體表面積單位為M2）血小板輸注后24小時(shí)回收率小于20%為血小板輸注無效。（血小板計(jì)數(shù)單位為L，血容量按照75ml/kg體重計(jì)算。）第26頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一引起血小板輸注無效的原因非免疫學(xué)原因免疫學(xué)原因第27頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一非免疫學(xué)原因脾功能亢進(jìn)感染發(fā)熱藥物作用DIC血小板的質(zhì)量問題第28頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一免疫學(xué)原因人類白細(xì)胞抗原(HLA)血小板特異性抗原(HPA)如檢測到患者血清中含有HLA抗體或HPA抗體,即可判斷病人的無效輸注是由于同種免疫引起的今后避免輸入相應(yīng)的抗原第29頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一其他臨床應(yīng)用二、輸血后紫癜多發(fā)生在女性，有輸血和妊娠史三、新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜與新生兒溶血病的發(fā)病機(jī)制相似四、特發(fā)性血小板性紫癜第30頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板血型檢測技術(shù)血小板血型（包括血小板抗原及對應(yīng)抗體），在臨床醫(yī)學(xué)和輸血實(shí)踐中具有重要意義，利用可能的方法檢測血小板抗體，可以提高血小板輸注的安全性和有效性。第31頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血清學(xué)檢測血小板免疫熒光試驗(yàn)（PIFT）：既可用于血小板抗原鑒定，又可以用于血小板抗體檢測和交叉試驗(yàn)1、血小板抗原鑒定：待測血小板用于聚甲醛（PFA）或氯喹預(yù)處理，處理過的血小板與已知的特異性抗血清孵育，洗滌，再與標(biāo)記了異硫氰酸熒光素的抗人球蛋白孵育，再次洗滌并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。第32頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一血小板抗體檢測和交叉試驗(yàn)利用已知抗原特異性的血小板細(xì)胞譜與待檢血清混合反應(yīng)，其余步驟與血小板抗原鑒定類似，最后根據(jù)血清血小板細(xì)胞譜的反應(yīng)情況，來鑒定血清中抗體的特異性。第33頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一PIFT的優(yōu)點(diǎn)①因?yàn)樵陲@微鏡下只觀察熒光標(biāo)記的血小板，所以可以避免由于細(xì)胞碎片等引起的非特異性反應(yīng)。②多特異性的抗球蛋白可以識別第34頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)1986年,Rosenfeld等發(fā)明了此技術(shù)。該法將待測血清和熒光標(biāo)記的已知型別的血小板抗體孵育后，用流式細(xì)胞儀檢測。FCM用于免疫性血小板減少癥患者的血小板相關(guān)抗體及血小板膜糖蛋白檢測,具有靈敏、快速、簡便的特點(diǎn),是適用于臨床診斷的新方法。第35頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一單克隆抗體免疫固定血小板抗原方法（MAIPA）：該法先制備羊抗鼠IgG包被的多孔板，另外，將鼠抗人血小板糖蛋白單克隆抗體和帶有抗體的血小板共同孵育，再將孵育后的復(fù)合物加入多孔板，孵育，洗滌，最后加入酶聯(lián)羊抗人抗體和酶反應(yīng)底物后顯色，定量測定血小板抗體。第36頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一特點(diǎn)此方法敏感度高、特異性強(qiáng)，即使是血小板上抗原數(shù)量很少的HPA-5抗原，也能檢測出。MAIPA方法可靈敏地檢測血小板特異性抗體。第37頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一簡易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)試驗(yàn)（SEPSA）：該法以抗人IgG抗體致敏紅細(xì)胞為指示細(xì)胞，直接指示固相血小板抗原抗體免疫反應(yīng)，檢測血小板抗體。若血小板上存在抗體，則指示細(xì)胞呈擴(kuò)散分布，為陽性；若無抗體，則指示細(xì)胞聚集在底部，呈扣狀，為陰性。第38頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一特點(diǎn)該方法操作簡單，微量，重復(fù)性、特異性和敏感性均較理想，固相化的血小板及抗IgG指示細(xì)胞能長久保存?zhèn)溆?，可開展大量樣本的檢測工作。第39頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一基因分型方法1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)序列特異引物分型技術(shù)（PCR-SSP）的原理：設(shè)計(jì)特異性引物，利用引物3'端的特異性，直接擴(kuò)增相應(yīng)的HPA片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳以后，以紫外線透射來檢測，DNA條帶的存在或缺失即可確定基因型。第40頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一特點(diǎn)SSP-PCR操作比較簡單，耗時(shí)較少，適合小批量標(biāo)本，是目前HPA基因定型中最常用的一種技術(shù)。第41頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一2.實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)時(shí)定量PCR原理：在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間，利用連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強(qiáng)弱來即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。這一方法成功運(yùn)用于HPA-1、-2和-3基因定型。第42頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一特點(diǎn)它廣泛應(yīng)用于定量檢測mRAN表達(dá)水平，其特點(diǎn)是易操作、高通量、敏感性高和特異性強(qiáng)。第43頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一基因芯片技術(shù)（DNAmicroarray）基因芯片技術(shù)利用正向雜交的方法，制成針對HPA基因SNP位點(diǎn)的DNA芯片；用熒光標(biāo)記的HPA型特異性探針分別與芯片進(jìn)行雜交，用軟件分析樣品的雜交結(jié)果，從而確定樣品的HPA基因型。此技術(shù)特點(diǎn)是一次性可同時(shí)檢測大量樣品，快速，準(zhǔn)確。第44頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）原理是：限制性內(nèi)切酶能夠識別DNA序列上的特異性位點(diǎn)，并切割產(chǎn)生一定長度的DNA片段。相關(guān)基因片斷用含SNP區(qū)域的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用一種限制性酶進(jìn)行降解，酶解的PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，最后在紫外線下進(jìn)行DNA片斷的帶型分析。第45頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一該法特點(diǎn)是RFLP是利用限制性內(nèi)切酶酶解相應(yīng)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物，不需探針雜交，但被測的HPA基因需有合適的限制性酶切位點(diǎn)。第46頁，共53頁，2023年，2月20日，星期一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－等位基因（序列）特異性寡核苷酸雜交（PCR-ASO）：用PCR擴(kuò)增SNP的基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物